专利名称：一种幽门螺旋杆菌快速检测装置的制作方法
技术领域：
本发明是一种利用颜色颗粒免疫方法来检测幽门螺旋杆菌的试纸。
背景技术：
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori, Hp)是人类最常见的消化道致病菌之一，我国普通人群的感染率为50%—80%，并仍以每年1%_洲的速度增长。幽门螺旋杆菌感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系，而且与非溃疡性消化不良、MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原。目前公认的细菌培养、呼气试验(UBT)、组织染色等检测方法，虽具有高敏感与特异性，可作为Hp感染诊断标准，上述方法痛苦大、所需仪器昂贵、操作步骤繁琐费时、需要专业人员。幽门螺旋杆菌在微需氧环境下生长，培养条件要求高，不易存活，对细菌培养做临床诊断造成很大困难，不易推广。而呼气试验对患者和医务人员以及周围环境的污染尚未解决。利用免疫学方法对于幽门螺旋杆菌的检测有两种途径，一是检测抗体，二是检测抗原。检测抗体需要血清作为检测样品，检测抗原非创伤性方法则可以通过检测粪便抗原作为检测的手段。现已有很多文献对幽门螺旋杆菌粪便抗原进行报道，检测粪便抗原同样具有临床检测意义和价值，可作为临床诊断依据及治疗效果观察。ELISA法检测粪便抗原有较高特异性和敏感性被临床认可，但需专业人员和仪器，操作时间长，成本高，试剂盒需要冷藏，运输不便。中国专利01223042幽门螺旋杆菌抗原快速检测盒，而该专利说明书中第3页第10行所述是用多克隆Hp抗体作为固相捕获抗体和检测抗体，多克隆抗体通常具有交叉反应性，在特异性上表现较差。根据现有研究，细胞毒素相关蛋白(CagA)阳性Hp为毒力菌株，与萎缩性胃炎、 胃癌与消化道溃疡等常见的消化道疾病密切相关，90%以上的幽门螺旋杆菌临床分离菌株 CagA呈阳性表达。因此，本发明采用抗CagA的单克隆抗体，利用颜色颗粒免疫方法来实现对粪便抗原的检测，此方法特异性强，灵敏度高，成本低，操作简便，便于贮存及运输。
发明内容
本发明克服了现有技术中存在的缺点，提供了一种幽门螺旋杆菌快速检测装置， 采用抗CagA的单克隆抗体、用双抗夹心法原理制成，是利用Hp单克隆抗体作为固相捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体具有特异性强，灵敏度高，批间差小等特点。为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的
本发明包括幽门螺旋杆菌配对单抗的建立、包含该单抗的检测试纸及检测装置。建立幽门螺旋杆菌配对单抗，采用处理过的重组CagA接种于小鼠进行免疫，用 SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。提取小鼠腹水纯化筛选，最终筛选出两株具有较强特异性配对Hp单抗，记为Hp-I及Hp-2。配对单克隆抗体由胶体金标记后应用于检测试纸，胶体金是颜色颗粒中金属胶体颗粒的一种，本发明所涉及的方法及装置除采用胶体金颗粒标记抗体，也可采用其它同类颜色颗粒标记，即可以是一种金属胶体颗粒、一种标记颗粒，包括但不仅限于胶体银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒、染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒。利用胶体金免疫层析法制成检测试纸，通过以下方法实现检测试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫、样品吸液层、Max线组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层；样品吸液层由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层为一定规格无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用，上述装置除有毛细管作用原理外，还有虹吸作用原理，大大加快吸水移动速度。按公知技术将底板、吸水板、硝酸纤维素膜及单抗金标垫垫进行组装。检测试纸利用免疫双抗夹心法制成，将幽门螺旋杆菌配对单抗应用于检测试纸， Hp-I用于包被试验线，另一株Hp-2单克隆抗体用于胶体金标记。控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，当样品通过胶体金标记的幽门螺旋杆菌单克隆抗体移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，控制线便显色。可以将上述检测试纸样品吸液层端直接插入待测样品中检测(样品液不得超过试纸Max线)，还可以制成检测装置进行检测。检测板包括板身和板盖两部分，检测板由硬度适中的材料制成，板身正面有加样孔和结果显示窗，检测试纸置于板身和板盖之间，板身和板盖通过卡扣方式连接。当板身和板盖通过卡扣方式连接上时，样品吸液层被封闭在板盖之内，胶体金试纸的硝酸纤维素膜与板身的结果显示窗对应。采集粪便检测样品，用稀释液进行稀释，吸取样本滴入装置加样孔中，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至幽门螺旋杆菌单克隆抗体II金标垫时，样品中的幽门螺旋杆菌与幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有幽门螺旋杆菌单克隆抗体I试验线时，样品中的幽门螺旋杆菌又与试验线中的幽门螺旋杆菌单克隆抗体相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验线处显色为阳性；相反如果样品中没有幽门螺旋杆菌，幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标探针就不会与试验线上的幽门螺旋杆菌单克隆抗体I发生特异结合，没有胶体金滞留，即仅有一条控制线为阴性，这就是双抗夹心法原理。