专利名称：在体内具有抗肿瘤活性的抗人trop-2 抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗肿瘤活性的抗人TR0P-2抗体、特别涉及在体内具有抗肿瘤活性的抗人TR0P-2抗体。此外，本发明涉及产生该抗体的杂交瘤、及该抗体的用途。
背景技术：
人TROP-2 (Tacstd2，GA733-1，EGP-1)(以下也记作 hTROP-2。)为已知在各种上皮细胞癌肿中过度表达的、由323氨基酸残基(参照序列号2)构成的I次跨膜型的I型细胞膜蛋白。以前即已明确，存在与人滋养层细胞(tiOphoblasts)和癌细胞所表现的免疫抵抗有关的细胞膜蛋白(非专利文献1)，已经鉴定出一种被抗人绒毛膜癌细胞株BeWo的细胞膜蛋白的小鼠单克隆抗体(162-25.3、162-46.2)识别的抗原分子，为在人滋养层细胞(trophoblasts)中表达的分子之一，被命名为Trop-2 (非专利文献2)。此后，相同分子被其它研究者发现，将被免疫胃癌细胞SW948而得的小鼠单克隆抗体GA733识别的称为肿瘤抗原GA733-1 (非专 利文献3)、将被非小细胞肺癌的细胞免疫而获得的小鼠单克隆抗体RS7-3G11识别的称为上皮糖蛋白(epithelial/carcinoma antigen, EGP-1)(非专利文献4)，1995年克隆了 Trop-2的基因，确认了它们为同一分子(非专利文献5)。此外，阐明了其在癌细胞中具有放大细胞内钙信号的作用(非专利文献6)，也被称为肿瘤相关钙信号传导蛋白(tumor-associated calcium signal transducer) 2, TACSTD2。hTR0P-2基因定位在染色体1ρ32上，与具有约50%同源性的GA733-2 (还作为TACSTD1、上皮糖蛋白EGP-2、EpCAM及Trop-1而已知)一起构成TACSTD基因家族(非专利文献7)。hTR0P-2蛋白(323氨基酸残基；序列号2)具有约36kD的分子量，包含亲水性的信号肽(第I 26位的氨基酸)、细胞外结构域(第27 274位的氨基酸)、细胞跨膜结构域(第275 297位的氨基酸)以及细胞内结构域(第298 323位的氨基酸)。细胞外结构域中存在4个非均质N结合糖基化位点，添加糖链后，表观分子量增加11 13KD (非专利文献5)。TACSTD基因家族中，细胞外结构域具有特征性的甲状腺球蛋白(TY)重复序列，通常认为其与癌细胞的增殖、浸润、转移有关。截至目前，尚未鉴定出hTR0P-2的生理学上的配体，分子功能尚未阐明，但已经公开了其在肿瘤细胞中传递钙信号(非专利文献6)，此外，由于细胞内丝氨酸303号残基通过属于Ca2+依赖性蛋白激酶的蛋白激酶C而磷酸化(非专利文献4)以及细胞内结构域具有PIP2结合序列，表明其具有肿瘤细胞中的信号传递功能(非专利文献8)。通过免疫组化(IHC)及流式细胞术研究等体外诊断研究，已经报道了 hTR0P-2在胃癌、肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰癌、肝癌、食道癌等多种上皮源癌肿中过度表达。与此相对，显示出正常组织中的表达则仅限于上皮区域的细胞，表达水平也比癌肿中低，表明TR0P-2与肿瘤形成有关(专利文献I 3和9)。此外，在作为临床检体的生物学标志的hTR0P-2表达水平解析中，显示其与大肠癌(非专利文献10及11)、胰脏癌(非专利文献12)、口腔癌(非专利文献13)的恶性度有关，在hTR0P-2高表达时，癌的转移、复发频率显著高。此外，在使用cDNA微阵列技术的大规模基因表达分析中，已经鉴定出，其为与正常的卵巢上皮相比在卵巢的重度乳头状癌中最为高度过度表达的基因组之一(非专利文献14)。进而，近年通过使用大肠癌细胞的模型证明了 hTR0P-2在肿瘤形成中的重要作用(非专利文献15)。hTR0P-2的表达促进肿瘤细胞的锚着非依赖性细胞增殖，是移植到免疫缺陷小鼠皮下的癌细胞的肿瘤形成及增殖所必需的，表明其可能是功能性肿瘤抗原，可能成为新的治疗祀标。截至目前，已经报告了几种抗hTR0P-2抗体的抗肿瘤效果的研究结果。就RS7抗体(专利文献I)而言，使用经放射标记的抗体在体内模型中进行了试验，在裸小鼠异种移植模型中显示出抗肿瘤活性，但没有报告仅抗体(裸抗体)时的抗肿瘤效果。此外，报告了与细胞毒素结合的抗hTR0P-2单克隆抗体BRllO (专利文献2)对于人癌细胞株H3619、H2987、MCF-7、H3396及H2981的体外实验中的细胞毒性，但体内数据方面，对于裸抗体或免疫复合BRllO的体内数据则均未公开。近年还报道了:由通过用人卵巢癌组织免疫小鼠而得的杂交瘤细胞株AR47A6.4.2或AR52A301.5产生的分离单克隆抗体与hTR0P-2结合，初次以裸抗体形式显示体外的细胞毒性，并且在裸小鼠异种移植模型中显示抗肿瘤活性(专利文献3和4)。但是，这些文献中，在移植了胰脏癌细胞株BxPC-3及PL45、前列腺癌细胞PC-3、乳腺癌细胞MCF-7以及大肠癌细胞Colo205的小鼠异种移植模型中，虽然仅抗体时显示出抗肿瘤效果，但是除了在BxPC-3细胞移植中显示出治疗效果以外，均止步于通过抗体的预防性投与而部分地(约40 60%)抑制肿瘤形成及增殖，此外，所需抗体量也为20mg/kg左右，为非常高的用量。由以上的现有技术，虽然已经明确抗hTR0P-2抗体可能作为抗肿瘤抗体，但同时所有的抗hTR0P-2抗体均并非是以裸抗体形式以抗体单独在体内显示出抗肿瘤效果，表明对hTR0P-2的作用根据抗体的结合位点、亲和性、单克隆抗体谱而不同。专利文献1:美国专利第6653104号专利文献2:美国专利第5840854号专利文献3:美国专利第7420040号专利文献4:美国专利第7420041号非专利文献1:Faulk WP, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 75 (4)，p.1947-1951 (1978)非专利文献2:Lipinski M, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 78 (8)，p.5147-5150 (1981)非专利文献3:Linnenbach AJ, et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U S A, 86 (1)，p.27-31 (1989)非专利文献4:Basu A, et al., Int.J.Cancer, 62 (4)，p.472-479 (1995)非专利文献5:Fornaro M, et al., Int.J.Cancer,62 (5), p.610-618 (1995)非专利文献6:Ripani E，et al., Int.J.Cancer, 76 (5)，p.671-676 (1998)非专利文献7:Calabrese G，et al.，Cell Genet.,92 (1-2), p.164-165 (2001)非专利文献8:E1 Sewedy Tet al., Int.J.Cancer, 75 (2)，p.324-330 (1998)非专利文献9:Cubas R, et al.，Biochim.Biophys.Acta., 1796 (2), p.309-314(2009)非专利文献10:0hmachi Tet al.，Clin.Cancer Res.，12 (10)，p.3057-3063(2006)非专利文献11:Fang YJ, et al.，Int.J.Colorectal Dis.,24 (8)，p.875-884(2009)非专利文献12:Fong D, et al.，Br.J.Cancer,99 (8)，p.1290-1295 (2008)非专利文献13:Fong D，et al., Mod.Pathol.，21 (2)，p.186-191 (2008)非专利文献14:Santin AD, et al., Int.J.Cancer, 112 (I), p.14-25 (2004)非专利文献15:ffang J, et al.，Mol.Cancer Ther.，7 (2)，p.280-285 (2008)
发明内容
在这样的状况下，期望开发在体内具有高抗肿瘤活性的抗人hTR0P-2抗体(抗人hTR0P-2单克隆抗体)，特别是以裸抗体形式在仅抗体时即具有在体内的抗肿瘤效果且以低用量具有该效果的抗人hTR0P-2抗体等。本发明是考虑了上述状况而作出的，提供以下所示的抗人hTR0P-2抗体(抗人hTR0P-2单克隆抗体)、产生该抗体的杂交瘤、该抗体的片段、该抗体等与药剂的复合物(i mmunoconj ugate)、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒等。(I)在体内具有抗肿瘤活性的抗人TR0P-2的抗体。
作为上述(I)的抗体，可以列举出例如以5 20mg/kg体重的投与量显示50%以上的肿瘤生长抑制活性的抗体、用于显示前述肿瘤生长抑制活性的投与次数至多为每周I次的抗体、以10mg/kg体重的单次投与显示50%以上的肿瘤生长抑制活性的抗体、对2种以上人肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性的抗体、解离常数(Kd值)为Ι.ΟΧΙΟ,Μ以下的抗体等。这里，作为肿瘤可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌；此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。此外，作为肿瘤细胞株，可以列举出例如选自人胰癌细胞株ΡΚ-59、人胰癌细胞株BxPC-3、人胰癌细胞株KP-3L、人胰癌细胞株KP-2、人胰癌细胞株PK-1、人胰癌细胞株PK-45H、人胰癌细胞株PK-45P、人胰癌细胞株TCC-PAN2、人胰癌细胞株SUIT-2、人大肠癌细胞株CAC0-2、人大肠癌细胞株SW480、人大肠癌细胞株DLD-1、人大肠癌细胞株HCTl 16、人乳腺癌细胞株JIMT-1、人乳腺癌细胞株HCC1143、人乳腺癌细胞株MCF-7、人前列腺癌细胞株DU145及人前列腺癌细胞株PC-3组成的组中的至少2种，特别是人胰癌细胞株PK-59及人胰癌细胞株BxPC-3。作为上述(I)的抗体，可以列举出例如:抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号36 38所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号41 43所示的氨基酸序列的抗体；抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号46 48所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号51 53所示的氨基酸序列的抗体；抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号56 58所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号61 63所示的氨基酸序列的抗体；及抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号66 68所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号71 73所示的氨基酸序列的抗体等。作为上述(I)的抗体，可以列举出例如单克隆抗体。作为上述(I)的抗体，可以列举出例如基因重组抗体，具体而言，可以列举出嵌合抗体、人源化抗体或人抗体(human antibody)。这里，作为上述嵌合抗体，可以列举出:例如H链V区域的氨基酸序列包含序列号35所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号40所示的氨基酸序列的抗体；H链V区域的氨基酸序列包含序列号45所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号50所示的氨基酸序列的抗体；H链V区域的氨基酸序列包含序列号55所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号60所示的氨基酸序列的抗体；及H链V区域的氨基酸序列包含序列号65所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号70所示的氨基酸序列的抗体等。(2)由保藏号为 FERM BP-11251,FERM BP-11252,FERM BP-11253,FERM BP-11346或FERM BP-11254的杂交瘤产生的、抗人TR0P-2的单克隆抗体。作为上述(I )和(2)的抗体，可以列举出例如:与由保藏号为FERM BP-1125UFERMBP-11252.FERM BP_11253、FERM BP-11346 或FERM BP-11254 的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合的位点结合的抗体，及与包含选自下列区域组成的组中的至少I种(例如任意I种)区域的部分结合的抗体，所述区域为:包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的人TR0P-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的区域。(3)来源于上述(I)或(2)的抗体的抗体片段。