专利名称：金电极及其制备方法
技术领域：
本发明属于金电极及其制备方法。
背景技术：
自组装分子膜在20世纪80年代出现后迅速成为材料科学、微电子学、生物学等领域的研究焦点。通过设计不同自组装分子，可以得到各种功能界面，为人们的科学研究提供新的方法和手段。目前DNA生物传感器的DNA探针分子吸附方法主要有四种直接吸附经过修饰的核酸分子，吸附核酸探针之后用硫醇填冲、吸附硫醇之后用核酸分子置换以及核酸分子与硫醇同时混合吸附。直接在金电极上固定DNA核酸分子是自组装分子膜第一种固定的方法。这种方法有很严重的缺陷，核酸分子在金电极表面的吸附情况十分混乱，导致最终杂化反应的效率低下。后来的研究发现DNA碱基与金电极之间的吸引力由于氮-金化学键和聚こ烯(嘌呤)-金化学键的作用，牢固程度甚至比硫-金化学键还要高，所以核酸探针分子很容易“倒伏”在金电极表面。为了解决这个问题，Herne和Tarlov提出了用MCH作填充剂进行重填，这种方法可以把吸附方式不正确、吸附不牢的核酸分子置换掉，并且可以防止待测核酸分子吸附到金电极表面。但这种方法也是有缺陷的。首先就是可重复性问题；其次这种方法很受DNA 的序列影响。另外，还有学者声明，用MCH进行快速处理没法完全去掉吸附错误的核酸探针分子。为了解决DNA碱基会吸附在金电极表面的问题，有人提出了在加入DNA核酸探针前先形成一个致密均匀的新表面的方法。具体的做法就是在吸附DNA核酸探针分子之前先在金电极表面制备ー层致密的MCH薄膜。这种方法制备的自组装分子膜的探针分子密度取决于纯MCH膜的微孔密度和缺陷密度，而这两个密度都是不可预知也不可控制的。且重复
性非常差。通过同时吸附烷基硫醇和DNA核酸探针分子制备出来的混合自组装分子膜最近被研究的很多。在混合溶液中同时吸附得到的自组装分子膜的密度决定于ー个平衡过程， 这使得最終得到的分子膜密度对吸附时间、分子运动、探针序列不敏感。有很多学者采用类似的方法都制备出了 4 5 X IO12分子/平方厘米的自组装分子膜。然而，目前在金电极表面形成自组装分子膜的方法仍有待改进。
发明内容
本发明g在至少解决上述技术问题之一。因此，本发明的目的是在同时吸附烷基硫醇和DNA核酸探针分子之后，添加ー个重填的步骤，填充剂使用较高浓度的硫醇溶液。重填的步骤使自组装分子膜形成致密的膜结构，获得稳定的电化学特性。本发明是基于以下两个资助完成的，在此表示感谢
I.国家自然科学基金项目项目名称基于电场诱导的核酸混合自组装分子膜属性控制原理和方法研究，项目批准号51105222。2.摩擦学国家重点实验室自主研究课题项目名称核酸探针混合自组装分子膜属性控制技术的研究，项目批准号SKLT10B02。根据本发明的ー个方面，本发明提供了ー种在金电极表面形成自组装分子膜的方法。根据本发明的实施例，该方法包括将DNA溶液与第一硫醇溶液混合，以便得到含有DNA 和硫醇的混合液；将金电极置于含有DNA和硫醇的混合液中，以便在金电极表面形成初级自组装分子膜；以及将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，以便在金电极表面形成自组装分子膜。发明人发现，利用该方法在金电极表面形成自组装分子膜， 金电极上吸附方式不正确，吸附不牢的核酸分子能够被硫基己醇(MCH)分子置换掉，从而能够提高自组装分子膜的成膜质量。根据本发明的实施例，利用本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备自组装分子膜，无需复杂设备，简单易行，可重复性好，并且成本低，形成的自组装分子膜排列密度高、缺陷密度小、电化学特性稳定，质量非常好。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，DNA 溶液可以为DNA的TE溶液，第一硫醇溶液可以为MCH的こ醇溶液。这是因为TE溶液呈弱碱性，对DNA的碱基有保护作用，DNA在TE溶液中具有稳定性较好、完整性高、无产生开环及断裂现象等特点；MCH易溶于こ醇，こ醇溶液常被用作MCH的溶解液。由于位阻现象和静电排斥，探针分子密度会明显影响杂化反应。研究表明，杂化反应在探针密度为4X IO12分子/平方厘米时效率达到最高，当探针密度再上升时杂化效率会急剧下降。因此，精准地控制探针密度对核酸检测很重要。