专利名称：CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒。
背景技术：
柯萨奇B组(CoxB)病毒是肠道病毒的一种，柯萨奇B病毒感染后，可出现无菌性脑膜炎、肌麻庳、疱疹性咽峡炎、心肌炎和心包炎、急性出血性结膜炎等。柯萨奇B组有6个血清型。CoxB IgG/IgM的测定能够及早检测出患者是否新近遭受CoxB病毒感染，特别对急性期的心肌炎进行CoxB IgG/IgM的普查，将对心肌疾病提供诊断依据，特别是CoxB IgM的阳性，将提示患者有可能心肌早期受到感染，同时可配合临床诊断和观察的有利指标，对患者的治疗和康复有着重要的意义。目前柯萨奇B组病毒感染的诊断方法主要有三种，病毒分离鉴定、血清学检查及分子生物学技术。病毒分离培养和分子生物学法繁复费事，传统的病毒分离法耗时长，而 PCR方法存在检测成本昂贵且对环境交叉污染的风险高，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需求，快速.准确。血清学的进展(快速法)开拓了该病毒的快速诊断技术，其具有高灵敏度及高特异性的优势，在病毒感染的诊断中发挥了越来越重要的作用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒。本发明采用了下述技术方案来解决上述技术问题一种CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，包括多孔酶联板，分别装有样品稀释液、阳性对照、阴性对照、IgG酶标抗体或IgM酶标抗体、底物A、底物B、浓缩洗涤液和终止液的试剂瓶，所述多孔酶联板的微反应孔的内壁包被有CoxB组抗原。CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒即为CoxB IgG或CoxB IgM酶联免疫法检测试剂盒。进一步的，所述多孔酶联板为48孔酶联板或96孔酶联板。试剂盒中的样品稀释液也可采用常规的ELISA样品稀释液，如含有磷酸盐缓冲液的样品稀释液，或者也可以为含有O. OlM磷酸缓冲液(PBS, ρΗ7· 2-7. 5)和< O. Iwt% NaN3 的IOwt %小牛血清。试剂盒中的阳性对照为经病毒灭活的含有CoxB组IgG抗体或CoxB组IgM抗体的阳性血清。试剂盒中的阴性对照为阴性血清。试剂盒中的IgG酶标抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体，IgG抗体可以是各种类型的IgG抗体，如鼠抗人IgG、羊抗人IgG或兔抗人IgG。试剂盒中的IgM酶标抗体为辣根过氧化酶(HRP)标记的μ链IgM抗体，.试剂盒中的底物Α、底物B均为常规ELISA底物A和底物B。
试剂盒中的浓缩洗涤液可采用常规的浓缩的ELISA洗涤液，如含有吐温的磷酸盐缓冲液，或者也可以为20X浓缩的O. 01MPBS。试剂盒中的终止液可采用常规的ELISA终止液。多孔酶联板上包被的CoxB组抗原的主要成分为纯化并完全灭活的Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6病毒的混合。各病毒混合比例可根据检测需要任意调整。一般情况下，以病毒总量为基础计，各病毒的重量百分比均为6-20%。多孔酶联板上包被抗原的方法采用常规。进一步的，所述CoxB组抗原采用包括下列步骤的方法制备获得I)病毒扩增将选自 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6 病毒中之任一的毒种接种至单层的Hela细胞中培养获得细胞病毒液；2)病毒释放将细胞病毒液重复冻融三次以上，而后在冰水浴中超声波破碎细胞；3)病毒灭活将重复冻融三次以上的细胞病毒液或经超声波破碎细胞的细胞病毒液完全灭活，灭活的细胞病毒液经病毒灭活试验检验需呈阴性；4)病毒抗原纯化4. I将经病毒释放与病毒灭活的细胞病毒液置于18-20°C融解适当时间后，加入甲醛水溶液混合均匀，甲醛在混合液中的终浓度为O. 12-0. 20v% ；4. 2混合液梯度离心分离病毒4. 3分离出的病毒加入保护液获得病毒抗原液。5)利用步骤 1-4 分别制备 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6 的病毒抗原液，将制得的Cox BUCox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6的病毒抗原液混合获得CoxB组抗原。