作为上述(3)的抗体片段，可以列举出例如:包含序列号36 38所示的氨基酸序列、和/或序列号41 43所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列号35所示的氨基酸序列、和/或序列号40所示的氨基酸序列的片段；包含序列号46 48所示的氨基酸序列、和/或序列号51 53所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列号45所示的氨基酸序列、和/或序列号50所示的氨基酸序列的片段；包含序列号56 58所示的氨基酸序列、和/或序列号61 63所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列号55所示的氨基酸序列、和/或序列号60所示的氨基酸序列的片段；及包含序列号66 68所示的氨基酸序列、和/或序列号71 73所示的氨基酸序列的片段，例如包含序列号65所示的氨基酸序列、和/或序列号70所示的氨基酸序列的片段等。(4)产生上述(I)或(2)的抗体的杂交瘤。(5)保藏号为 FERM BP-1125UFERM BP_11252、FERM BP-11253,FERM BP-11346 或FERM BP-11254的产生抗人TR0P-2的单克隆抗体的杂交瘤。(6 ) 一种抗体一药剂复合 物，其包含上述(I)或(2 )的抗体以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。(7)—种抗体片段一药剂复合物，其包含上述(3)的抗体片段以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。在上述(6)和(7)的复合物中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌，此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。(8 ) 一种药物组合物，其含有选自上述(I)和(2 )的抗体、上述(3 )的抗体片段、以及上述(6)和(7)的复合物组成的组中的至少I种。作为上述(8)的组合物，可以列举出例如用于肿瘤的治疗的组合物，特别是没有体重减少的副作用的组合物，此外，还可以列举出用于肿瘤的诊断的组合物。这里，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌，此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。(9 ) 一种肿瘤治疗剂，其包含选自上述(I)和(2 )的抗体、上述(3 )的抗体片段、以及上述(6)和(7)的复合物组成的组中的至少I种。作为上述(9)的治疗剂,可以列举出例如没有体重减少的副作用的治疗剂。(10) —种肿瘤诊断剂，其包含选自上述(I)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(6)和(7)的复合物组成的组中的至少I种。在上述(9)的治疗剂及上述(10)的诊断剂中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌，此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。(11) 一种肿瘤检测方法，其特征在于，使选自上述(I)和(2 )的抗体、上述(3 )的抗体片段、以及上述(6)和(7)的复合物组成的组中的至少I种与由生物体采集的试样反应，并检测发生反应的抗体和/或抗体片段的信号。在上述(11)的方法中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌，此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。(12) —种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其包含选自上述(I)和(2)的抗体、上述(3)的抗体片段、以及上述(6)和(7)的复合物组成的组中的至少I种。在上述(12)的试剂盒中，作为肿瘤，可以列举出例如选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种，特别是人胰癌，此外，作为肿瘤，还可以列举出复发癌及转移癌。
图1为表示抗hTR0P-2单克隆抗体(K5-70)的抗原亲和性(Kd:解离常数)测定的图。Abt:抗体(总计)，Agf:抗原(游离)图2为表示产生抗hTR0P-2单克隆抗体的杂交瘤培养上清的、与HuH_7细胞(TR0P-2阴性)和HuH-7-hTR0P-2细胞的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示HuH_7细胞，黑色线的柱状图表示HuH-7-hTR0P-2细胞。图3是表示抗hTR0P-2单克隆抗体的、与在细胞表面表达内源性hTR0P_2的人胰脏癌细胞株(PK-59细胞)的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG),黑色线的柱状图表示与各抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图4是表示抗hTR0P-2单克隆抗体的、在细胞表面表达内源性hTR0P-2的人胰脏癌细胞株(BxPC-3细胞)的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG)、黑色线的柱状图表示与各抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图5是表示抗hTR0P-2单克隆抗体(K5-70)与人胰脏癌细胞株的反应性的图。涂成黑色的柱状图表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG)、黑色线的柱状图表示与抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图6是表示抗hTR0P-2单克隆抗体(K5-70)与人大肠癌细胞株(Colo320，CAC02，SW480, DLDI, Cff2, HCT116)，人乳腺癌(JMT-1，HCCl 143)，人前列腺癌细胞株(PC-3，DU145)的反应性的图。涂成黑色的柱表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG)，黑色线的柱状图表示与抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图7是调查抗hTR0P-2单克隆抗体与小鼠TR0P-2的交叉反应性的图。细胞使用的是在CHO-Kl细胞中瞬时表达小鼠TR0P-2基因的细胞，作为阳性对照抗体，使用的是与小鼠TR0P-2显示交叉性的T2-102抗体(小鼠IgGl )。涂成黑色的柱表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG)，黑色线的柱状图表示与各抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图8是调查抗hTR0P-2单克隆抗体与人EpCAM/TR0P_l的交叉反应性的图。细胞使用的是在CHO-Kl细胞中瞬时表达人EpCAM/TROP-Ι基因的细胞，作为阳性对照抗体，使用的是PE标记抗人EpCAM单克隆抗体(Becton, Dickinson and Company)。涂成黑色的柱表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG),黑色线的柱状图表示与各抗hTR0P-2单克隆抗体反应。图9是表示抗hTR0P-2抗体(T6-16，T5-86，K5-70，K5-107)的人胰脏癌细胞株(PK-59细胞)的细胞增殖抑制活性的图。mlgG表示对照抗体(小鼠IgG)，YYOl:市售的抗hTROP-2 抗体(Santacruz。白色柱:0 μ g/mL,灰色柱:0.I μ g/mL,黑色柱:lyg/mL。以相对于不添加抗体(O μ g/mL)的值的比例来表示。误差棒表示标准偏差。*P〈0.05,**P〈0.01(利用学生t检验)图10为表示抗hTROP-2抗体(T6-16，K5-70)的人胰脏癌细胞株(PK-59细胞)的划痕检测的图。A.表示PK-59细胞的划痕区域的照片的代表例。O天:表示刚划痕后的代表例。mlgG (I天):划痕后在培养基中添加对照抗体(小鼠IgG、ly g/mL)的I天后(24小时后)的照片。K5-70 (I天):表示划痕后在培养基中添加K5-70抗体(I μ g/mL)的I天后(24小时后)的照片。T6-16 (I天):表示划痕后在培养基中添加T6-16抗体(I μ g/mL)的I天后(24小时后)的照片。照片中所示箭头表示划痕区域的宽度。B.通过图像解析软件 (Scion Image)解析划痕区域的面积，以该值为基础并将对照mlgG添加组O天设为基准值I而算出其它样品各种值。*Ρ〈0.05，#P〈0.01 (利用学生 t 检验)图11为人胰脏癌细胞株PK-59细胞的干细胞标志的FACS的图。A:为表示PK-59细胞的EpCAM表达的FACS的图。涂成黑色的柱表示仅二抗(PE标记抗小鼠IgG)，黑色线表不与抗人EpCAM抗体(Becton, Dickinson and Company)反应时的柱状图。13、0:表不？1(-59细胞的P-glycoprotein/MCRl (B)或ABCG2 (C)的表达的FACS的图。蓝色的柱状图表示仅二抗，红色的柱状图表示与抗人P-糖蛋白/MDRl抗体(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN)(B)、抗人ABCG2抗体(BD BIOSCIENCES PHARMINGEN) (C)反应的情况。D:为使用作为胰脏癌干细胞标志的FITC标记抗人⑶24抗体(BD Pharmingen)和PE标记抗人⑶44抗体(BDPharmingen)对PK-59细胞进行二重染色的FACS图。D图中的数字表示各组分的细胞的存在比率。图12为在使用PK-59细胞的异种移植治疗模型中对新的抗hTR0P-2单克隆抗体克隆K5-70 (小鼠IgG2a)的抗肿瘤活性进行评价的图。A:表示对照组(小鼠IgG)和K5-70投与组的肿瘤经时生长(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05，**P〈0.01 (利用学生t检验)B:是在A的试验中对第21天(21天)(实验最后一天)时各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。各曲线上所示的数值为平均值土标准偏差。**P〈0.01 (利用学生t检验)图13是在使用了 PK-59细胞的异种移植治疗模型中对A.克隆K5-107，B.克隆T6-16，C.克隆K5-116-2-1的抗肿瘤活性进行评价的图。 表示对照组(小鼠IgG)，〇表示抗hTR0P-2抗体投与组。图中的箭头表示抗体投与期间，各曲线上所示的数值为平均值土标准偏差。*Ρ〈0.05 (利用学生t检验)图14为在使用PK- 59细胞的异种移植预防模型中对A.克隆K5_70、B.克隆T6-16及C.克隆K5-116-2-1的抗肿瘤活性进行评价的图。 表示对照组(小鼠IgG)，〇表示抗hTR0P-2抗体投与组。图中的箭头表示抗体投与期间，各曲线上所示的数值为平均值土标准偏差。**Ρ〈0.01 (利用学生t检验)图15为在使用BxPC-3细胞的异种移植预防及治疗模型中对克隆K5-70的抗肿瘤活性进行评价的图。A:表示在预防模型中对照组(小鼠IgG)和K5-70投与组的肿瘤经时生长(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。**P〈0.01 (利用学生t检验)B:表示在治疗模型中对照组(小鼠IgG)和K5-70投与组的肿瘤经时生长(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05 (利用学生t检验)图16为表示在使用PK-59细胞的异种移植预防模型中克隆K5-70的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。肿瘤体积以平均值土标准偏差来表示。A:表示对照组(小鼠IgG)和各用量时的K5-70投与组的肿瘤经时生长(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05 (利用学生t检验)，**P〈0.01 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第17天(17天)(实验最后一天)时各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。各曲线上所示的数值为平均值土标准偏差。**P〈0.01 (利用学生t检验)图17为实验中使用的人/小鼠嵌合TR0P-2蛋白的示意图。SP:信号序列，TY结构域:1型甲状腺球蛋白区域(thyroglobulin type I region),TM:跨膜区域,C:细胞内区域。涂满黑色的的区域为来自于hTROP-2的多肽。以白色空心表示的区域为来自于小鼠TR0P-2的多肽。嵌合蛋白的示意图的上段所示的数字表示小鼠TR0P-2蛋白的氨基酸号，下段表不hTROP-2蛋白的氨基酸号。图18为使用人/小鼠嵌合TR0P-2的抗hTROP-2单克隆抗体结合区域的鉴定结果图。使用恒定表达人/小鼠嵌合TR0P2-C(hmTR0P2-C)及小鼠/人嵌合TR0P2-D(mhTR0P2_D)蛋白的HEK293细胞，研究与图中所示的抗hTROP-2单克隆抗体的反应性。阴性对照使用的是小鼠IgG2b。图19是表示抗hTROP-2单克隆抗体的抗体结合区域的鉴定结果的图。 使用将hTROP-2基因及各人/小鼠嵌合TR0P-2基因导入HEK293细胞并使其瞬时表达的细胞进行FACS解析。对于(A)K5-70、K5-107、T5-86、K5-116-2-1抗体，研究与hTROP-2 (上段)、hmTR0P-2-A (中段)及hmTROP-2-B (下段)的反应性。