相应地，在金电极表面形成自组装分子膜时，需要严格控制 DNA和MCH的浓度，制备所需探针密度的自组装分子膜。此外，由于DNA分子的分子量大，则实验中所采用的DNA溶液的最适浓度一般在微摩级别。根据本发明的一些实施例，DNA溶液中DNA的浓度为20微摩，第一硫醇溶液中MCH的浓度为I毫摩。此外，根据本发明的另一些实施例，DNA溶液与第一硫醇溶液的体积比可以为I : I 5，由此得到的探针密度与最优探针密度值最接近，从而能够提高所形成的自组装分子膜的质量。DNA分子都带负电，相互之间会有排斥力，因此无法形成致密的分子膜；而在SPB 溶液中，由于溶液的正离子浓度极高，正电荷可以吸附到DNA分子上，中和掉其原来带的负电荷，大大减小了核酸分子之间的排斥力，从而可以提高DNA分子膜的密度。因此，可以将 DNA溶液与SPB溶液混合后，用以制备形成自组装分子膜。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，含有DNA和硫醇的混合液是通过将DNA溶液、 第一硫醇溶液和SPB溶液混合得到的，其中，SPB溶液可以含有
嶙酸ニ氢钾0.0127摩尔
嶙酸氢ニ钾0.0272摩尔
硫酸钾13.94克
去离子水
补足至200毫升，
SPB溶液、DNA溶液与第一硫醇溶液的体积比为94 : 5 : I。其中，SPB溶液是高离子强度的磷酸缓冲溶液，PH = 7.0，200mM PB+400mM K2S04。由此，将金电极置于含有DNA 和硫醇的混合液中后，能够成功地在金电极表面形成致密的初级自组装分子膜。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，第 ニ硫醇溶液可以含有10 毫摩 MCH10 毫升こ醇10毫升去离子水补足至100毫升。由此，将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中后，第二硫醇溶液中的MCH分子能够置换掉ー些吸附方式不正确、吸附不牢的DNA探针分子，从而成功地在金电极表面形成排列密度高、缺陷密度小、电化学特性稳定的自组装分子膜。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，在将金电极置于含有DNA和硫醇的混合液中之前，可以通过机械抛光和电化学抛光的至少ー 种，对金电极的表面进行抛光处理。这是由于自组装分子膜是吸附在金电极表面形成，如果金电极表面粗糙度高，会大幅度增加自组装薄膜缺陷密度。由此，经过抛光处理的金电极表面能够提高DNA和硫醇于金电极表面的吸附量，从而能够提高所制备自组装分子膜的排列密度以及电化学稳定性。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，将金电极置于含有DNA和硫醇的混合液中的时间不受特别限制。由于烷基硫醇的自组装过程強烈的依赖于其浓度，而实验所采用的DNA和硫醇在混合液中的浓度为微摩级别，以及考虑实验的可行性，因此，根据本发明的ー些具体示例，将金电极置于含有DNA和硫醇的混合液中16-20个小吋。由此，能够使DNA和硫醇充分吸附于金电极表面，从而能够形成初级自组装分子膜。根据本发明的实施例，在本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法中，将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中的时间不受特别限制。根据本发明的ー些具体示例，将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中2小吋。 由此，能够使MCH充分地置换掉金电极表面初级自组装分子膜上一些吸附方式不正确、吸附不牢的核酸分子，从而能够形成排列密度高、缺陷密度小、电化学特性稳定的自组装分子膜。具体地，根据本发明的实施例，本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法， 可以包括以下步骤将DNA和MCH的混合物于洁净金基底上自组装成膜，混合物DNA、MCH溶液以一定比例混合；再以较高浓度MCH溶液进行填充，自组装成致密稳定的分子膜。 