步骤I中，Hela细胞接种CoxB组的病毒毒种后可采用常规适于Hela细胞生长的条件培养。较优的，可如实施例所列举的，先置37°C吸附I小时，加入细胞维持液(含2wt% 小牛血清的1640培养液)后，置5% CO2孵箱36°C培养至100%细胞发生病变。步骤2中，冰水浴温度一般为O V。步骤3中，细胞病毒液完全灭活可采用常规完全灭活病毒的方法，如紫外线灭活。步骤4中，步骤4. I所述甲醛水溶液可为福尔马林。步骤4. I中，融解时间为15_20min。步骤4. 2中，梯度离心分离病毒具体包括下列步骤4. 2. I混合液低速离心至少20分钟，取上清；4. 2. 2上清35000-45000rpm/min离心至少60分钟，取沉淀；4. 2. 3沉淀用PBS(磷酸盐缓冲液)溶解后，置于13_17wt %甘油水溶液之上， 50000-65000rpm/min离心60分钟以上，取沉淀，沉淀即为分离出的病毒。进一步的,步骤4. 2. I中，低速离心的离心速度为5000-8000rpm/min。步骤4. 2. 3中所用PBS为O. 01-0. 05M, pH7. 2-7. 5。沉淀与PBS的体积比为 I (2-3)。步骤4.3中所述保护液可为甘油或二甲亚砜，病毒与保护液的体积比可为 I (1-2)。
进一步的,所述CoxB组抗原的制备还包括步骤5 :将利用步骤 1-4 分别制备的 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6的抗原液中的多种混合。上述纯化病毒的方法在病毒离心浓缩前采用适当的方法处理细胞病毒液，尤其是适当浓度甲醛溶液的处理，一方面在蛋白质末端基团之间形成交联链(桥键)，减慢了蛋白的降解速度，不让细胞中的病毒颗粒被其他有机溶剂迅速降解破坏，从而起到有效固定、稳定、保护蛋白剂的作用，另一方面，适当浓度的甲醛溶液处理还提高了病毒离心浓缩前的去渣力，再配合适当的浓缩离心方法，最终有效提高了病毒纯化回收率，增强了病毒抗原特异性和试剂盒的检测准确度。提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，A260/A280大于I. 5， 提纯产量超过2. 0mg/100g。试剂盒中，包被有CoxB组抗原层的多孔酶联板可采用常规方法将抗原包被至酶联板上后，而后用封闭液封闭的方式制得。试剂盒中除包括上述物质外，还可包括常规ELISA测试时所需要的试剂、工具或容器，如蒸馏水或去离子水、洗液滴瓶、试管以及说明书等。本发明的CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒特异性与灵敏度高，操作时间短， 可用于多人份定性检测CoxB IgG/IgM。
具体实施例方式以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。实施例ICoxB组抗原的制备试剂细胞维持液2%小牛血清1640维持液(1640粉、NaHCO3、抗菌素、小牛血清、H2O)细胞培养液10%小牛血清1640培养液(1640粉、NaHCO3、抗菌素、小牛血清、H2O)制备步骤I、取0.5ml Cox BI病毒毒种接种至生长成单层的Hela细胞瓶(Hela细胞用细胞培养液36°C培养)中，置37°C吸附I小时，再加入细胞维持液(含2%小牛血清的1640培养液)10ml，置5% CO2孵箱36°C培养约48-72小时，观察到100%细胞发生病变，获得细胞
病毒液。2、取O. 5ml冻融后细胞病毒液重复冻融三次，目的是保证细胞内病毒全部释放。3、病毒完全灭活紫外灯照射细胞病毒液完全灭活病毒。取已灭活的病毒液1ml， 常规方法培养传代三次，未出现细胞病变，表明病毒完全灭活即可用于制作抗原。4、取经病毒灭活试验呈阴性的细胞病毒液在冰水浴中超声波破碎细胞(300W/3 秒/停3秒X30循环)，以保证细胞破碎，细胞内病毒全部释放。5、病毒抗原纯化5. I为保证细胞内释放的病毒回收率，将在细胞破碎、病毒全部释放后置18_20°C 融解15分钟，加入甲醛饱和水溶液(福尔马林)至甲醛在混合液中的终浓度为O. 16v%，以稳定细胞粉碎物。5. 2梯度离心
将粉碎物5000rpm/min离心20分钟，取上清，再40000rpm/min高速离心60分钟，