使用小鼠IgG2b作为阴性对照。对于(B) T6-4、T6-16抗体，研究与hTROP-2 (上段)、mhTROP-2-E (中段)及mhTROP-2-F (下段)的反应性。使用小鼠IgG2b作为阴性对照。图20是表示人正常组织中的hTROP-2的表达的图。使用抗hTROP-2单克隆抗体克隆K5-63-17进行人正常组织阵列的免疫染色。(A)皮肤、(B)食道、(C)肾脏(皮质)、(D)肾脏(髓质)、(E)胰脏、(F)前列腺、(G)膀胱、(H)扁桃腺、(I)心脏、(J)肝脏(倍率:X200)图21是表示癌组织中的hTROP-2的表达的图。使用抗hTROP-2单克隆抗体克隆K5-63-17进行人癌组织阵列的免疫染色。(A)乳腺癌、(B)肺癌、(C)食道癌、(D)胃癌、(E)胰脏癌、(F)大肠癌、(G)膀胱癌、(H)前列腺癌、(I)卵巢癌(倍率:X 100)图22为表示在使用PK-59细胞的异种移植预防模型中单次投与克隆K5-70的抗肿瘤活性的图。A.表示对照组(小鼠IgG.)和K5-70投与组(〇)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表不投与抗体。*P〈0.05 (利用学生t检验)，**P〈0.01 (利用学生t检验)。B.为在A的试验中对第28天(28天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。#P〈0.01 (利用学生t检验)。C.表示对照组(小鼠IgG.)和K5-70投与组(〇)的各个体的肿瘤经时形成。箭头表示投与抗体。图23为表示克隆K5-70在使用人大肠癌细胞SW480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。A:表示对照组(.小鼠IgG)和K5-70投与组(〇)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。**P〈0.01 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第44天(44天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。#Ρ〈0.01 (利用学生t检验)图24是表示克隆K5-116-2-1在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。A:表示对照组(.小鼠IgG)和T6-16投与组(〇)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。**P〈0.01 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。#Ρ〈0.01 (利用学生t检验)
图25为表示克隆T6-16在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。A:表示对照组(.小鼠IgG)和T6-16投与组(〇)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。*Ρ〈0.05 (利用学生t检验)图26为表示克隆K5-70在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。A:表不对照组(.小鼠 IgG)和 K5-70 投与组(〇:lmg/kg, Δ:5mg/kg, □:10mg/kg)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第42天(42天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。*Ρ〈0.05 (利用学生t检验)图27为表示克隆K5-70在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。A:为表示每周I次的投与间隔时的K5-70抗体的抗肿瘤活性的图。表示对照组(.小鼠IgG)和K5-70投与组(〇:10mg/kg)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头(10，17，24，31，38天)表示K5-70抗体的投与。*Ρ〈0.05利用学生t检验。B:为表示以每10天I次(■:ql0d)、或每2周I次(籲:ql4d)的投与间隔投与K5-70抗体时的肿瘤经时形成的图。菱形( )表示对照组(小鼠IgG、10mg/kg)(平均值土标准偏差)。涂成黑色 的箭头29天)和空心的箭头(V;9，23，37天)表示投与K5-70抗体。*Ρ〈0.05，**P〈0.01利用学生t检验。图28为表示克隆T6-16在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的用量依赖性的抗肿瘤活性的图。A:表不对照组(.小鼠 IgG)和 T6-16 投与组(〇:lmg/kg, Δ:5mg/kg, □:10mg/kg)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。**P〈0.01 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第43天(43天)(实验最后一天)时的各小鼠中的肿瘤重量作图而得的图。#Ρ〈0.01 (利用学生t检验)图29为表示克隆T6-16在使用SW480细胞的异种移植治疗模型中的抗肿瘤活性的图。表不对照组(.:小鼠 IgG10mg/kg)、T6_16 (10mg/kg)投与组(O:q7d, Δ:ql0d)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头(10，17，24，31，38天)、及箭头(10，20，30，40天)表示投与T6-16抗体。对照组每3天进行I次投与。*P〈0.05，**P〈0.01利用学生t检验。图30为表示克隆K5-70在使用人前列腺癌细胞DU-145细胞的异种移植预防模型中的抗肿瘤活性的图。A:表示对照组(.小鼠IgG)和K5-70投与组(〇)的肿瘤经时形成(平均值土标准偏差)。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05 (利用学生t检验)B:为在A的试验中对第40天(40天)(实验最后一天)时的各小鼠的肿瘤重量作图而得的图。*Ρ〈0.05 (利用学生t检验)
图31为表示克隆K5-70在使用PK-59细胞的肝转移模型的转移抑制活性的图。A:表示细胞移植6周后对照组(小鼠IgG)摘出的肝脏图，B:表示细胞移植6周后K5-70投与组摘出的肝脏图。箭头表示肝转移灶。图32为表示K5-70在使用SW480细胞的异种移植模型中、在盐酸伊立替康投与后癌复发模型中的抗肿瘤活性的图。为表示无处置组( )、和盐酸伊立替康(40mg/kg)投与后K5-70 (O:10mg/kg)、小鼠IgG投与组(.:10mg/kg)的肿瘤经时形成的图(平均值土标准偏差)。箭头(11，14，17天)表示投与盐酸伊立替康。K5-70抗体或小鼠IgG从20天开始每3天进行I次投与。箭头表示抗体投与期间。*P〈0.05，**P〈0.01利用学生t检验。图33为表示克隆K5-70H链可变区域(VH)的cDNA碱基序列(序列号34)和推定氨基酸序列(序列号35)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；IYWIN，NIYPSDSYTNYNQKFKD，TSMADY)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-70VH的⑶Rl 3的氨基酸序列依次如序列号36 38所示。图34为表示克隆K5-70L链可变区域(VL)的cDNA碱基序列(序列号39)和推定氨基酸序列(序列号40)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；RASQSIGTSIH，YASESIS, QQSNSWPFT)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-70VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号41 43所示。图35为表示克隆K5-107H链可变区域(VH)的cDNA碱基序列(序列号44)和推定氨基酸序列(序列号45)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；SYWMH，NIYPGGGYTNYDEKFKS, SSVFDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-107VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号46 48所示。图36为表示克隆K5-107L链可变区域(VL)的cDNA碱基序列(序列号49)和推定氨基酸序列(序列号50)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；RASQNIGTSIH，YASESIS，QQSNSWPFT)按照Kabat等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationN0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-107VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号510 53所不。图37为表示克隆K5-116-2-1H链可变区域(VH)的cDNA碱基序列(序列号54)和推定氨基酸序列(序列号55)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的谷氨酰胺(Q)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。⑶R序列(下划线；SYWIT，NIYPSDSYTNYNQKFRD, LFDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-116-2-1VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号56 58所不。
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图38为表示克隆K5-116-2-1L链可变区域(VL)的cDNA碱基序列(序列号59)和推定氨基酸序列(序列号60)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；RASQSIGTSIH，YASESIS，QQSNSWPFT)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆K5-116-2-1VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号61 63所不。图39为表示克隆T6-16H链可变区域(VH)的cDNA碱基序列(序列号64)和推定氨基酸序列(序列号65)的图。信号肽用斜体表不。画有双下划线的谷氨酰胺酸(E)表不成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；DYNMH，HYPYNGGTGYNQRFKS，EDYGSSPSYAMDY)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆T6-16VH的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号66 68所不。图40为表示克隆T6-16L链可变区域(VL)的cDNA碱基序列(序列号69)和推定氨基酸序列(序列号70)的图。信号肽用斜体表示。画有双下划线的天冬氨酸(D)表示成熟肽的N末端氨基酸残基。CDR序列(下划线；RSSQSLVHGNGNTYLH，KVSNRFS, SQTTHVPT)按照 Kabat 等(Sequences of Proteins of Immunological Interests,Fifth edition,NIHPublication N0.91-3242, U.S.Department of Health and Human Services, 1991)的定义来确定。克隆T6-16VL的⑶Rl 3的氨基酸序列分别如序列号71 73所示。
具体实施方式