更具体地，根据本发明的一些实施例，本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法，还可以包括以下步骤a)将金电极进行预处理先将金电极进行机械抛光5min、超声处理5min，再将其于烯酸环境下进行电化学抛光，使金电极表面洁净；b)将经过处理的金电极浸入含有DNA和MCH的混合液中，以便在金电极上形成初级自组装分子膜；c)MCH重填将表面形成初级自组装分子膜的金电极再浸入较高浓度的第二硫醇溶液中进行重填，以便在金电极表面形成自组装分子膜。根据本发明的另一方面，本发明提供了ー种金电极，其表面形成有自组装分子膜。 根据本发明的实施例，该自组装分子膜是根据本发明在金电极表面形成自组装分子膜的方法形成的。发明人惊奇地发现，本发明的金电极及其表面的自组装分子膜具有成本低，排列密度高、缺陷密度小、电化学特性稳定的优点。此外，根据本发明的实施例，利用本发明形成的有自组装分子膜的金电极，能够方便有效地作为DNA探针或DNA生物传感器。需要说明的是，本发明的金电及其制备方法，是本申请的发明人通过艰苦的创造性劳动和优化的工作才完成的。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图I :显示了根据本发明的一个实施例，利用本发明的在金电极表面形成自组装分子的方法制备金电极时，金电极表面电量和时间的关系图；图2 :显示了根据本发明的一个实施例，利用本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备金电极时，含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比与获得的金电极表面的Ru(NH3)63+吸附量的关系图；以及图3:显示了根据本发明的一个实施例，利用本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备金电极时，含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比与获得的金电极表面的探针密度的关系图。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例仅仅是为了说明本发明，而不对本发明的范围作出任何限制。在下列实施例中所采用的所有材料均是エ业上常用的，均为市售可得的。一般方法I.配置溶液I. I配置含有DNA和硫醇的混合液含有DNA和硫醇的混合液的配置分为三步进行，首先配置SPB溶液(根据Buffer Calculator 计算 PH = 7. 0，200mMPB+400mMK2S04)、DNA 的 TE 溶液、第一硫醇溶液(ImM)，然后将SPB溶液、DNA的TE溶液以及第ー硫醇溶液(ImM)混合而制成溶液，具体配置过程如下a)首先，按照下列配方配置200mL的SPB溶液(根据Buffer Calculator计算， PH = 7. 0，200mMPB+400mMK2S04)，备用嶙酸ニ氢钾(KH2PO4 )0.0127mol
嶙酸氢ニ钾(K2HPO4)0.0272mol
硫酸钾(K2SO4)13.94g
去离子水补足；b)其次，按照下列配方配置DNA的TE溶液，备用根据DNA购买的说明书可先得到100微摩DNA的TE溶液，再利用TE溶液将其稀释到20微摩；c)再按下列配方配置IOOmL第一硫醇溶液(ImM)，备用硫醇(MCH-97%)14. 10 微升こ醇(CH3CH2OH)补足。然后，将以上得到的三种溶液SPB溶液、DNA的TE溶液以及第ー硫醇溶液按照比例94 5 I配置成含有DNA和硫醇的混合液，备用。I. 2配置第二硫醇溶液首先，按照下列配方先配置IOOmL硫醇的こ醇溶液(IOmM)，备用硫醇(MCH-97%)141. 00 微升こ醇(CH3CH2OH)补足；然后，按照以下配方配置IOOmL的第二硫醇溶液，备用硫醇(上面配置的IOmM) IOmLこ醇(CH3CH2OH)IOmL去离子水补足。2.制备金电极I.米用机械抛光和电化学抛光(在烯酸环境下进行CV扫描)相结合的方法将金电极表面清洗干净，然后保存于去离子水中；2.将金电极置于上述获得的含有DNA和硫醇的混合液中进行培养16_20个小时， 以便在金电极表面形成初级自组装分子膜；3.利用去离子水将表面形成初级自组装分子膜的金电极进行冲洗，然后再将该金电极置于第二硫醇溶液中培养2小吋，以便在金电极表面形成自组装分子膜。