取沉淀。沉淀加入2倍体积比的pH7. 2 O. OlM的PBS溶解，置于IOml 15wt%甘油溶液上面,50000rpm/min高速离心60分钟，取沉淀。沉淀物加I倍体积的甘油，获得Cox BI病毒抗原液。6、采用步骤 1-5 分别制备 Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5、Cox B6 病毒抗原液。7、将制备的各病毒抗原液等体积比混合获得CoxB组抗原。经检测，各提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，A260/A280大于I. 5，提纯产量均超过2. Omg病毒/IOOg细胞病毒液,最高可达2. 45mg病毒/IOOg细胞病毒液。实施例2CoxB组抗原的制备试剂同实施例I制备步骤I、取0.5ml Cox BI病毒毒种接种至生长成单层的Hela细胞瓶(Hela细胞用细胞培养液36°C培养)中，置37°C吸附I小时，再加入细胞维持液(含2%小牛血清的1640培养液)10ml，置5% CO2孵箱36°C培养约48-72小时，观察到100%细胞发生病变，获得细胞
病毒液。2、取O. 5ml冻融后细胞病毒液重复冻融三次，目的是保证细胞内病毒全部释放。3、病毒完全灭活紫外灯照射细胞病毒液完全灭活病毒。取已灭活的病毒液1ml， 常规方法培养传代三次，未出现细胞病变，表明病毒完全灭活即可用于制作抗原。4、取经病毒灭活试验呈阴性的细胞病毒液在冰水浴中超声波破碎细胞(300W/3 秒/停3秒X30循环)，以保证细胞破碎，细胞内病毒全部释放。5、病毒抗原纯化5. I为保证细胞内释放的病毒回收率，将在细胞破碎、病毒全部释放后置18-20°C 融解20分钟，加入甲醛饱和水溶液(福尔马林)至甲醛在混合液中的终浓度为O. 12v%,以稳定细胞粉碎物。5. 2梯度离心将粉碎物8000rpm/min离心20分钟，取上清，再35000rpm/min高速离心60分钟，
取沉淀。沉淀加入3倍体积比的pH7. 4,0. 02Μ的PBS溶解，置于IOml 13wt%甘油溶液上面,65000rpm/min高速离心60分钟，取沉淀。沉淀物加I倍体积的二甲亚砜，获得Cox BI病毒抗原液。6、采用步骤 1-5 分别制备 Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5、Cox B6 病毒抗原液。7、将制备的各病毒抗原液各取1-3体积份混合获得CoxB组抗原。经检测，各提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，A260/A280大于I. 5，提纯产量均超过2. Omg病毒/IOOg细胞病毒液。实施例3试剂同实施例I制备步骤I、取0.5ml Cox BI病毒毒种接种至生长成单层的Hela细胞瓶(Hela细胞用细胞培养液36°C培养)中，置37°C吸附I小时，再加入细胞维持液(含2%小牛血清的1640培养液)10ml，置5% CO2孵箱36°C培养约48-72小时，观察到100%细胞发生病变，获得细胞
病毒液。2、取O. 5ml冻融后细胞病毒液重复冻融三次，目的是保证细胞内病毒全部释放。3、病毒灭活紫外灯照射细胞病毒液完全灭活病毒。取已灭活的病毒液1ml，常规方法培养传代三次，未出现细胞病变，表明病毒完全灭活即可用于制作抗原。4、取经病毒灭活试验呈阴性的细胞病毒液在冰水浴中超声波破碎细胞(300W/3 秒/停3秒X30循环)，以保证细胞破碎，细胞内病毒全部释放。5、病毒抗原纯化5. I为保证细胞内释放的病毒回收率，将在细胞破碎、病毒全部释放后置18-20°C 融解15分钟，加入甲醛饱和水溶液(福尔马林)至甲醛在混合液中的终浓度为O. 20v%,
以稳定细胞粉碎物。
5. 2梯度尚心
将粉碎物6000rpm/min离心20分钟,取上清,再45000rpm/min高速离心60分钟，
实施例4试剂盒的装配试剂盒中多孔酶联板及各种试剂配制
I.样品稀释液0. OlM磷酸缓冲液(PBS, ρΗ7· 2-7. 5)，< O. I % NaN3,10%小牛血
取沉淀。沉淀加入2倍体积比的ρΗ7. 5 O. 05Μ的PBS溶解，置于IOml 17wt%甘油溶液上面,60000rpm/min高速离心60分钟，取沉淀。沉淀物加I倍体积的甘油，获得Cox BI病毒抗原液。6、采用步骤 1-5 分别制备 Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5、Cox B6 病毒抗原液。7、将制备的各病毒抗原液各取1-3体积份混合获得CoxB组抗原。经检测，各提纯的病毒有典型核蛋白紫外吸收曲线，A260/A280大于I. 5，提纯产量均超过2. Omg病毒/IOOg细胞病毒液。清。2.阳性对照含有< O. I % NaN3的经病毒灭活的阳性人血清。