以下详细说明本发明。本发明的范围不受这些说明限制，除了以下例示以外，也可以在不损害本发明主旨的范围内适当变更实施。予以说明，本说明书包括作为本申请优先权基础的日本特愿2010-113302号说明书(2010年5月17日提出申请)的全体。此外，本说明书所引用的全部的出版物如现有技术文献及公开公报、专利公报以及其他专利文献均作为参照而引入本说明书中。1.本发明的概要如前所述，人TROP-2 (hTR0P-2)是由全长323氨基酸残基构成的I次跨膜型的I型膜蛋白。并且已知hTR0P-2基因及其基因产物在各种癌细胞中表达。如前所述，希望开发出在体内具有高抗肿瘤活性的抗人hTR0P-2抗体(抗人hTR0P-2单克隆抗体)等的状况下，本发明人从极其众多的克隆中进行筛选，从而成功地获得了在体内具有高抗肿瘤活性的克隆。具体而言，本发明提供在体内特异性识别hTR0P-2的细胞外区域的单克隆抗体，特别是提供显示皮摩尔级别(PM)的高亲和性的单克隆抗体。与现有的抗hTR0P-2抗体相比，本发明的抗体为:以仅裸抗体投与时，在更少的用量(例如1/20投与量)下具有显著的肿瘤生长抑制活性，且在使用多种人癌细胞的荷瘤小鼠治疗模型中显示显著的肿瘤生长抑制活性的抗hTR0P-2单克隆抗体，从这方面来看是极其有用的。2.抗hTR0P-2抗体的制作(I)抗原的制备hTR0P-2的氨基酸序列(序列号2)信息在例如NCBI (GenBank)网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)中以“登录号:NP_002344”公布。予以说明，编码hTROP-2的氨基酸序列的碱基序列(序列号I)的信息在该网站中以“登录号:NM002353”公布。作为抗原，可以使用包含hTROP-2的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的多肽或肽(也简称为肽)，可以优选使用包含hTROP-2的细胞外区域的氨基酸序列的至少一部分(全部或一部分)的肽。hTROP-2的细胞外区域(包括信号肽)是指包含序列号2所示的氨基酸序列中的第I位 第274位的氨基酸的区域(信号肽:第I位 第26位的氨基酸)。这里，对用作抗原的肽而言，上述“氨基酸序列的至少一部分”的长度没有特别限定，优选例如包含序列号2所示的氨基酸序列中的第I位 第145位的氨基酸的区域、包含该氨基酸序列中的第146位 第274位的氨基酸的区域等。作为抗原的肽的制作方法可以是化学合成，也可以通过采用大肠杆菌等的基因工程法合成，可以使用本领域技术人员公知的方法。进行肽的化学合成时，可以通过肽合成的公知方法进行合成。此外，其合成也可以使用固相合成法和液相合成法中的任意一种。还可以使用市售的肽合成装置(例如，岛津制作所制:PSSM-8等)。在用基因工程学方式合成肽时，首先设计并合成编码该肽的DNA。该设计和合成例如可以使用以包含全长hTROP-2基因的载体等作为模板，使用设计为可以合成所希望的DNA区域的引物，通过PCR法进行。然后，通过将上述DNA连接到适当的载体上而获得蛋白质表达用重组载体，将该重组载体导入宿主中并使得目的基因可以表达，由此获得转化子(Sambrook J.et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,3rd edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001)。使用可以在宿主微生物中自我增殖的噬菌体或质粒作为载体。而且还可以使用动物病毒、昆虫病毒载体。重组载体的制作可如下进行，即用适当的限制性酶切断纯化的DNA，插入适当的载体DNA的限制性酶位点等中而与载体连接。作为转化时使用的宿主，只要是可以表达目的基因的宿主即可，没有特别的限定。例如，可以列举细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母、动物细胞(C0S细胞、CHO细胞等)、昆虫细胞或昆虫。还可以使用山羊等哺乳动物作为宿主。向宿主导入重组载体的方法是公知的。然后，培养前述转化子，从其培养物中收集作为抗原使用的肽。“培养物”是指(a)培养上清、(b)培养细胞或者培养菌体或其破碎物中的任意一种。培养后，目的肽在菌体内或细胞内产生时，通过破碎菌体或细胞来提取肽。而且，目的肽在菌体外或细胞外产生时，直接使用培养液或通过离心分离等除去菌体或细胞。然后，可以通过单独使用可以在肽的分离纯化中使用的一般的生物化学方法，例如硫酸铵沉淀、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析等或将这些方法组合使用，来分离纯化目的肽。本发明中，还可以使用无细胞蛋白质合成系统，通过体外翻译获得作为抗原的肽。此时，可以使用以RNA作为模板的方法和以DNA作为模板的方法(转录/翻译)这2种方法。作为无细胞蛋白质合成系统，可以使用市售的系统，例如Expressway 系统(Invitrogen公司)、PURESYSTEM (注册商标；post genome研究所)、TNT系统(注册商标；Promega公司)等。如上所述获得的肽还可以结合到适当的载体蛋白质，例如牛血清白蛋白(BSA)^.孔血蓝蛋白(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)、人甲状腺球蛋白、鸡Y-球蛋白等。另外，抗 原可以是在hTR0P-2的氨基酸序列(序列号2)或前述的其部分序列中缺失、置换或添加了 I个或多个氨基酸的氨基酸序列而构成的肽。例如，还可以使用hTR0P-2的氨基酸序列或其部分序列中缺失I个或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))氨基酸、I或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))氨基酸被其它氨基酸置换、或添加了 I个或多个(优选I个或多个(例如I个 10个，更优选I个 5个))其它氨基酸的氨基酸序列所构成的肽。本发明中，作为用于导入于细胞等的基因，可以列举编码hTROP-2蛋白质或其部分片段的基因、或编码其突变型的蛋白质或片段的基因。作为这种基因，例如可以使用具有序列号I所不的喊基序列或其部分序列的基因。另外，作为用于导入于细胞等的基因，还可以使用与序列号I所示的碱基序列互补的序列在严紧条件下杂交，且编码具有hTROP-2活性的蛋白质的碱基序列或其部分序列。“严紧条件”是指杂交后洗涤时的条件，缓冲液的盐(钠)浓度为10 500mM，温度为42°C 72°C，优选 上述盐浓度为50 300mM，温度为55 68°C的条件。为了在基因中导入突变，可以通过Kunkel法或带缺口的双链体(Gappedduplex)法等公知方法进行，例如使用利用定点突变法的突变导入用试剂盒如GeneTai1r Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 公司 制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System (Mutan-K、Mutan_Super Express Km 等:TAKARA BIO公司制)来进行。(2)多克隆抗体的制作将制备的抗原投与到用于免疫的哺乳动物。哺乳动物没有特别限定，例如可以列举大鼠、小鼠和兔等，其中优选小鼠。每一只动物的抗原投与量，可以根据佐剂的有无适当设定。作为佐剂，可以列举弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、氢氧化铝佐剂等。免疫主要可以通过注入到静脉内、脚掌、皮下、腹腔内等来进行。而且，免疫的间隔没有特别限定，以数天至数周的间隔优选以I周的间隔进行I 10次、优选进行2 3次免疫。然后，在最后的免疫日起3 7天后，通过酶免疫测定法(ELISA或EIA)或放射性免疫测定法(RIA)等测定抗体效价，可以在出现所希望的抗体效价之日采血，获得抗血清。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等公知方法来进行纯化。然后，通过ELISA法等测定抗血清中的多克隆抗体的反应性。(3)单克隆抗体的制作(3-1)抗体产生细胞的提取本发明的抗hTROP-2抗体并没有限制，但优选为单克隆抗体。将制备的抗原投与用于免疫的哺乳动物，例如大鼠、小鼠和兔等。每只动物的抗原投与量可以根据有无佐剂适当设定。佐剂与上述同样。免疫方法也与前述同样。而且，在最后的免疫日起I 60天后，优选为I 14天后，提取抗体产生细胞。作为抗体产生细胞，可以列举脾细胞、淋巴结细胞和末梢血细胞等，其中优选淋巴结细胞和脾脏细胞。(3-2)细胞融合为了获得杂交瘤(抗体产生细胞株)，进行抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。作为与抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞，可以使用小鼠等动物的一般可以获得的已建立的细胞株。作为使用的细胞株，优选具有药剂选择性，具有未融合的状态下在HAT选择培养基(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)中无法生存而只有在与抗体产生细胞融合的状态下可以生存的性质的细胞株。作为骨髓瘤细胞，例如可以列举P3-X63-Ag8.653、P3-X63-Ag8(X63)、P3-X63_Ag8.Ul (P3Ul)、P3/NSI/l-Ag4-l (NSl)和 Sp2/0_Agl4 (Sp2/0)等小鼠骨髓瘤细胞株。骨髓瘤细胞的选择，可以适当考虑与抗体产生细胞的适合性而进行。然后，使骨髓瘤细胞与抗体产生细胞进行细胞融合。细胞融合时，在不含血清的DMEM和RPM1-1640培养基等动物细胞用培养基中，混合I X IO6 I X IO7个/mL的抗体产生细胞和2 X IO5 2 X IO6个/mL的骨髓瘤细胞。抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的细胞比(抗体产生细胞:骨髓瘤细胞)没有限制，但通常优选为1:1 10:1，更优选为3:1。然后，在细胞融合促进剂的存在下进行融合反应。作为细胞融合促进剂，例如可以使用平均分子量为1000 6000道尔顿(D)的聚乙二醇等。而且,还可以使用利用电刺激(例如电穿孔)的市售的细胞融合装置，使抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合。(3-3)杂交瘤的挑选和克隆从细胞融合处理后的细胞中挑选出目的杂交瘤。作为该方法，将细胞悬浮液用例如含有胎牛血清的RPM1-1640培养基等适当稀释后，接种于微孔培养板上，在各孔中加入选择培养基，以后适当更换选择培养基进行培养。其结果是，在选择培养基中开始培养后，可以将14天前后开始生长的细胞作为杂交瘤。然后，在逐步增殖的杂交瘤的培养上清中，筛选是否存在与hTROP-2反应的抗体。杂交瘤的筛选可以按照通常的方法，没有特别限制。例如，可以采集已长出杂交瘤的孔中所含的培养上清的一部分，通过ELISA、EIA和RIA等进行筛选。融合细胞的克隆可以通过有限稀释法等进行。通过流式细胞术等判断与hTROP-2显示出强反应性的抗体，选择产生该抗体的杂交瘤，建立克隆。
(3-4)单克隆抗体的提取作为培养已建立的杂交瘤并从获得的培养物中提取单克隆抗体的方法，可以采取通常的细胞培养法或腹水形成法等。“培养”是指在培养皿或培养瓶中使杂交瘤生长，或如下使杂交瘤在动物的腹腔内增殖。细胞培养法中，可以在含有10%胎牛血清的RPM1-1640培养基、MEM培养基或无血清培养基等动物细胞培养的培养基中，在通常的培养条件(例如37°C，5%C02浓度)下培养杂交瘤7 14天，从其培养上清中获得抗体。腹水形成法的情况下，在与骨髓瘤细胞来源的哺乳动物同种系动物的腹腔内投与约I X IO7个杂交瘤，使杂交瘤大量增殖。并且，优选在2 3周后提取腹水。在上述抗体的提取方法中，在需要纯化抗体时，可以通过适当选择或组合硫酸铵盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等公知方法来进行纯化。(3-5)具有抗肿瘤活性的克隆的挑选本发明的抗hTROP-2抗体是在体内具有抗肿瘤活性的抗体。这里，“抗肿瘤活性”是指使肿瘤细胞(癌细胞)死亡的活性或抑制肿瘤生长的活性。作为抗肿瘤活性，例如可优选列举癌细胞增殖抑制活性、肿瘤血管生成抑制活性。此夕卜，作为本发明的抗体可以发挥抗肿瘤活性的人肿瘤(肿瘤细胞)的种类，可以列举已确认hTROP-2的表达的公知的各种人肿瘤，没有特别限定，可以优选列举出例如人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌中的I种或2种以上，更优选人胰癌。进而，作为上述肿瘤的种类，还可以是复发癌、转移癌，本发明的抗体对于这些肿瘤也可以发挥优异的抗肿瘤活性。在体内的抗肿瘤活性的确认，例如可以使用在小鼠的皮下移植了所希望的肿瘤细胞的荷瘤小鼠(荷瘤动物治疗模型)，通过对该小鼠投与前述获得的抗体来进行。此时，抗体的投与可以在肿瘤细胞的移植后立即进行(预防模型)，也可以在确认移植肿瘤达到预定体积之后进行(治疗模型)。投与方法并没有限制，例如可以以每3天I次、I周I次、10天I次或2周I次或单次(仅一次)，以5 20mg/kg体重进行腹腔内投与等。预防模型的情况下，可以通过肿瘤形成频率和肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。治疗模型的情况下，可以根据肿瘤体积评价抗肿瘤活性的有无和水平。本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗hTROP-2抗体，可以优选列举出例如H链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号36 38所示的氨基酸序列，和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号41 43所示的氨基酸序列的抗体。作为该H链V区域，优选例如包含序列号35所示的氨基酸序列的区域，作为该L链V区域，优选例如包含序列号40所示的氨基酸序列的区域。此外，作为本发明的抗hTROP-2抗体的其它形态，可以优选列举例如H链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号46 48所示的氨基酸序列，和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号51 53所示的氨基酸序列的抗体。作为该H链V区域，优选例如包含序列号45所示的氨基酸序列的区域，作为该L链V区域，优选例如包含序列号50所示的氨基酸序列的区域。
