专利名称：一种生物纳米材料传感器电极及其制作方法、使用方法
技术领域：
本发明涉及一种生物纳米材料传感器电极及其制作方法、使用方法，属于生物纳米材料传感器技术领域。
背景技术：
现有电化学传感器使用酶作为生物识别分子，使用时，酶会特异性结合待测分子，将待测分子转换为可以被氧化的中间分子，然后在工作电压的作用下，该中间分子被氧化，产生电流，通过测量电流来测量待测分子的浓度。现有电化学传感器的缺点是敏感度低，线性响应范围窄，故实用价值极其有限。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术存在的不足之处，提供一种具有实时检测、响应时间短、灵敏度高、线性响应范围大、抗干扰能力强、可循环使用以及生产成本低廉的生物纳米材料传感器及其制作方法、使用方法。本发明是通过以下技术方案来实现的
一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特殊之处在于包括以下步骤
1、纳米碳管固定
将纳米碳管溶于浓度为0. 5-10%的Nafion溶液中，每毫升Nafion溶液中含有0. 5-10毫克的纳米碳管，超声分散该混合液1-3小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼金电极或者钼合金电极或者钼黑电镀得到的电极顶端表面，常温静置至晾干；
电极分为顶端(待修饰的部分)和尾端，电极通过尾端连接到各种设备上，顶端是探头部分；
所述Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟-3，6-二环氧-4-甲基_7_癸烯-硫酸的共聚
物；
所述钼合金电极为钼/铱合金电极或其他钼合金电极；所述钼黑电镀得到的电极制作方法如下
将电极尾端连接到恒电位仪的负极，将钼线的一端连接到恒电位仪的正极，将电极的顶端和钼线置于电镀液中，用恒电位仪施加5-15V电压于电极和钼线之间，通电0. 1-5分钟，钼黑会形成于电极顶端表面，将电极取出，0-30°C下静置至晾干；所述电极为钼金电极、钼/铱合金电极或其他钼合金电极；所述电镀液的主要成分是浓度为0. 1-1. 0%的氯钼酸溶液；所述电镀液中还可加入乙酸铅，乙酸铅占电镀液总质量的0. 0001-0. 002% ；
2、酶固定
方法1 将氧化酶溶于缓冲液中制得混合溶液，其中，氧化酶占混合溶液总质量的0.1-10%，将上述步骤1)得到的电极顶端浸入该混合溶液中，常温静置，氧化酶被吸附到电极顶端表面的纳米材料中，将电极取出，即为制得的生物纳米材料传感器电极；所述混合溶液采用蒸馏水或者磷酸盐溶液作为缓冲液，磷酸盐缓冲液可由每6-10 gNaCl, 1. 0-1. 5g Na2HPO4, 0. 15-0. 25g KCl 及 0. 15-0. 25g KH2PO4 溶于 IL 蒸溜水中配得；所述氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、酒精氧化酶、谷氨酸氧化酶、三磷酸腺苷混合酶中的任意一种，分别对应制得葡萄糖传感器电极、乳酸传感器电极，酒精传感器电极，谷氨酸传感器电极和三磷酸腺苷传感器电极；
三磷酸腺苷混合酶是由甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶按质量比3:(1-9)混合而成；或者方法2
将上述步骤1得到的电极顶端浸入到由氧化酶、戊二醛、缓冲液组成的混合溶液中，静置10分钟-2小时后，取出晾干，为制得的生物纳米材料传感器电极；
氧化酶占混合溶液总质量的0. 1_10%、戊二醛占混合溶液总质量的0. 5-10%,为了保护混合溶液中的氧化酶，所述混合溶液中还加入有牛血清蛋白，牛血清蛋白占混合溶液总质量的0. 1-5% ；
所述氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、酒精氧化酶、谷氨酸氧化酶、三磷酸腺苷混合酶中的任意一种，分别对应制得葡萄糖传感器电极、乳酸传感器电极，酒精传感器电极，谷氨酸传感器电极和三磷酸腺苷传感器电极；
三磷酸腺苷混合酶是由甘油激酶和甘油-3-磷酸氧化酶按质量比3:(1-9)混合而成；采用上述方法得到的生物纳米材料传感器电极。一种生物纳米材料传感器电极的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤将生物纳米材料传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在电化学检测平台上
进行，电化学检测平台以Ag/AgCl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极，常温下、缓冲液(指的是蒸馏水或者磷酸盐溶液)中进行，测量时，将恒定的电流电位+0. 5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag/AgCl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率(标定过程)，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌缓冲液，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在零下20°C至零上20 °C下贮存；