已经过乙肝病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒(1，2型)抗体，丙肝病毒抗体，梅毒螺旋体抗体均为阴性。3.阴性对照含有< O. I % NaN3的经病毒灭活的阴性人血清。已经过乙肝病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒(1，2型)抗体，丙肝病毒抗体，梅毒螺旋体抗体均为阴性。4. IgG酶标抗体辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗人IgG抗体。5.底物A :0. IM枸橼酸钠，O. 01%过氧化氢。6.底物B:含四甲基联苯胺，二甲亚砜，醋酸钠溶液。7.浓缩洗涤液(20X)浓缩的O. OIMPBS。8.终止液2mol/L H2SO49.包被有CoxB组抗原层的多孔酶联板分别用实施例1-3制备的Cox B组抗原采用常规方法分别包被酶联板后用封闭液封闭。将分别装有样品稀释液、阳性对照、阴性对照、IgG酶标抗体、底物A、底物B、浓缩洗漆液和终止液的密封试剂瓶各一瓶，一张封板膜，任一块9制备的包被有CoxB组抗原层的多孔酶联板多孔酶联板密封包装后，一并装入一盒体制成CoxB IgG酶联免疫法检测试剂盒。试剂盒的储存条件2 8°C保存。实施例5试剂盒的装配试剂盒中多孔酶联板及各种试剂配制I.样品稀释液0. OlM 磷酸缓冲液(PBS, ρΗ7· 2-7. 5)，< O. I % NaN3,10% 小牛血清。2.阳性对照含有< O. I % NaN3的经病毒灭活的阳性人血清。已经过乙肝病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒(1，2型)抗体，丙肝病毒抗体，梅毒螺旋体抗体均为阴性。3.阴性对照含有< O. I % NaN3的经病毒灭活的阴性人血清。已经过乙肝病毒表面抗原、人类免疫缺陷病毒(1，2型)抗体，丙肝病毒抗体，梅毒螺旋体抗体均为阴性。4. IgM酶标抗体辣根过氧化酶(HRP)标记的鼠抗人μ链IgM抗体。5.底物A :0. IM枸橼酸钠，O. 01%过氧化氢。6.底物B:含四甲基联苯胺，二甲亚砜，醋酸钠溶液。7.浓缩洗涤液(20X)浓缩的O. OIMPBS。8.终止液2mol/L H2SO49.包被有CoxB组抗原层的多孔酶联板分别用实施例1-3制备的Cox B组抗原采用常规方法分别包被酶联板后用封闭液封闭。将分别装有样品稀释液、阳性对照、阴性对照、IgM酶标抗体、底物A、底物B、浓缩洗漆液和终止液的密封试剂瓶各一瓶，一张封板膜，任一块9制备的包被有CoxB组抗原层的多孔酶联板多孔酶联板密封包装后，一并装入一盒体制成CoxB IgM酶联免疫法检测试剂盒。试剂盒的储存条件2 8°C保存。实施例6试剂盒的检测试剂盒使用方法试剂盒可对血清样本进行检测，按标准方法收集血清，待测。如不立即测定,血清样本放置在-20°C以下冻存，且避免反复冻融.I.试剂配制I. I溶液的配制取试剂盒中的浓缩洗涤液I瓶，以I : 20稀释混匀、溶解后装入洗瓶(自备)内待用。I. 2实验准备将待测标本从冰箱中取出，置室温解冻后，按实验要求将待测标本编号。I. 3将待测标本编号后仔细核对无误后，将待测血清用样品稀释液(I 100稀释)即10 μ I血清加到Iml标本稀释液中，混匀。2.必须满足的实验条件2.1将试剂盒从2 8 °C冰箱内取出，置室温放置30分钟。2. 2使用酶标仪测定的波长为450nm。2. 3调整水浴箱的温度为37°C。3.试剂盒中的阴阳性对照品每孔加100 μ I。
4.操作步骤加样量(μI)
孔另Ij阴件孔(设复孔)阳件孔待测样本孔阴性对照100——阳性对照-100-样本稀释液--100 (2 滴)待测样本--100轻振混匀，37°c温育30mim，洗涤液注满各孔，静置10秒钟扣干，重复4次酶标抗体100(2 滴)100 (2 滴)100(2 滴)轻振混匀，37°C温育30mim，洗涤液注满各孔，静置10秒钟扣干，重复4次加入显色底物A液和B液各50 μ I/孔，轻振混匀，室温避光放置10-15分钟，加终止液50μ I/孔，轻微振荡以混合溶液，放置室温5分钟。
在15分钟内用酶标仪检测，在波长450纳米处读取各孔OD值。
5.质量控制
试剂盒阳性对照品与阴性对照品的平均相对OD比值应不小于3。
6.结果计算
计算每个对照品、样本的平均OD值，并根据样本与阴性对照OD的比值来判定样本的阴阳性。
试剂盒Cut off值
Cut off值=阴性对照平均OD值X 2. I
血清样本的与阴性对照OD值的比值彡Cut off值为阳性(+)；
