专利名称：用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学检测试剂，特别是一种用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒及其制备方法。
背景技术：
肝脏是人体最大的内脏器官，也是功能最复杂的器官之一，它担负着许多非常重要的生理功能，如各种物质代谢的中枢、分泌胆汁、合成蛋白和凝血因子、解毒等功能，对维持生命和内环境的稳定起重要的作用。目前，终末期肝病，如重型肝炎肝衰竭、肝硬化和肝癌等均危及生命，且死亡率极高，一直是世界医学界难以解决的问题。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过乙肝，其中3. 5亿人为慢性乙肝感染者，每年约有100万人死于乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化及原发性肝细胞癌。因此，重型肝炎肝衰竭早期预警和早期诊断需求尤为迫切。CXCLlO是1985年由Luster等首次发现报道的，是利用分子生物学技术从活化 U937细胞株的基因表达产物中筛选出来的，其相关蛋白被命名为CXCL10，又名IFN-γ诱导蛋白 10(IFN-γ-inducibl印rotein 10，IP-10)。人类 CXCLlO 基因定位于染色体 4q21，含有3个内含子和4个外显子，共98个氨基酸残基，相对分子质量约为10000。CXCLlO属于趋化因子CXC家族，氨基酸的同源性为20% -70%，其N末端含有4个保守的半胱氨酸(Cys) 残基，此区域为受体活化的重要区域。由于分子中第一个半胱氨酸前没有ELR(GlU-LeU-Arg 序列)构型而将CXCLlO归入非ELR-CXC趋化因子。CXCLlO主要由单核细胞、内皮细胞、肝实质细胞、树突状细胞(DC)、NK细胞、成纤维细胞等产生。CXCLlO在胸腺、脾和淋巴结的基质中呈现组成性低水平表达，对T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、DC、NK细胞、嗜碱性粒细胞等显示有较强的趋化和功能活化作用，促进适应性免疫反应的形成及炎症发生。此外，CXCLlO也可在血管生成、 造血作用、淋巴器官形成、伤口愈合及胚胎发育的调节中发挥作用。CXCLlO的特殊作用由其特异性受体CXCR3介导。该受体为CXCLlO的唯一受体，其基因定位于染色体Xpl3，cDNA全长1104bp，编码368个氨基酸，相对分子质量约为41kDa。 CXCR3是由7个跨膜亚单位组成的膜结合分子，属于G蛋白偶联受体超家族。CXCR3主要表达于活化的T细胞、NK细胞表面，其配体主要有CXCL10、IFN-Y诱导的单核因子(Mig， CXCL9)和 T 细胞 α 趋化因子(I-TAC，CXCLl 1)。CXCLlO与靶细胞上的相应受体CXCR3的胞外N端结合，介导受体蛋白胞内C端丝氨酸/苏氨酸磷酸化，通过一系列跨膜信号转导通路，使CXCR3阳性靶细胞向炎症病灶迁移、活化，在许多疾病的发生发展中发挥重要作用。C)(C趋化因子配体10(CXC chemokine ligand-10, CXCL10)是新近发现的一种重要的趋化因子，属于CXC类非ELR亚族。CXCLlO 主要介导Th型炎症反应，趋化T淋巴细胞和单核细胞，与炎症性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等有关。近年研究发现，CXCLlO在不同类型肝病中表达升高，并且与疾病的发生、发展、 治疗和预后等密切相关。但并未有报道解释CXCLlO与重型肝炎肝衰竭直接的关系。
发明内容
本发明根据上述领域的空白，提供一种用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒及其制备方法，本发明的试剂盒能够对重型肝炎及肝衰竭提供早期预警和诊断，为医生和患者提供充裕的时间采取合理的预防和治疗措施。用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，包括包被有抗CXCLlO单克隆抗体的酶标板。所述酶标板为化学发光酶标板，所述抗CXCLlO单克隆抗体的包被浓度为2ug/ml。所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记的羊抗人CXCLlO抗体、CXCLlO蛋白标准品、 样品稀释液、化学发光底物液和洗涤液。所述化学发光底物指化学发光底物液A 3. Ommol/L鲁米诺与0. 3mmol/L对碘苯酚的混合液，和化学发光底物液B :7. 5mrnol/L的双氧水。所述样品稀释液的配方为山羊血清100ml，(ff/ff)硫柳汞20ml，0. IM铁氰化钾 IOml 吐温-20 0. 5ml, 10mg/ml 庆大霉素 10ml，加 0. OlM PBS (PH7. 4)至 IOOOml 所述洗涤液的配方为=NaH2PO42H20 148mg, Na2HPO4 12H20 1. 45g，NaClll. 7g，吐温-20 1ml，加双蒸水至1000ml。