缓冲液为蒸馏水或者磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液可由每6-10 g NaCl, 1.0-1.5gNa2HPO4, 0. 15-0. 25g KCl 及 0. 15-0. 25g KH2PO4 溶于 IL 蒸馏水中配得。本发明的一种生物纳米材料传感器电极及其制作方法，采用的纳米碳管和钼黑纳米材料具有催化电化学反应的功能，将纳米碳管和钼黑纳米材料固定于传感器表面，可显著改进传感器的响应时间、灵敏度、线性响应范围和抗干扰能力，进而极大增强传感器的适用范围，相比较现有血糖计，该传感器电极具有实时检测，响应时间短至0.8秒，灵敏度高，最低可检测10 μΜ葡萄糖，线性响应范围大(10 μΜ - 22 mM葡萄糖)，抗干扰能力强，可循环使用以及生产成本低廉等优点。
具体实施例方式
以下给出本发明的具体实施方式
，用来对本发明做进一步的说明。实施例1
本实施例的一种生物纳米材料传感器电极一葡萄糖传感器电极的制作方法，包括以下步骤
若无特殊说明，所有溶液均由去离子水(电阻率18.2 MQ*cm)配制。
5
1)、纳米碳管固定
将纳米碳管溶于浓度为0. 5%的Nafion溶液中，Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟_3，6- 二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物，每毫升Nafion溶液中含有0. 5毫克的纳米碳管，超声分散该混合液1小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼/铱合金电极顶端表面，常温静置至晾干；电极分为顶端(待修饰的部分)和尾端，电极通过尾端连接到各种设备上，顶端是探头部分；
2)、酶固定
将葡萄糖氧化酶溶于蒸馏水中，其中，葡萄糖氧化酶占混合溶液总质量的0. 1%，将上述步骤1)得到的电极顶端浸入该混合溶液中，常温静置，葡萄糖氧化酶被吸附到电极顶端表面的纳米材料中，将电极取出，即得生物纳米材料传感器电极一葡萄糖传感器电极；
一种生物纳米材料传感器电极一葡萄糖传感器电极的使用方法，包括以下步骤
将生物纳米材料传感器电极一葡萄糖传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在电化学检测平台上进行，电化学检测平台以Ag/Agcl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极，测量在25°C下、蒸馏水缓冲液中进行，测量时，将恒定的电流电位+0. 5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag/Agcl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌蒸馏水，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在零下20°C下贮存于氧化酶磷酸盐缓冲液中；
磷酸盐缓冲液可由每 6g NaCl, 1. Og Na2HPO4, 0. 15g KCl 及 0. 15g KH2PO4 溶于 IL 蒸馏水中配得。实施例2
一种生物纳米材料传感器一乳酸传感器电极的制作方法，包括以下步骤
1、纳米碳管固定
将纳米碳管溶于浓度为5%的Nafion溶液中，Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟_3，6- 二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物，每毫升Nafion溶液中含有5毫克的纳米碳管，超声分散该混合液2小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼黑电镀得到的电极顶端表面，常温静置至晾干；电极分为顶端(待修饰的部分)和尾端，电极通过尾端连接到各种设备上，顶端是探头部分；
钼黑电镀得到的电极制作方法如下
将钼金电极尾端连接到恒电位仪的负极，将钼线的一端连接到恒电位仪的正极，将电极的顶端和钼线置于电镀液中，电镀液的主要成分是浓度为0. 1%的氯钼酸溶液，电镀液中还可加入乙酸铅，乙酸铅占电镀液总质量的0. 0001%，用恒电位仪施加5-15V电压于电极和钼线之间，通电0. 1-5分钟，钼黑会形成于电极顶端表面，将电极取出，0-30°C下静置至晾干；
2、酶固定
将上述步骤1得到的电极顶端浸入到由乳酸氧化酶、戊二醛、缓冲液组成的混合溶液中，静置10分钟-2小时后，取出晾干，为制得的生物纳米材料传感器电极；乳酸氧化酶占混合溶液总质量的0. 1%、戊二醛占混合溶液总质量的0. 5%，为了保护混合溶液中的乳酸氧化酶，混合溶液中还加入有牛血清蛋白，牛血清蛋白占混合溶液总质量的0. 1%；采用上述方法得到的生物纳米材料传感器电极一乳酸传感器电极。一种生物纳米材料传感器电极一乳酸传感器电极的使用方法，包括以下步骤将生物纳米材料传感器电极一乳酸传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在
电化学检测平台上进行，电化学检测平台以Ag/AgCl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极，常温下、缓冲液中进行，测量时，将恒定的电流电位+0. 5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag/AgCl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率(标定过程)，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌缓冲液，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在零下20°C下贮存；