根据此原理，两条线为阳性，一条线为阴性得出判断。当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无待检幽门螺旋杆菌，标记的金标探针都会与已设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显色。因此控制线无色带产生则代表操作有误，检测时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。根据上述方案实现的幽门螺旋杆菌快速检测装置，具有快速、灵敏、准确、操作简便的优点，同时具有保存方便，有效期长的特点。
图1为本发明的外观图。图2为本发明的剖视图。
图3为试纸的外观图。图4为试纸的分解图。
图5为试纸的阴性结果图。图6为试纸的阳性结果图。1.板盖，2.板身，3.加样孔，4.结果显示窗，5.凹槽，6.检测试纸，7.底板，8.吸水板，9.硝酸纤维素膜，10.单克隆抗体金标垫，11.样品吸液层，12.试验线，13.控制线， 14. MAX 线。
具体实施例具体实施例1 幽门螺旋杆菌单克隆抗体的制备 UHP培养，准备扩增模板，设计引物
1)共设计2对引物扩增CagA的N端、C端
cagA-N-F :ACGTGGATCCGAATTC ATCGTTGATAAGAATGATAGG (136_156bp) cagA-N-R :ACGTGTCGACCTCGAGTAGGCTACCTTGAAGAGTGG (1472_1491bp) 扩增大小1356bp，编码452个氨基酸，分子量为50. 947kDa，命名为抗原C-N。cagA-C-F :ACGTGGATCCGAATTC ACCAACGCCTCCAAGAGTCCTG (1537_1558bp) cagA-C-R :ACGTGTCGACCTCGAGAGCGTAATTGTCCAATTTCGC (3115_3135bp)
扩增大小1599，编码533个氨基酸，分子量为58. 455kDa，命名为抗原C-C。2) PCR扩增引物各10 μ 1、HP菌液上清(模板)1μ Taq E 0. 5 μ 1、缓冲液 5 μ 1、重蒸水 23. 5 μ 1，94 °C5min，94 °C 30S、56 °C 30S、72 "C 120S (30 循环)。2、扩增产物的检测与回收用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，大小正确的片段用胶回收试剂盒回收。3、连接与转化分别将回收的编码蛋白C-N、C-C的DNA序列进行双酶切(BamH I/ XhoI, 37 0C 3h)，并将载体pET3h进行双酶切(BamH I/ XhoI, 37 °C 3h)，胶回收后，目的片段与载体连接。于16°C连接6小时，转化到五，涂LB平板(AMF)，37°C培养过夜。编码U蛋白的DNA序列用EcoR I/ XhoI双酶切，同载体ρΕΤ3^ι双酶切(EcoR I/ XhoI) 后连接。4、酶切或PCR鉴定分别挑6个克隆抽取质粒，进行酶切或PCR鉴定，阳性克隆送出测序。5、表达与纯化测序正确的克隆提取质粒转入表达菌种五cWi BL21 DE3，小样摸索表达温度、用IPTG诱导表达，并12% SDS-PAGE进行鉴定。表达成功后，用IL LB表达抗原，超声破碎菌体，确定表达部位，用M柱进行纯化。6、处理过的重组CagA接种于小鼠进行免疫，用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选， 取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。提取小鼠腹水纯化筛选，最终筛选出两株具有较强特异性配对Hp单抗，记为Hp-I及Hp-2。具体实施例2 胶体金的制备及金标抗幽门螺旋杆菌抗体II溶液的制备
胶体金溶液的制备配制氯化金溶液、2%柠檬酸三钠溶液，加热去离子水到80°C， 加入氯化金溶液30ml，进行加热搅拌，加入2%枸橼酸三钠18ml，观察由紫色到红色变化继续煮沸lOmin，冷却后转移到棕色瓶中4°C保存。
金标抗幽门螺旋杆菌抗体II溶液的制备称量金液250ml加0. 2MK2C03 2. 5ml搅拌5分钟，Hp-2加入250ml金液中搅拌，加入2. 5ml 1% PEG20000，离心、弃上清液，沉淀用 PH8. 1柠檬酸-Tris缓冲液稀释至50ml。把抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。具体实施例3 抗体标记硝酸纤维素膜的制备
使用特制制膜机制膜，硝酸纤维素膜试验线应用Hp-I制作，硝酸纤维素膜控制线由羊抗鼠多克隆抗体制成。具体实施例4 检测试纸及装置
图1详细表示了本发明的外观图，从图中可以看出本发明由检测板(1)和检测试纸(8) 两部分组成。(一)检测板
由图1可见，检测板包括板盖(1)和板身(2)两部分。板盖正面有加样孔(3)和结果显示窗(4)。板身(2)设有与试纸条对应的凹槽(5)。板盖(1)和板身(2)通过卡扣方式连接。(二)胶体金快速检测试纸
图4为试纸的分解图，由图可见胶体金试纸(6)固定于板身(2)内部，是由底板(7)、吸水板(8)、硝酸纤维素膜(9)、单克隆抗体金标垫(10)、样品吸液层(11)、MAX线(14)组成， 底板(7)中部为硝酸纤维素膜(9)，硝酸纤维素膜(9)上有一条试验线(12)和一条多克隆抗体控制线(13)，底板一端端头为吸水板(8)，另一端端头为样品吸液层(11)，硝酸纤维素膜