上述试剂盒的制备方法，包括如下制作酶标板的步骤(1)用pH4. 6醋酸盐缓冲液稀释抗CXCLlO单克隆抗体至浓度为2ug/ml，(2)在空白的化学发光酶标板的反应孔内加入于CXCLlO单克隆抗体溶液，于4°C 静置12小时；(3)弃掉孔内液体，用洗涤液充分洗涤各孔随之拍干；(4)封闭酶标板，然后干燥。本发明根据本实验室的最新的研究发现，在重型肝炎肝衰竭患者血清中人趋化因子配体10含量会急剧升高，血清中CXCLlO量数值范围与重型肝炎肝衰竭症状的阶段呈正相关。因此选用人趋化因子配体10作为重型肝炎肝衰竭早期预警和早期诊断的检测标靶， 并提供了高灵敏度、性能稳定的人趋化因子配体10的发光化学酶联免疫检测试剂盒。本发明还提供了试剂盒的制备方法。通过对抗体包被浓度的优化获得了灵敏度，精确度都非常高的检测试剂盒，检测限最低达到0.让8/1^，变异系数范围在6.5% 13. 之间。
图1.不同类型肝炎患者血清中CXCL 10表达量统计及验证试验结果。纵坐标CXC 10含量，pg/ml ；横坐标，分别是重型肝炎(ZG)，肝硬化(GY)，慢性肝炎 (MG)，正常对照血清(D)。
具体实施例方式实施例1.不同类型肝炎患者血清中CXCL 10含量统计及验证试验。采用佑安医院提供的三批共230例血清样本，分别是重型肝炎(ZG) 106例，肝硬化 (GY) 36例，慢性肝炎(MG) 38例，正常对照血清(D) 39例。
应用美国GraphPad Prism 4软件对变量进行正态性检验，组间靶标表达值比较采用成组设计两样本比较的unpaired T-test以及秩和检验one way ANOVA with Tukey' s multiple comparison test,检验水准 α =0.05。根据检测结果，计算靶标在四种血液样本中表达量的平均值及标准误。表1靶标在受检血液标本表达平均值
权利要求
1.用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，包括包被有抗CXCLio单克隆抗体的酶标板。
2.根据权利要求1所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，所述酶标板为化学发光酶标板，所述抗CXCLlO单克隆抗体的包被浓度为2ug/ml。
3.根据权利要求2所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，所述试剂盒还包括辣根过氧化酶标记的羊抗人CXCLlO抗体、CXCLlO蛋白标准品、样品稀释液、化学发光底物液和洗涤液。
4.根据权利要求3所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，所述化学发光底物指化学发光底物液A 3. Ommol/L鲁米诺与0. 3mmol/L对碘苯酚的混合液，和化学发光底物液B 7. 5mrnol/L的双氧水。
5.根据权利要求3所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，所述样品稀释液的配方为山羊血清100ml, 1% (W/W)硫柳汞20ml, 0. IM铁氰化钾IOml吐温-20 0. 5ml, 10mg/ml 庆大霉素 10ml，加 0. OlM PBS (PH7. 4)至 IOOOml
6.根据权利要求3所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒，所述洗涤液的配方为=NaH2PO4 2H20 148mg, Na2HPO4 12H20 1. 45g, NaCl 11. 7g，吐温-20 1ml，加双蒸水至 1000ml。
7.权利要求1 6任一所述的用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒制备方法， 包括如下制作酶标板的步骤(1)用PH4.6醋酸盐缓冲液稀释抗CXCLlO单克隆抗体至浓度为2ug/ml，(2)在空白的化学发光酶标板的反应孔内加入于CXCLlO单克隆抗体溶液，于4°C静置 12小时；(3)弃掉孔内液体，用洗涤液充分洗涤各孔随之拍干；(4)封闭酶标板，然后干燥。
全文摘要
本发明“用于重型肝炎肝衰竭早期预警和诊断试剂盒及其制备方法”，属于医学检测试剂，包括包被有抗CXCL10单克隆抗体的酶标板。所述酶标板的制备步骤(1)用pH4.6醋酸盐缓冲液稀释抗CXCL10单克隆抗体至浓度为2ug/ml，(2)在空白的化学发光酶标板的反应孔内加入CXCL10单克隆抗体溶液，于4℃静置12小时；(3)弃掉孔内液体，用洗涤液充分洗涤各孔随之拍干；(4)封闭酶标板，然后干燥。具有灵敏度高，准确性，重复性好的优点，检测限最低达到0.1pg/mL，变异系数范围在6.5％～13.1％之间，能够对重型肝炎及肝衰竭提供早期预警和诊断，为医生和患者提供充裕的时间采取合理的预防和治疗措施。
文档编号G01N33/577GK102364341SQ20111017719
公开日2012年2月29日 申请日期2011年6月28日 优先权日2011年6月28日
发明者吴凡, 李全, 焦守恕 申请人:同昕生物技术(北京)有限公司