同样地，作为本发明的抗hTROP-2抗体的其它形态，可以优选列举例如H链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号56 58所示的氨基酸序列，和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号61 63所示的氨基酸序列的抗体。作为该H链V区域，优选例如包含序列号55所示的氨基酸序列的区域，作为该L链V区域，优选例如包含序列号60所示的氨基酸序列的区域。同样地，作为本发明的抗hTROP-2抗体的其它形态，可以优选列举例如H链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号66 68所示的氨基酸序列，和/或L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号71 73所示的氨基酸序列的抗体。作为该H链V区域，可以列举出例如包含序列号65所示的氨基酸序列的区域，作为该L链V区域，可以列举出例如包含序列号70所示的氨基酸序列的区域。在本发明中，作为在体内具有抗肿瘤活性的抗hTROP-2抗体，更具体而言，可以优选列举出例如由保藏号为FERM BP-11251的杂交瘤产生的抗hTROP-2单克隆抗体(克隆名:K5-70)、由保藏号为FERM ΒΡ-11252的杂交瘤产生的抗hTROP-2单克隆抗体(克隆名:K5-107)、由保藏号为FERM ΒΡ-11253的杂交瘤产生的抗hTROP-2单克隆抗体(克隆名:K5-116-2-1)、由保藏号为FERM BP-11346的杂交瘤产生的抗hTROP-2单克隆抗体(克隆名:T6-16)及由保藏号为FERM BP-11254的杂交瘤产生的抗hTROP-2单克隆抗体(克隆名:T5-86)等。这里，保藏号为FERM BP-11251的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-MouseHybridoma) K5-70”，于2010年5月12日保藏，保藏号为FERM BP-11252的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) K5-107”，于2010年5月12日保藏，保藏号为FERM BP-11253的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma)K5-116-2-1”，于2010年5月12日保藏，保藏号为FERM BP-11346的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) T6-16”，于2011年3月I日保藏，保藏号为FERM BP-11254 的杂交瘤命名为“小鼠-小鼠杂交瘤(Mouse-Mouse Hybridoma) T5-86”，于2010年5月12日保藏，均保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(〒305-8566茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。进而，作为本发明的抗hTR0P-2抗体，还可以优选列举出例如与由保藏号为FERMBP-11251, FERM BP-11252, FERM BP-11253, FERM BP-11346 或 FERM BP-11254 的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合(识别)的位点(例如表位)结合的抗hTR0P-2抗体。作为表位，可以优选列举出下述(3-6)项中例示的表位。(3-6)抗hTR0P-2抗体的表位本发明的抗hTR0P-2抗体的表位(抗原决定簇)只要是抗原hTR0P-2的至少一部分即可，没有特别限制，例如优选为序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的、除由第252位 第260位的氨基酸构成的区域外的区域的至少一部分，更优选为包含第I位 第69位的氨基酸的区域的至少一部分或包含第100位 第274位的氨基酸的区域(由第252位 第260位的氨基酸构成的区域除外)的至少一部分，进一步优选为包含第27位 第69位的氨基酸的区域的至少一部分或包含第109位 第206位的氨基酸的区域的至少一部分。作为上述表位，特别优选包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的区域、以及包含上述区域的部分，其中最优选的是包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的hTR0P-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的区域、以及包含上述区域的部分。识别该区域的(与该区域或包含该区域的部分结合的)抗hTR0P-2抗体例如对肿瘤细胞内的内化活性高，在后述的免疫交联物等用途中极为有用。(3-7)抗hTR0P-2抗体的特性如前所述，本发明的抗hTR0P-2抗体为以低用量在体内具有高抗肿瘤活性的抗体。具体而言，优选对于荷瘤动物模型以20mg/kg体重以下(优选10mg/kg体重以下，更优选5mg/kg体重以下，进而，优选lmg/kg体重以下)的投与量(裸抗体)显示50%以上(优选80%以上，更优选90%以上，进而，优选95%以上、特别优选几乎100% (例如98%以上或99%以上))的肿瘤生长抑制活性。这里，肿瘤生长抑制活性(％)例如可以通过下式算出。
肿瘤生长抑制活性(％)= 100 -〔(抗体投与组的肿瘤体积或肿瘤重量)+ (对照组的肿瘤体积或肿瘤重量)〕X100
此外，本发明的抗hTROP-2抗体优选对2种以上人肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性。作为人肿瘤细胞株，没有限定，可以列举出例如选自各种人胰癌细胞株、人前列腺癌细胞株、人大肠癌细胞株及人乳腺癌细胞株组成的组中的至少2种，具体而言，可以优选列举出选自人胰癌细胞株PK-59、人胰癌细胞株BxPC-3、人胰癌细胞株KP-3L、人胰癌细胞株KP-2、人胰癌细胞株PK-1、人胰癌细胞株PK-45H、人胰癌细胞株PK-45P、人胰癌细胞株TCC-PAN2、人胰癌细胞株SWT-2、人大肠癌细胞株CAC0-2、人大肠癌细胞株SW480、人大肠癌细胞株DLD-1、人大肠癌细胞株HCT116、人乳腺癌细胞株JIMT-1、人乳腺癌细胞株HCC1143、人乳腺癌细胞株MCF-7、人前列腺癌细胞株DU145及人前列腺癌细胞株PC-3组成的组中的至少2种。其中，作为前述2种以上人肿瘤细胞株，可以更优选列举人胰癌细胞株PK-59及人胰癌细胞株BxPC-3。进而，本发明的抗hTROP-2抗体优选解离常数(Kd值)为Ι.ΟΧΙΟ,Μ以下，更优选1.0X IO-11M以下，进而，优选1.0X IO-12M以下。这里，抗体的结合能力(亲和性)例如可以通过斯卡查德分析(Scatchard analysis)、称为Biacore的表面等离子体共振传感器来测定解离常数(Kd值)、解离速率常数(Kdiss[l/秒])、结合速率常数(Kass[l/M.秒])。作为Biacore装置，可以列举出例如Biacore3000、Biacore2000、Biacore X、Biacore J、BiacoreQ (均为Biacore公司)等。就抗体而言，解离常数(Kd值)值越小则结合能力(亲和性)越强则越优选。Kd值可以由Kdiss及Kass两个参数确定,例如可以用式:Kd[M] = Kdiss/Kass表示。予以说明，Kd值的计算方法还可以优选采用后述实施例(具体为实施例10)中所述方法。(4)基因重组抗体和抗体片段(4-1)基因重组抗体作为本发明的抗hTROP-2抗体的优选方式之一，可以列举基因重组抗体。作为基因重组抗体，没有限制，但例如可以列举嵌合抗体、人源化抗体和人抗体等。嵌合抗体(即人源化嵌合抗体)是小鼠源抗体的可变区连接(接合)到人来源的恒定区的抗体(参照 Pr oc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，6851-6855，(1984)等)，在制作嵌合体时，可以通过基因重组技术容易地构建，从而获得这样连接的抗体。在制作人源化抗体时，通过从小鼠抗体的可变区将互补性决定区(⑶R)移植到人可变区，框架区(FR)为人来源，CDR由小鼠来源的CDR构成，制备重构的可变区(即CDR移植(⑶R grafting))。然后，将这些人源化的重构的人可变区与人恒定区连接。这种人源化抗体的制作方法在本领域中是众所周知的(参照Nature，321，522-525 (1986) ；J.Mol.Biol.，196,901-917 (1987)；Queen C et al.,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 86:10029-10033 (1989)；日本特表平4-502408号公报(日本特许第2828340号公报；Queen等)等)。人抗体(完全人抗体),一般是V区域的抗原结合位点即高变区(Hyper Variableregion)，V区域的其它部分和恒定区的结构具有与人的抗体相同的结构。但是，高变位点也可以来源于其它动物。制作人抗体的技术也是公知的，已建立了通过基因工程学的手法来制作人共通的基因序列的方法。人抗体例如可以通过使用含有具有人抗体的H链和L链基因的人染色体片段的人抗体产生小鼠的方法(参照Tomizuka, K.et al., NatureGenetics, (1977)16，133-143 ；Kuroiwa,Y.et.al.，Nuc.Acids Res.，(1998)26，3447-3448 ；Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects, (1999) 10,69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T.and Iijima, S.eds.), Kluwer Academic Publishers ；Tomizuka, K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, (2000) 97，722-727 等)和获得从人抗体文库挑选的曬菌体展示来源的人抗体的方法(参照Wormstone, 1.M.et.al, InvestigativeOphthalmology & Visual Science.,(2002)43 (7),2301-8 ；Carmen,S.et.al.,Briefingsin Functional Genomics and Proteomics, (2002) 1 (2),189-203 ；Siriwardena, D.et.al.，Opthalmology，(2002) 109 (3)，427-431 等)而获得。上述嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，优选为抗体Fe区域中的N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链，具体而言可以列举在抗体分子的Fe区域中具有该岩藻糖的I位不与N-糖苷键复合型糖链还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖的6位发生α结合的糖链的基因重组抗体分子所构成的抗体。如果是这种抗体，则可以使ADCC活性极大提高。而且，前述的多克隆抗体和单克隆抗体同样优选这一点(抗体Fe区域中N-糖苷键复合型糖链的特征)。(4-2)抗体片段
本发明的抗hTR0P-2抗体的片段(部分片段)也包含在本发明的抗体中。其中，本发明的抗体片段与本发明的抗hTR0P-2抗体一样，具有与hTR0P-2结合的活性(即可以结合到hTR0P-2上)，在体内具有抗肿瘤活性。作为该抗体的片段，是指抗hTR0P-2多克隆抗体或抗hTR0P-2单克隆抗体的一部分的区域(即，来源于本发明的抗hTR0P-2抗体的抗体片段)，例如，可以列举Fab、Fab’、F(ab’ ) 2、Fv (抗体可变区)、单链抗体(H链、L链、H链V区域和L链V区域等)、scFv、双抗体(diabody) (scFv 二聚物)、dsFv (二硫化物稳定化V区域)和至少一部分含有互补性决定区(complementarity determining region:CDR)的月太等。Fab是用蛋白质分解酶中的木瓜蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，H链的N末端侧约一半和L链全体通过二硫键结合的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入到原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab。F (&13’)2是用蛋白质分解酶中的胃蛋白酶处理抗体分子而获得的片段中，Fab通过铰链区的二硫键结合的稍大的、分子量约为10万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过后述的使Fab形成硫醚键或二硫键进行制作。Fab’是切断上述F (ab’)2的铰链区的二硫键的、分子量约为5万的具有抗原结合活性的抗体片段。而且，还可以通过将编码抗体的Fab’片段的DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，通过将该载体导入于原核生物或真核生物而使之表达，制造Fab’。scFv是将I条H链V区域(VH)和I条L链V区域(VL)用适当的肽连接子(P)连接的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，其是具有抗原结合活性的抗体片段。scFv可以如下制备，即，获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。双抗体是scFv 二聚化形成的抗体片段，其为具有二价的抗原结合活性的抗体片段。