血清样本的与阴性对照OD值的比值< Cut off值为阳性(_)。
实施例7试剂盒特异性与准确性试验
分别取实施例4和5制备的试剂盒(酶联板上包被有实施例I制备的Cox B组抗原)，采用实施例6的方法检测样本，同时采用中和试验作对比，观察其特异性及准确性。
CoxB IgG/测定试剂盒 (酶联免疫法)匚3和试验总计阳性阴性阳性80O80阴性7258265总计87258345阴性符合率=100%X [258/(0+265)] = 97. 36%
权利要求
1.一种CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，包括多孔酶联板，分别装有样品稀释液、阳性对照、阴性对照、IgG酶标抗体或IgM酶标抗体、底物A、底物B、浓缩洗涤液和终止液的试剂瓶，所述多孔酶联板的微反应孔的内壁包被有CoxB组抗原。
2.如权利要求I所述CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，多孔酶联板上包被的CoxB组抗原的主要成分为经纯化并完全灭活的Cox BUCox B2、Cox B3、Cox B4、 Cox B5和Cox B6病毒的混合。
3.如权利要求I所述CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，所述CoxB组抗原采用包括下列步骤的方法制备获得1、病毒扩增将选自CoxBUCox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6病毒中之任一的毒种接种至单层的Hela细胞中培养获得细胞病毒液；2、病毒释放将细胞病毒液重复冻融三次以上，而后在冰水浴中超声波破碎细胞；3、病毒灭活将重复冻融三次以上的细胞病毒液或经超声波破碎细胞的细胞病毒液完灭活，灭活的细胞病毒液经病毒灭活试验检验需呈阴性；4、病毒抗原纯化4. I将经病毒释放与病毒灭活的细胞病毒液置于18-20°C融解适当时间后，加入甲醛水溶液混合均匀，甲醛在混合液中的终浓度为O. 12-0. 20v% ；4. 2混合液梯度离心分离病毒4.3分离出的病毒加入保护液获得病毒抗原液；5、利用步骤1-4 分别制备 Cox BI、Cox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5 和 Cox B6 的病毒抗原液，将制得的Cox BUCox B2、Cox B3、Cox B4、Cox B5和Cox B6的病毒抗原液混合获得CoxB组抗原。
4.如权利要求3所述CoxB IgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，步骤4. 2中， 梯度离心分离病毒具体包括下列步骤4. 2. I混合液低速离心至少20分钟，取上清；4. 2. 2上清35000-45000rpm/min离心至少60分钟，取沉淀；4.2. 3沉淀用PBS溶解后，置于13-17wt%甘油水溶液之上，50000-65000rpm/min离心 60分钟以上，取沉淀，沉淀即为分离出的病毒。
5.如权利要求4所述CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，步骤4. 2. I 中，低速离心的离心速度为5000-8000rpm/min。
6.如权利要求4所述CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，步骤4. 2. 3 中，沉淀与PBS的体积比为I : (2-3)。
7.如权利要求3所述CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，其特征在于，步骤4. 3中， 所述病毒与保护液的体积比为I : (1-2)。
全文摘要
本发明公开了一种CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒，包括多孔酶联板，分别装有样品稀释液、阳性对照、阴性对照、IgG酶标抗体、底物A、底物B、浓缩洗涤液和终止液的试剂瓶各一瓶，所述多孔酶联板的微反应孔的内壁包被有CoxB组抗原。本发明的CoxBIgG/IgM酶联免疫法检测试剂盒特异性与灵敏度高，操作时间短，可用于多人份定性检测CoxBIgG/IgM。
文档编号G01N33/569GK102590504SQ20121002202
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者崔贻芬 申请人:上海尧浩生物技术有限公司