(9)两端分别与吸水板(8)和单克隆抗体金标垫(10)相互交叠连接，在单克隆抗体金标垫
(10)上压有样品吸液层(11)。使用方法采集粪便检测样品，用稀释液进行稀释，吸取样本滴入装置加样孔中， 由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动至幽门螺旋杆菌单克隆抗体II金标垫时，样品中的幽门螺旋杆菌与幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标探针发生特异结合，当移动至固定有幽门螺旋杆菌单克隆抗体I试验线时，样品中的幽门螺旋杆菌又与试验线中的幽门螺旋杆菌单克隆抗体相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验线处显色为阳性；相反如果样品中没有幽门螺旋杆菌，幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标探针就不会与试验线上的幽门螺旋杆菌单克隆抗体I发生特异结合，没有胶体金滞留，即仅有一条控制线为阴性。结果判断当粪便中有幽门螺旋杆菌抗原时，试纸的显色区有两条线显出，即试验线及控制线均变为红色，为阳性。当粪便中无幽门螺旋杆菌抗原时，试纸的显色区仅有一条控制线变为红色，为阴性。当试纸的显色区没有颜色显示，则表示操作不当或试纸过期，此结果无效。
权利要求
1.一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，包括幽门螺旋杆菌配对单抗的建立、包含该单抗的检测试纸及检测装置，其特征是采用处理过的重组CagA接种于小鼠进行免疫，用SP20 细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水，提取小鼠腹水纯化筛选，最终筛选出两株具有较强特异性幽门螺旋杆菌配对单抗，记为Hp-I及 Hp-2，将该配对单抗应用于检测试纸，进而制成针对幽门螺旋杆菌特异性强、灵敏度高的检测装置。
2.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于所述配对单克隆抗体由胶体金标记后应用于检测试纸，胶体金是颜色颗粒中金属胶体颗粒的一种。
3.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于本装置除采用胶体金颗粒标记抗体，也可采用其它同类颜色颗粒标记，即可以是一种金属胶体颗粒、一种标记颗粒，包括但不仅限于胶体银颗粒、铁颗粒、磁性颗粒、染料颗粒、乳胶颗粒、荧光颗粒。
4.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于所述检测试纸利用胶体金免疫层析法制成，通过以下方法实现检测试纸是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫、样品吸液层、Max线组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条多克隆抗体控制线，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在幽门螺旋杆菌单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层；样品吸液层由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、 第三层为一定规格无纺布层，上述物质均需经过表面活性剂缓冲液浸泡处理，干燥后备用。
5.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于检测试纸利用双抗夹心法制成，利用双抗夹心原理，将幽门螺旋杆菌配对单抗应用于检测试纸，Hp-I用于包被试验线，另一株抗体Hp-2用于胶体金标记。
6.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于所述的控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成，当样品移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，控制线便显示彩带。
7.根据权利要求1或5所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于利用双抗夹心法制成的检测试纸的试验线显示彩带，即显色区为两条线时为阳性；只有一控制线时为阴性。
8.根据权利要求1所述的一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，其特征在于所述的检测装置即检测板包括板身和板盖两部分，检测板由硬度适中的材料制成，板身正面有加样孔和结果显示窗，检测试纸置于板身和板盖之间，板身和板盖通过卡扣方式连接。
9.当板身和板盖通过卡扣方式连接上时，样品吸液层被封闭在板盖之内，胶体金试纸的硝酸纤维素膜与板身的结果显示窗对应。
全文摘要
一种幽门螺旋杆菌快速检测装置，包括幽门螺旋杆菌配对单抗的建立、包含该单抗的检测试纸及检测装置，采用重组过的幽门螺旋杆菌接种于小鼠进行免疫，用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水，提取小鼠腹水纯化筛选，最终筛选出两株具有较强特异性幽门螺旋杆菌配对单抗，记为Hp-1及Hp-2，将该配对单抗应用于检测试纸，进而制成针对幽门螺旋杆菌特异性强、灵敏度高的检测装置。
文档编号G01N33/577GK102393460SQ201110241109
公开日2012年3月28日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者不公告发明人 申请人:万积成