缓冲液为蒸馏水或者磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液可由每6-10 g NaCl, 1.0-1.5gNa2HPO4, 0. 15-0. 25g KCl 及 0. 15-0. 25g KH2PO4 溶于 IL 蒸馏水中配得。实施例3
本实施例的一种生物纳米材料传感器电极一酒精传感器电极的制作方法，包括以下步
骤
1)、纳米碳管固定
将纳米碳管溶于浓度为10%的Nafion溶液中，Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟_3，6- 二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物，每毫升Nafion溶液中含有10毫克的纳米碳管，超声分散该混合液3小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼/铱合金电极顶端表面，常温静置至晾干；电极分为顶端(待修饰的部分)和尾端，电极通过尾端连接到各种设备上，顶端是探头部分；
2)、酶固定
将酒精氧化酶溶于磷酸盐缓冲液中制得混合溶液，其中，酒精氧化酶占混合溶液总质量的10%，将上述步骤1)得到的电极顶端浸入该混合溶液中，常温静置，氧化酶被吸附到电极顶端表面的纳米材料中，将电极取出，即为制得的生物纳米材料传感器电极一酒精传感器电极；
磷酸盐缓冲液可由每 10 g NaCl, 1. 5g Na2HPO4, 0. 25g KCl 及 0. 25g KH2PO4 溶于 IL蒸馏水中配得；
一种生物纳米材料传感器电极一酒精传感器电极的使用方法，包括以下步骤将生物纳米材料传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在电化学检测平台上进行，电化学检测平台以Ag/Agcl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极，测量在(25 士0. 5) °〇下、磷酸盐缓冲液中进行，测量时，将恒定的电流电位+0.5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag或Agcl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌磷酸盐缓冲液，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在零上20°C下贮存于氧化酶磷酸盐缓冲液中；其中，磷酸盐缓冲液是由每8 g NaCl, 1.15 gNa2HPO4, 0. 2 g KCl 及 0. 2 g KH2PO4 溶于 IL 蒸馏水中配得。实施例4
本实施例的一种生物纳米材料传感器一谷氨酸传感器电极的制作方法，包括以下步
骤1)、纳米碳管固定
将纳米碳管溶于浓度为8%的Nafion溶液中，Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟_3，6- 二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物；每毫升Nafion溶液中含有9毫克的纳米碳管，超声分散该混合液3小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼黑电镀得到的电极顶端表面，常温静置至晾干；电极分为顶端(待修饰的部分)和尾端，电极通过尾端连接到各种设备上，顶端是探头部分；
钼黑电镀得到的电极制作方法如下
将电极尾端连接到恒电位仪的负极，将钼线的一端连接到恒电位仪的正极，将电极的顶端和钼线置于电镀液中，电镀液的主要成分是浓度为1. 0%的氯钼酸溶液，电镀液中还可加入乙酸铅，乙酸铅占电镀液总质量的0. 002% ；用恒电位仪施加15V电压于电极和钼线之间，通电5分钟，钼黑会形成于电极顶端表面，将电极取出，18°C下静置至晾干；
2)、酶固定
将上述步骤1得到的电极顶端浸入到由谷氨酸氧化酶、戊二醛、缓冲液组成的混合溶液中，静置2小时后，取出晾干，为制得的生物纳米材料传感器电极；谷氨酸氧化酶占混合溶液总质量的10%、戊二醛占混合溶液总质量的10%，为了保护混合溶液中的谷氨酸氧化酶，混合溶液中还加入有牛血清蛋白，牛血清蛋白占混合溶液总质量的5% ；
采用上述方法得到的生物纳米材料传感器电极一谷氨酸传感器电极。
一种生物纳米材料传感器电极一谷氨酸传感器电极的使用方法，包括以下步骤
将生物纳米材料传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在电化学检测平台上进行，电化学检测平台以Ag/AgCl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极，测量在(25 士0. 5) ！下、蒸馏水缓冲液中进行，测量时，将恒定的电流电位+0.5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag/AgCl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌蒸馏水缓冲液，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在10°C下贮存于氧化酶磷酸盐缓冲液中；
本发明的生物纳米材料传感器电极，可以应用于以下场合
1、葡萄糖传感器电极用于糖尿病诊断设备，通过测定血糖浓度诊断糖尿病；