二价的抗原结合活性可以是相同的，也可以是其中一方为不同的抗原结合活性。双抗体可以如下制备，即，通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA，构建编码scFv的DNA并使P的氨基酸序列的长度达到8个残基以下，将该DNA插入于原核生物用表达载体或真核生物用表达载体，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物使之表达而进行制造。dsFv是指使VH和VL中的各I个氨基酸残基被换成半胱氨酸残基的多肽通过该半胱氨酸残基间的二硫键结合形成的抗体。被换成半胱氨酸残基的氨基酸残基可以按照Reiter等人公开的方法(Protein Engineering, 7,697-704,1994),基于抗体的立体结构预测进行选择。dsFv可以如下制备:通过获得编码抗体的VH和VL的cDNA,构建编码dsFv的DNA，将该DNA插入到原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入于原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。含有⑶R的肽包含VH的⑶R (⑶Rl 3)及VL的⑶R (⑶Rl 3)中的至少I个以上区域而构成，更优选包含VH的全部⑶R的肽、及包含VL的全部⑶R的肽，特别优选包含VH及VL的全部CDR (共6个区域)的肽。作为CDR的氨基酸序列，可以优选列举例如前述序列号36 38、41 43、46 48、51 53、56 58、61 63、66 68及71 73所示的氨基酸序列。包含多个CDR的肽可以直接或介由适当的肽连接子结合。含有CDR的肽可以通过构建编码抗体的VH和VL的⑶R的DNA，将该DNA插入原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，再将该表达载体导入原核生物或真核生物中使之表达而进行制造。此外，含有⑶R的肽还可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)和tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。作为本发明的抗体片段，可以是以原有的形状含有N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fe区域的一部分或全部的抗体片段，而且，也可以是上述抗体片段与N-糖苷键复合型糖链为该糖链的还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖不与岩藻糖结合的糖链的抗体Fe区域的一部分或全部的融合蛋白质。这种抗体片段可以极大地提高ADCC活性，因而优选。以下本说明书中的说明中，上述抗体片段也包含于本发明的抗hTROP-2抗体中。3.抗体-药剂复合 物的制作作为使用上述本发明的抗hTROP-2抗体的免疫交联物等，可以提供含有该抗体以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质(化合物等)的抗体-药剂复合物。予以说明，在预先分别制备该抗体分子以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质之后，将它们复合化而获得的物质一般被称为免疫交联物。而且，通过使用基因重组技术，将具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质中的蛋白质毒素在基因上与抗体基因连接，作为I个蛋白质(融合蛋白质)表达而获得的物质一般被称为免疫毒素。作为具有抗肿瘤活性的物质，例如，可以列举阿霉素(doxorubicin)、卡奇霉素(calicheamicin)、丝裂霉素(mitomycin) C、Auristatin E、放射性同位素(RI)等。作为具有细胞杀伤活性的物质，例如，可以列举皂草素、篦麻毒素、绿脓杆菌外毒素、白喉毒素、放射性同位素(RI)等，其中优选使用皂草素和绿脓杆菌外毒素。予以说明，作为具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的RI，没有限定，可以列举出例如9°Y、mIn、1251、3H、35S、14C、186Re、188Re,189Re,177Lu,67Cu,212Bi,213Bi,211At,198Au,224Ac, 1261 , 1331 , 77Br,113mln,95Ru,97Ru, 103Ru,105Ru,107Hg>203Hg>94mTc,121mTe, 122mTe, 125mTe,165Tm, 167Tm, 168Tm,111Ag, 197Pt, 109Pd,32P,33P,47Sc,153Sm,177Lu、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、18F、75Se、201T1、225Ac、76Br、86Y、169Yb、166Dy、212Pb 及 223Ra 等。作为抗体-药剂复合物的制作方法并没有限制，例如，可以列举通过二硫键或腙键将抗体与药剂偶联的方法等。上述本发明的抗hTROP-2抗体在对表达hTROP-2的目标肿瘤细胞内的内化活性方面优异。因此，通过预先使具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质复合化，可以使这些物质直接且高选择地作用于肿瘤细胞。本发明的抗体-药剂复合物在向目标肿瘤细胞传送药剂的能力上极为优异。予以说明，对细胞内的内化活性可以如下评价，S卩，通过用罗丹明等对抗体进行萤光标记，用萤光显微镜等观察向细胞内的进入举动和抗体的定位性。另外，本发明中还可以提供在抗体-药剂复合物中使用前述抗体片段代替抗体的抗体片段-药剂复合物。抗体片段-药剂复合物的详细内容可以适当应用上述抗体-药剂复合物的说明。以下，本说明书的说明中，抗体片段-药剂复合物也包含于本发明的抗体-药剂复合物中。4.药物组合物本发明的抗hTROP-2抗体和抗体-药剂复合物作为包含于药物组合物中的有效成分是有用的。该药物组合物作为肿瘤的治疗用和/或诊断用的药物组合物是有用的。尤其是，由于本发明的抗hTROP-2抗体和含有该抗体的抗体-药剂复合物具有作为抗肿瘤活性的优异的肿瘤生长抑制活性，因此优选在肿瘤的治疗用中使用。即，本发明的抗hTROP-2抗体和抗体-药剂复合物作为包含于肿瘤治疗剂和肿瘤诊断剂中的有效成分是有用的。予以说明，本发明中，上述肿瘤 的治疗还包括抑制肿瘤生长和阻遏肿瘤生长的意思，具体而言，例如若为肿瘤治疗剂，则还包括肿瘤生长抑制剂(tumor growth inhibitor)和肿瘤生长阻遏剂(tumor growth suppressor)的形态。此外,本发明的药物组合物还可以与公知的抗肿瘤剂并用。通过并用，可以获得更好的抗肿瘤效果。本发明的药物组合物含有本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗体-药剂复合物作为有效成分，而且优选以包括药学上允许的载体的药物组合物的形态提供。作为本发明的药物组合物的适用对象疾病(肿瘤)，可以列举确认了表达hTR0P-2的前述公知的各种人肿瘤。其中，特别优选列举人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、和人乳腺癌中的I种或2种以上。这些疾病可以是单独的，也可以是2种以上并发。此外，作为对象的肿瘤还可以是复发癌、转移癌，本发明的药物组合物(进而，本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗体一药剂复合物)可以有效用作复发癌、转移癌的治疗剂和诊断剂。所谓“药学上允许的载体”，可以列举赋形剂、稀释剂、增量剂、崩解剂、稳定剂、防腐剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、粘稠剂、矫味剂、增溶剂或其它添加剂等。通过使用I种以上这种载体，可以制备注射剂、液剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂或糖浆剂等形态的药物组合物。这些药物组合物可以经口或非经口投与。作为用于非经口投与的其它形态，包括含有I种以上的活性物质的通过常规方法制备的注射剂等。注射剂的情况中，可以通过溶解或悬浮于生理盐水或市售的注射用蒸馏水等药学上允许的载体中来制造。尤其是，对生物体内投与本发明的抗hTR0P-2抗体来源的抗体片段(其中尤其是低分子的物质)时，在其基础上还可以使用胶体分散系。胶体分散系可期待具有提高化合物(抗体片段)在生物体内稳定性的效果和将化合物高效输送到特定的内脏器官、组织或细胞的效果。胶体分散系只要为通常使用的即可，没有限制，可以列举聚乙二醇、高分子复合物、高分子凝集体、纳米胶囊、微球体、珠子和水包油系的乳化剂、胶束、混合胶束和以包含脂质体在内的脂质为基础的分散系，优选为具有将化合物高效输送到特定脏器、组织或细胞的效果的多个脂质体、人工膜的小囊泡(Mannino et al.,Biotechniques, 1988,6,682 ；Blumeand Cevc, Biochem.et Biophys.Acta,1990,1029,91 ；Lappalainen et al., AntiviralRes.，1994，23，119 ;Chonn and CulI is, Current Op.Biotech.，1995，6，698)。本发明的药物组合物的投与量根据患者的年龄、性别、体重和症状、治疗效果、投与方法、处理时间或药物组合物所含的本发明的抗hTROP-2抗体和抗体-药剂复合物的种类等而不同。通常，成人每人每次可以在600yg到6000mg的范围内投与，但并不限于此范围。例如通过注射剂投与时，对人患者I次的投与中，可以每Ikg体重平均I天以I次 数次投与ΙΟΟμ g IOOmg的量，还可以优选采用每3天、I周、10天或2周投与I次或单次(总计投与次数为I次)投与的方式。作为投与的形态，可以列举静脉内注射、皮下注射、皮内注射、肌肉内注射或腹腔内注射等,优选为静脉内注射。而且,注射剂根据情况还可以调制成非水性的稀释剂(例如聚乙二醇、橄榄油等植物油、乙醇等醇类等)、悬浮剂或乳浊齐IJ。这种注射剂的无菌化可以通过过滤器进行过滤杀菌、配合杀菌剂等来进行。注射剂可以制备成使用时调制的形态。即，可以通过冷冻干燥法等制成无菌的固体组合物，在使用前溶解于无菌的注射用蒸馏水或其它溶剂中使用。另外，本发明还提供用于制造治疗和/或诊断肿瘤的药物(药剂)的前述本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗体-药剂复合物的应用。而且，本发明还提供治疗和/或诊断肿瘤用的前述本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗体-药剂复合物。此外，本发明还提供肿瘤的治疗和/或诊断方法，其特征在于，其使用前述本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗体-药剂复合物(即投与患者)，而且，还提供前述本发明的抗hTR0P-2抗体和/或抗 体-药剂复合物在用于治疗和/或诊断肿瘤中的应用。5.肿瘤的检测方法本发明的肿瘤检测方法的特征在于，使前述本发明的抗hTR0P-2抗体与从生物体采集的试样(以下称生物体试样)反应，检测发生反应的抗体的信号的方法。如前所述，由于确认了 hTR0P-2在各种肿瘤细胞中特异性表达，hTR0P_2，尤其是游离hTR0P-2 (hTR0P-2的细胞外区域部分)可以作为各种肿瘤标志来使用。其中，优选作为人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌、和人乳腺癌的靶标来使用。因此，可以通过使本发明的抗hTR0P-2抗体与生物体试样反应，检测发生反应的抗体的信号来检测肿瘤。获得的抗体的信号成为生物体试样中的抗原量(即hTR0P-2量或游离hTR0P-2 fi)的指标。使用本发明的抗体的肿瘤的检测，首先，使作为试样的从被验者中提取的生物体试样，例如作为检查对象的组织片或血液等与本发明的抗体通过抗原抗体反应结合。然后，基于结合的抗体量的测定结果，测定生物体试样中的目的抗原量，从而进行。该测定可以按照公知的免疫学测定法进行，例如，可以使用免疫沉淀法、免疫凝集法、标记免疫测定法、免疫比池法、western blot法、流式细胞术法等。标记免疫测定法中,抗体的信号除了以用标记抗体直接检测的标记量表示之外，还可以以已知浓度或已知抗体效价的抗体作为标准液相对地表示。S卩，可以通过测定计测定标准液和试样，以标准液的值作为基准，相对地表示生物体试样中的抗体信号。作为标记免疫测定法，例如可以列举ELISA法、EI法、RIA法、萤光免疫测定(FIA)法、化学发光免疫测定法(Luminescence immunoassay)等。其中ELISA法由于简便和高灵敏度而尤其优选。本发明中，可以将通过上述检测方法获得的检测结果作为指标来评价或诊断肿瘤的状态。例如，检测结果超过预定的基准值时判断为肿瘤阳性，在预定的基准值以下时判断为肿瘤阴性，为阳性时，判断为有发生任意一种肿瘤的可能性，可以评价肿瘤的状态。这里，所谓肿瘤的状态是指是否患有肿瘤或其进行程度，可以列举肿瘤发病的有无、进行度、恶性程度、转移的有无和复发的有无等。在上述评价时，作为肿瘤的状态，可以选择I个，也可以组合选择多个。肿瘤的有无的评价，可以基于所获得的检测结果，通过以预定的基准值作为界限，判断是否患有肿瘤来进行。肿瘤的恶性程度是表示癌进行到何种程度的指标，也可以基于检测结果，对病期(Stage)分类再进行评价，或分类为早期癌或晚期癌再进行评价。例如，还可以将检测结果作为指标，评价为早期癌或晚期癌。肿瘤的转移，可以通过以检测结果作为指标，根据在从原发瘤的位置离开的位点是否出现新生物来评价。复发，可以根据在间歇期或缓解后检测结果是否再次超过预定的基准值来评价。6.肿瘤的检测用或诊断用试剂盒本发明的抗hTROP-2抗体可以以肿瘤的检测用或诊断用试剂盒的形态提供。本发明的试剂盒含有抗体，此外还可以含有标记物质、或用于固定抗体或该标记物的固定化试剂等。所谓抗体的标记物质是指用酶、放射性同位素、萤光化合物和化学发光化合物等标记的物质。本发明的试剂盒除了上述构成要素之外，还可以含有用于实施本发明的检测的其它试剂，例如标记物为酶标记物时，可以含有酶底物(显色性底物等)、酶底物溶解液、酶反应停止液、或试样用稀释液等。而且，还可以含有各种缓冲液、无菌水、各种细胞培养容器、各种反应容器(Eppendorf管等)、封闭剂(牛血清白蛋白(BSA)、脱脂乳、山羊血清等血清成分)、洗涤剂、表面活性剂、各种板、叠氮化钠等防腐剂和实验操作手册(说明书)等。本发明的试剂盒可有效用于进行上述本发明的检测方法，其有用性极高。以下，通过列举实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明并不限于此。〔实施例1〕[hTROP-2基因的克隆]hTROP-2全长基因的分离是通过RT-PCR法由人胎儿肝脏(10周大的胚胎)进行的。首先，基于hTROP-2基因(Genbank登录号N0.NM002353)的序列设计了以下所示的PCR引物。正向侧引物:5’-ttcctccgccccaccatggc-3’(序列号 3)反向侧引物:5’-ctcgagcaagctcggttcctttctc-3’(序列号 4)此时，反向侧引物中除去了`终止密码子并添加了 Xho I的限制酶消化序列。以由这些引物和人胎儿肝脏(10周大的胚胎)制备的总RNA (TAKARA)合成的cDNA为模板进行PCR反应。然后，利用琼脂糖凝胶电泳进行展开、进行目标条带的提取，克隆到pCRII载体(Invitrogen)中(pCRII_hTR0P2)。通过测序，对所克隆的hTROP-2的cDNA进行了确认。
表达载体的构建:由pCRII_hTR0P2切出含有hTROP-2基因的Eco RI/Xho I片段，插入到pcDNA4/ my C-Hisl5 A载体(Invitrogen)的EcoRI/Xho I位点，从而进行构建(pcDNA4-hTR0P2-myc/His)。此外，由 pcDNA4-hTR0P2_myc/His 切出含有 hTROP-2 基因的Hind ΙΙΙ/Pme I片段，(Hind III切断位点进行了平滑末端化)、插入到pcDNA3.1(+ )载体(Invitrogen)的Pme I位点，从而构建了具有新霉素耐性基因的表达载体(pcDNA3.l-hTR0P2-myc/His)。〔实施例2〕[hTROP-2基因稳定细胞株的构建]使用lipofectamine2000试剂(Invitrogen),将按照上述方法制作的编码hTROP-2 的全长 cDNA 的表达载体(pcDNA3.l-hTR0P2_myc/His)导入 HEK293 细胞(RIKEN)、HuH-7 细胞(HSRRB)、7E2-C 细胞(W02005/052156 中所记载的)、CHO-Kl 细胞(HSRRB)中，利用抗生素G418 (遗传霉素，GIBCO BRL)进行选择后，建立了稳定表达hTROP-2的细胞株，从而获得。
〔实施例3〕[hTROP-2细胞外区域的重组蛋白制作]通过PCR法对编码hTROP-2细胞外区域的一部分(具体而言，包含序列号2所示的氨基酸序列中的第I位 第263位的氨基酸的区域)的基因片段进行了扩增。扩增中使用的引物如下所示。正向侧引物:5’-ttcctccgccccaccatggc-3 (序列号 3)反向侧引物:5’-ctcgagctcgtccaggtaatagatgagcg-3’(序列号 5)此时，反向侧引物中添加了 Xho I限制酶消化位点。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR法扩增获得的DNA片段进行展开,使用QIAquick(注册商标)Gel Extraction Kit(QIAGEN)进行纯化。纯化而得的DNA片段亚克隆至pCR Blunt载体(Invitrogen)中(pCRB-hTR0P-2EC)，确认基因序列。然后，由pCRB-hTR0P-2EC切出含有编码hTROP-2的细胞外区域的基因片段的 Eco RI/Xho I 片段，插入到 pcDNA4/myc-His'' A 载体(Invitrogen)的 Eco RI/Xho I位点(pcDNA4mH-hTR0P-2EC)。进而，为了在 pcDNA4mH-hTR0P_2EC 的 Bam HI/Eco RI 位点制作Nru I限制酶切断位点，连接、插入以下所示的寡核苷酸。寡核苷酸1:5’ -gatccactagtcgcgagtggtgg-3’(序列号 6)寡核昔酸2:5’ -aattccaccactcgcgactagtg-3’(序列号 7)同样地在pcDNA4mH-hTR0P-2EC 的 Pme I 位点插入 pBglll 连接子(TAKARA)(pcDNA4mH-NB-hTR0P-2EC)。为了使用杆状病毒(baculovirus)制作重组蛋白，由pcDNA4mH-NB-hTR0P-2EC切出含有编码hTROP-2的细胞外区域的基因片段的Nru I/Bgl II片段，插入到PPSC8载体(日本农产工业)的Nru I/Bgl II位点(pPSC8_hTR0P2EC)。委托日本农产工业来进行使用杆状病毒制作hTROP-2细胞外区域的重组蛋白。hTROP-2细胞外区域的重组蛋白的纯化如下进行。在含有重组蛋白的培养上清中加入Ni Sepharose6Fast Flow (GE Healthcare),在4°C下进行2小时结合。然后，使用Econo柱(BIO RAD)，用含有20mM咪唑的磷酸缓冲液洗涤，用含有300mM咪唑的磷酸缓冲液进行洗脱，从而进行纯化。〔实施例4〕
[人EpCAMcDNA的分离和表达载体的构建]人EpCAM全长基因的分离是通过RT-PCR法由人胎儿肝脏(10周大的胚胎)进行的。首先，基于人EpCAM基因(Genbank登录号N0.NM002354)的序列设计了以下所示的PCR引物。正向侧引物:5’-tcctcgtgtcccactcccgg-3’(序列号 8)反向侧引物:5’-ctcgagtgcattgagttccctatgc-3’(序列号 9)此时，反向侧引物中除去了终止密码子并添加了 Xho I的限制酶消化序列。以由这些引物和人胎儿肝脏(10周大的胚胎)源的总RNA (TAKARA)合成的cDNA为模板进行PCR反应。然后，利用琼脂糖凝胶电泳进行展开、进行目标条带的提取，克隆到pCRII载体(Invitrogen)中(pCRI1-hEpCAM)。通过测序,对克隆的人EpCAM的cDNA进行了确认。表达载体的构建:由pCRI1-hEpCAM切出含有人EpCAM基因的Eco RI/Xho I片段，插入到pcDNA4/ myC-His''1 A载体(Invitrogen)的EcoRI/Xho I位点，从而进行构建(pcDNA4-hEpCAM-myc/His)。此外，由 pcDNA4-hEpCAM_myc/His 切出含有人 EpCAM 基因的Hind ΙΙΙ/Pme I片段，(Hind III切断位点进行了平滑末端化)、插入到pcDNA3.1(+ )载体(Invitrogen)的Pme I位点，从而构建了具有新霉素耐性基因的表达载体(pcDNA3.1-hEpCAM-myc/His)。
〔实施例5〕[抗hTROP-2单克隆抗体的制作]作为免疫原，使用了 hTROP-2稳定表达细胞株(HEK293-hTR0P_2细胞、CHO-K1-hTROP-2细胞、7E2-C-hTR0P-2细胞)、在细胞表面内源性表达hTROP-2蛋白的人胰脏癌细胞株(PK-59，RCB1901 ;由RIKEN cell bank购入)、或通过上述方法制作的hTROP-2的细胞外区域的重组蛋白。在hTROP-2稳定表达细胞株时将I X IO7细胞、在重组hTROP-2蛋白时将20 μ g蛋白分别与免疫辅助剂TiterMax Gold (Funakoshi株式会社)以1:1混合,制备乳池液,注射到小鼠(C57/BL6，Balb/c)的两脚掌、或腹腔内(初次免疫)。在对两脚掌短期免疫时，从初次免疫起3天后及10天后进行加强免疫,在最后一次免疫的次日，取出两膝窝的淋巴结，制备淋巴细胞。在向腹腔内长期免疫时，从初次免疫起以每周I次的比例进行加强免疫(在I 2个月内实施)，按照常规方法由脾脏分离B细胞。加强免疫时，在细胞免疫的情况下使用5X IO6细胞的用PBS悬浮的细胞悬浮液，在蛋白质抗原的情况下，使用5 μ g的PBS溶液。将制备的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞株(P3-X63_Ag8.653)以3:1的比例混合，用聚乙二醇法进行细胞融合，用含有HAT (氨基蝶呤、次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)的甲基纤维素培养基(商品名:ClonaCeI1-HY Cloning Medium D ；Stem Cell)培养7 28天,将增殖出来的杂交瘤的单一集落一个一个地挑到96孔平底培养板中，使用含有HAT的液体选择培养基在5%C02培养箱中培养。对来自于增殖出来的单一集落的杂交瘤的培养上清，利用Cell ELISA(后述)进行一次筛选、通过使用HuH-7-hTR0P_2细胞，PK-59的FACS解析进行2次筛选，从而建立了 300种产生识别在活细胞的细胞表面表达的hTR0P-2蛋白的抗hTR0P-2单克隆抗体的杂交瘤。〔实施例6〕[使用CellELISA进行的一次筛选]
在96孔培养板(BD Falcon)中，以3 X IO4细胞/孔交替接种CHO-Kl细胞(hTROP-2 阴性对照:由 Japan Health Sciences Foundation 购入)、和 CHO-Kl-hTROP-2 细胞(或 HuH_7 细胞(hTROP-2 阴性对照:由 Japan Health Sciences Foundation 购入)和HuH-7-hTR0P-2细胞)，在5%C02、37°C下培养I 2天。通过倾析除去细胞培养液，接下来用冰冷PBS洗涤后，用4%多聚甲醛-PBS处理5分钟，从而将细胞固定，用冰冷PBS洗涤后，作为ELISA板。之后，按照常规方法进行ELISA法。具体如下所示。首先，在室温下用2%脱脂乳-PBS溶液进行30分钟 I小时封闭。接下来，加入杂交瘤培养上清，在室温下反应I小时后，用0.l%Tween20-PBS溶液洗涤3次。加入作为二抗的用封闭溶液稀释1000倍的辣根过氧化物酶(HRP)标记抗小鼠IgG (GE HealthcareBiosciences)，在室温下反应I小时后，用0.l%Tween20_PBS溶液洗涤3次。添加TMB(3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺:SIGMA)底物溶液进行显色反应，加入IM硫酸使反应停止。使用酶标仪Model550 (BIO RAD)测定吸光度(405nm)。将相对于阴性对照显示高吸光度值的杂交瘤培养上清的相应杂交瘤在24孔平底培养板中进行扩大培养，转移到使用FACS解析进行的二次筛选(后述)。〔实施例7〕[使用FACS解析进行的二次筛·选]对上述用Cell ELISA进行的一次筛选中为阳性的杂交瘤，使用FACS解析进行二次筛选。就细胞而言，以不表达hTR0P-2的人肝癌细胞株HuH-7细胞为阴性对照，以相对于表达hTR0P-2的稳定细胞株HuH-7-hTR0P-2细胞的反应性为指标进行评价，接下来以与在细胞表面内源性表达hTR0P-2蛋白的人胰脏癌细胞株PK-59细胞(RCB1901 ;由RIKEN cellbank购入)的反应性进行评价。通过胰蛋白酶处理将细胞从培养皿剥离，制备细胞悬浮液(细胞密度2X106cells/mL)o使在使用Cell ELISA进行的一次筛选中显示阳性反应的杂交瘤上清和细胞悬浮液100μ L于4V反应20分钟。用PBS洗涤后，使之与PE标记抗小鼠IgG (BDPharmingen) (0.1 μ g)反应(4°C, 30 分钟)后，用 FACS Calibur (Becton, Dickinson andCompany)解析。最终，建立了约300种产生识别在活细胞的细胞表面表达的hTR0P-2蛋白的抗hTR0P-2单克隆抗体的杂交瘤。〔实施例8〕[同种型的鉴定]使用小鼠单克隆抗体同种型测定试剂盒(Serotec公司)并按照试剂盒所附方法进行制作的抗hTR0P-2单克隆抗体的同种型的鉴定。〔实施例9〕[TR0P-2抗体的腹水化及抗体纯化]在预先(7天前)投与2，6，10, 14-四甲基十五烷(pristane)的BALB/c裸小鼠的腹腔内投与3X IO6个按照上述方法制作的杂交瘤的克隆，采集2周后的腹水。进而，进行辛酸沉淀、使用蛋白 G 柱(HiTrap protein G ；GE Healthcare Biosciences)或蛋白 A 柱(HiTrap protein A ；GE Healthcare Biosciences)进行亲和纯化,从而由该腹水获得各杂交瘤克隆所产生的抗hTR0P-2单克隆抗体。