2、葡萄糖传感器电极用于糖尿病人监控设备，实时监控血液中的葡萄糖浓度；
3、葡萄糖传感器电极用于科研设备，当该传感器电极与ApplicableElectronics公司的klf-referencing工作站搭配使用时，可实时检测样品(如细胞)对葡萄糖的吸收速率，即流量(摩尔葡萄糖/ (秒*平方厘米))，该技术可广泛应用于癌症生理学，抗癌药物效率，糖尿病胰岛生理，微生物和污水处理，以及肌肉纤维营养等方面的研究。
权利要求
1.一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于包括以下步骤1)、纳米碳管固定将纳米碳管溶于浓度为0. 5-10%的Nafion溶液中，每毫升Nafion溶液中含有0. 5-10 毫克的纳米碳管，超声分散该混合液1-3小时，获得黑色均勻分散液，取分散液均勻覆盖于钼金电极或者钼合金电极或者钼黑电镀得到的电极顶端表面，常温静置至晾干；2)、酶固定方法1 将氧化酶溶于缓冲液中制得混合溶液，其中，氧化酶占混合溶液总质量的 0.1-10%，将上述步骤1)得到的电极顶端浸入该混合溶液中，常温静置，氧化酶被吸附到电极顶端表面的纳米材料中，将电极取出，即为制得的生物纳米材料传感器电极；或者方法2 将上述步骤1)得到的电极顶端浸入到由氧化酶、戊二醛、缓冲液组成的混合溶液中，静置10分钟-2小时后，取出晾干，为制得的生物纳米材料传感器电极。
2.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤1)中所的述Nafion溶液是聚四氟乙烯和全氟-3，6-二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物。
3.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤1)中所述的钼合金电极为钼/铱合金电极。
4.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤1)中所述钼黑电镀得到的电极制作方法如下将电极尾端连接到恒电位仪的负极，将钼线的一端连接到恒电位仪的正极，将电极的顶端和钼线置于电镀液中，用恒电位仪施加5-15V电压于电极和钼线之间，通电0. 1-5分钟，钼黑会形成于电极顶端表面，将电极取出，0-30°C下静置至晾干；所述电镀液的主要成分是浓度为0. 1-1. 0%的氯钼酸溶液。
5.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤2)中方法1中所述的混合溶液采用蒸馏水或者磷酸盐溶液作为缓冲液，磷酸盐缓冲液由每6-10 g NaCl, 1. 0-1. 5g Na2HPO4, 0. 15-0. 25g KCl 及 0. 15-0. 25g KH2PO4溶于 IL蒸馏水中配得。
6.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤2)中方法2所述的混合溶液中还加入有牛血清蛋白，牛血清蛋白占混合溶液总质量的0. 1-5%。
7.按照权利要求1所述的一种生物纳米材料传感器的制作方法，其特征在于步骤2)中方法1或2所述的氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、酒精氧化酶、谷氨酸氧化酶、三磷酸腺苷混合酶中的任意一种。
8.按照权利要求1-7任一权利要求所述的生物纳米材料传感器的制作方法得到的生物纳米材料传感器电极。
9.按照权利要求8所述的一种生物纳米材料传感器电极的使用方法，其特征在于包括以下步骤将生物纳米材料传感器电极在测量葡萄糖等待测样品浓度时要在电化学检测平台上进行，电化学检测平台以Ag/AgCl电极为参比电极，生物纳米材料传感器电极为工作电极， 常温下、缓冲液中进行，测量时，将恒定的电流电位+0. 5V施加于生物纳米材料传感器电极和Ag/AgCl参比电极之间，记录生物纳米材料传感器电极对已知浓度样品的安培响应，得到响应率，然后根据电流值与样品浓度成正比进行待测样品的定量测定，其间需不断搅拌缓冲液，当生物纳米材料传感器电极不使用时，在零下20°C至零上20 ！下贮存。
10.按照权利要求9所述的一种生物纳米材料传感器电极的使用方法，其特征在于所述缓冲液为蒸馏水或者磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液可由每6-10 g NaCl, 1.0-1.5g Na2HPO4, 0. 15-0. 25g KCl 及 0. 15-0. 25g KH2PO4 溶于 IL 蒸馏水中配得。
全文摘要
本发明涉及一种生物纳米材料传感器电极及其制作方法、使用方法，属于生物纳米材料传感器技术领域。包括以下步骤1、纳米碳管固定；2、酶固定。本发明采用的纳米碳管和铂黑纳米材料具有催化电化学反应的功能，将纳米碳管和铂黑纳米材料固定于传感器表面，可显著改进传感器的响应时间、灵敏度、线性响应范围和抗干扰能力，进而极大增强传感器的适用范围，相比较现有血糖计，该传感器电极具有实时检测，响应时间短至0.8秒，灵敏度高，最低可检测10μM葡萄糖，线性响应范围大(10μM–22mM葡萄糖)，抗干扰能力强，可循环使用以及生产成本低廉等优点。
文档编号G01N27/327GK102565162SQ20121002084
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月30日 优先权日2012年1月30日
发明者埃里克·斯科特·麦克勒莫, 戴维马歇尔·波特菲尔德, 石谨 申请人:埃里克·斯科特·麦克勒莫, 戴维马歇尔·波特菲尔德, 石谨