〔实施例10〕[抗原亲和性的测定(Kd值的测定)]通过使用了 ELISA的方法计算所制作的抗hTROP-2单克隆抗体的抗原亲和性(Kd值)(Djavad1-Ohaniance L.et al(1996),In Antibody Engineering,Chapter4,pp77-97.1RL Press, Oxford)。具体而言，在96孔培养板(Corning)中添加纯化的重组hTROP-2蛋白(0.1 μ g/mL)，将抗原固定化(室温、I小时，或4°C、一晚)。然后，用PBS洗涤3次，加入2%脱脂乳(PBS溶液)进行封闭(室温，I小时)。用PBS洗涤2次后，在上述ELISA板中添加预先混合抗原溶液(纯化hTROP-2蛋白;50，25，12.5,6.25，3.125nM)和抗hTROP-2单克隆抗体的各克隆(0.5nM)并用其平衡化的抗原-抗体复合物，并使之反应(室温，I小时)。用PBS洗涤3次后，使之与用封闭液稀释的HRP标记抗小鼠IgG (最终浓度I μ g/mL) (GE HealthcareBiosciences)反应(室温，I小时)。接下来用0.l%Tween20_PBS溶液洗涤3次后，添加TMB(3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺:SIGMA)底物溶液，进行显色反应，加入IM硫酸使反应停止。使用酶标仪Model550 (BIO RAD)测定吸光度。解离常数(Kd)的计算式如下所示。基于质量作用定律,抗原抗体反应如下表示。
权利要求
1.一种在体内具有抗肿瘤活性的抗人TR0P-2的抗体。
2.根据权利要求1所述的抗体，其以5 20mg/kg体重的投与量显示50%以上的肿瘤生长抑制活性。
3.根据权利要求2所述的抗体，用于显示所述肿瘤生长抑制活性的投与次数最多为每周I次。
4.根据权利要求1所述的抗体，其以10mg/kg体重的单次投与显示50%以上的肿瘤生长抑制活性。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的抗体，其对2种以上的人肿瘤细胞株具有抗肿瘤活性。
6.根据权利要求1 5中任意一项所述的抗体，其解离常数(Kd值)为1.0X ΙΟ,Μ以下。
7.根据权利要求1 6中任意一项所述的抗体，抗体为单克隆抗体。
8.根据权利要求1 7中任意一项所述的抗体，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
9.根据权利要求1 7中任意一项所述的抗体，肿瘤为人胰癌。
10.根据权利要求1 9中任意一项所述的抗体，肿瘤为复发癌或转移癌。
11.根据权利要求5 10中任意一项所述的抗体，肿瘤细胞株为选自人胰癌细胞株ΡΚ-59、人胰癌细胞株BxP C-3、人胰癌细胞株KP-3L、人胰癌细胞株KP-2、人胰癌细胞株PK-1、人胰癌细胞株PK-45H、人胰癌细胞株PK-45P、人胰癌细胞株TCC-PAN2、人胰癌细胞株SWT-2、人大肠癌细胞株CAC0-2、人大肠癌细胞株SW480、人大肠癌细胞株DLD-1、人大肠癌细胞株HCTl 16、人乳腺癌细胞株JIMT-1、人乳腺癌细胞株HCCl 143、人乳腺癌细胞株MCF-7、人前列腺癌细胞株DU145及人前列腺癌细胞株PC-3组成的组中的至少2种。
12.根据权利要求5 10中任意一项所述的抗体，肿瘤细胞株为人胰癌细胞株PK-59及人胰癌细胞株BxPC-3。
13.根据权利要求1 12中任意一项所述的抗体，抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号36 38所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号41 43所示的氨基酸序列。
14.根据权利要求1 12中任意一项所述的抗体，抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号46 48所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号51 53所示的氨基酸序列。
15.根据权利要求1 12中任意一项所述的抗体，抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号56 58所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号61 63所示的氨基酸序列。
16.根据权利要求1 12中任意一项所述的抗体，抗体的H链V区域的⑶Rl 3的氨基酸序列分别依次为序列号66 68所示的氨基酸序列、和/或抗体的L链V区域的CDRl 3的氨基酸序列分别依次为序列号71 73所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求1 16中任意一项所述的抗体，抗体为基因重组抗体。
18.根据权利要求17所述的抗体，基因重组抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
19.根据权利要求18所述的抗体，嵌合抗体为如下抗体:H链V区域的氨基酸序列包含序列号35所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号40所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求18所述的抗体，嵌合抗体为如下抗体:H链V区域的氨基酸序列包含序列号45所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号50所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求18所述的抗体，嵌合抗体为如下抗体:H链V区域的氨基酸序列包含序列号55所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号60所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求18所述的抗体，嵌合抗体为如下抗体:H链V区域的氨基酸序列包含序列号65所示的氨基酸序列、和/或L链V区域的氨基酸序列包含序列号70所示的氨基酸序列。
23.由保藏号为FERMBP-11251的杂交瘤产生的抗人TROP-2的单克隆抗体。
24.由保藏号为FERMBP-11252的杂交瘤产生的抗人TROP-2的单克隆抗体。
25.由保藏号为FERMBP-11253的杂交瘤产生的抗人TROP-2的单克隆抗体。
26.由保藏号为FERMBP-11346的杂交瘤产生的抗人TROP-2的单克隆抗体。
27.由保藏号为FERMBP-11254的杂交瘤产生的抗人TROP-2的单克隆抗体。
28.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与由保藏号为FERMBP-11251、FERM BP-11252.FERM BP_11253、FERM BP-11346 或 FERM BP-11254 的杂交瘤产生的单克隆抗体所结合的位点结合。
29.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与包含选自下列区域组成的组中的至少I种区域的部分结合，所述区域为:包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的区域、包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第56位的氨基酸的区域、及包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第193位 第206位的氨基酸的区域。
30.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与含有包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第43位 第65位的氨基酸的区域的部分结合。
31.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与含有包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第152位 第165位的氨基酸的区域的部分结合。
32.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与含有包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第171位 第183位的氨基酸的区域的部分结合。
33.根据权利要求1 22中任意一项所述的抗体，其与含有包含序列号2所示的人TROP-2的氨基酸序列中的第109位 第120位的氨基酸的区域的部分结合。
34.一种来自于权利要求1 33中任意一项所述的抗体的抗体片段。
35.根据权利要求34所述的抗体片段，其为包含序列号36 38所示的氨基酸序列、和/或序列号41 43所示的氨基酸序列的片段。
36.根据权利要求35所述的抗体片段，其为包含序列号35所示的氨基酸序列、和/或序列号40所示的氨基酸序列的片段。
37.根据权利要求34所述的抗体片段，其为包含序列号46 48所示的氨基酸序列、和/或序列号51 53所示的氨基酸序列的片段。
38.根据权利要求37所述的抗体片段，其为包含序列号45所示的氨基酸序列、和/或序列号50所示的氨基酸序列的片段。
39.根据权利要求34所述的抗体片段，其为包含序列号56 58所示的氨基酸序列、和/或序列号61 63所示的氨基酸序列的片段。
40.根据权利要求38所述的抗体片段，其为包含序列号55所示的氨基酸序列、和/或序列号60所示的氨基酸序列的片段。
41.根据权利要求34所述的抗体片段，其为包含序列号66 68所示的氨基酸序列、和/或序列号71 73所示的氨基酸序列的片段。
42.根据权利要求41所述的抗体片段，其为包含序列号65所示的氨基酸序列、和/或序列号70所示的氨基酸序列的片段。
43.一种产生权利要求1 22及28 33中任意一项所述的抗体的杂交瘤。
44.一种保藏号为FERM BP-11251的产生抗人TROP-2的单克隆抗体的杂交瘤。
45.一种保藏号为FERM BP-11252的产生抗人TROP-2的单克隆抗体的杂交瘤。
46.一种保藏号为FERM BP-11253的产生抗人TROP-2的单克隆抗体的杂交瘤。
47.一种保藏号为FERM BP-11346的产生抗人TROP-2的单克隆抗体的杂交瘤。
48.一种保藏号为FERM BP-11254的产生抗人TROP-2的单克隆抗体的杂交瘤。
49.一种抗体一药剂复合物，其含有权利要求1 33中任意一项所述的抗体以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。
50.一种抗体片段一药剂复合物，其含有权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段以及具有抗肿瘤活性和/或细胞杀伤活性的物质。
51.根据权利要求49或50所述的复合物，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
52.根据权利要求49或50所述的复合物，肿瘤为人胰癌。
53.根据权利要求49 52中任意一项所述的复合物，肿瘤为复发癌或转移癌。
54.—种药物组合物，其含有选自权利要求1 33中任意一项所述的抗体、权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段、及权利要求49 53中任意一项所述的复合物组成的组中的至少I种。
55.根据权利要求54所述的组合物，其用于肿瘤的治疗。
56.根据权利要求55所述的组合物，其没有体重减少的副作用。
57.根据权利要求54所述的组合物，其用于肿瘤的诊断。
58.根据权利要求54 57中任意一项所述的组合物，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
59.根据权利要求55 58中任意一项所述的组合物，肿瘤为复发癌或转移癌。
60.一种肿瘤治疗剂，其含有选自权利要求1 33中任意一项所述的抗体、权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段、及权利要求49 53中任意一项所述的复合物组成的组中的至少I种。
61.根据权利要求60所述的治疗剂，其没有体重减少的副作用。
62.根据权利要求60或61所述的治疗剂，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
63.一种肿瘤诊断剂，其含有权利要求1 33中任意一项所述的抗体、权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段、及权利要求49 53中任意一项所述的复合物组成的组中的至少I种。
64.根据权利要求63所述的诊断剂，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
65.—种肿瘤检测方法,其特征在于,使选自权利要求1 33中任意一项所述的抗体、权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段、及权利要求49 53中任意一项所述的复合物组成的组中的至少I种与由生物体采集的试样反应，检测发生反应的抗体和/或抗体片段的信号。
66.根据权利要求65所述的方法，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至少I种。
67.一种肿瘤的治疗用、诊断用或检测用试剂盒，其含有选自权利要求1 33中任意一项所述的抗体、权利要求34 42中任意一项所述的抗体片段、及权利要求49 53中任意一项所述的复合物组成的组中的至少I种。
68.根据权利要求67所述的试剂盒，肿瘤为选自人胰癌、人前列腺癌、人大肠癌及人乳腺癌组成的组中的至 少I种。
全文摘要
本发明提供与hTROP-2特异性反应且在体内具有抗肿瘤活性的抗体、产生该抗体的杂交瘤、该抗体与药剂的复合物、肿瘤的诊断用或治疗用药物组合物、肿瘤的检测方法、肿瘤的检测用或诊断用试剂盒。
文档编号G01N33/574GK103228673SQ20118002429
公开日2013年7月31日 申请日期2011年5月17日 优先权日2010年5月17日
发明者中村康司, 冈村健太郎, 田村真纪, 柳内浩之, 菅家彻 申请人:株式会社立富泰克