实例I :按照一般方法制备金电极，其中，分别将金电极置于上述获得的含有DNA和硫醇的混合液中进行培养16-20个小时,其中含有DNA和硫醇的混合液中的DNA、第一硫醇溶液是以I : 10混合的。然后，采用计时电量法，按照以下步骤测量并计算制备的金电极表面的Ru(NH3)63+吸附量，其中所采用的电势范围为-300mv -800mv，测量时间为500ms 首先将制备的金电极置于空白液，即PH = 7. 4，IOmM的Tris-HCl溶液中，对其进行测量得到第一曲线；接着，向上述空白液中加入浓度为100微摩的Ru(NH3)63+溶液(DNA的每个磷酸基团带ー个负电荷，其能与Ru(NH3)63+发生吸附作用)，并对其进行测量得到第二曲线；然后，基于前述两曲线，作两曲线的切线并得到截距，通过截距差求得Ru(NH3)63+的吸附量r Q (単位mol/cm2)，然后由计时电量法的公式Q = 2nFAC*(Dt/ ) 1/2+Qdl+nFA r Q (其中n为氧化还原转移的电子数，F为法拉第常数，A为金电极表面积，C*为Ru(NH3)63+的本体溶度，D为Ru(NH3)63+的扩散系数，t为时间，Qdl为双电层的电量，h为吸附物的吸附量)计算得出金电极表面的电量，井分别以金电极表面电量和时间为横纵坐标作图，结果见图I。 图I显示了利用本发明的在金电极表面形成自组装分子的方法制备金电极时，金电极表面电量和时间的关系图。如图I所不，纵坐标为金电极表面的电量Q，横坐标为时间的平方根 t1/2。需要说明的是，由于仪器等原因，实验得到的Q_t1/2曲线并不为一直线，故作其切线而求之。实例 2 基于实例I所获得的根据本发明的方法制备的金电极表面的Ru (NH3) 63+吸附量，可以得到含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比分别为I : 10、I 5、I I时所对应的吸附量rQ，从而能够得到含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比与获得的金电极表面的Ru(NH3)63+吸附量r ^的关系，并以其相对应的表面形成初级自组装分子膜的金电极的吸附量作为对照，作出含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比与获得的金电极表面的Ru (NH3)63+吸附量し的关系图，结果见图2。如图2所示，纵坐标为金电极表面的Ru (NH3) 63+吸附量r 0 (单位mol/cm2);横坐标为DNA MCH,表示含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比；红线为DNA+MCH+重填，表示根据本发明实施例的在金电极表面形成自组装分子膜的方法所得到的金电极，其表面的Ru(NH3)63+吸附量与含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比的关系曲线；而蓝线为DNA+MCH，表示根据本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备金电极时，不进行重填步骤，即仅在金电极表面形成初级自组装分子膜，不将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，由此得到的金电极表面的Ru(NH3)63+吸附量与含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比的关系曲线。由图2可知，含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比相同时，经重填后在金电极表面形成自组装分子膜的金电极，比仅在表面形成初级自组装分子膜的金电极对Ru (NH3) 63+的吸附量r 0高，表明将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，能够显著増加金电极表面对Ru(NH3)63+的吸附量。实例3 根据公式rDNA= r0(z/m)NA,由实例2中所得到的含有DNA和硫醇的混合液中DNA 和硫醇的体积比与获得的金电极表面的Ru(NH3)63+吸附量し的关系图中，不同比例的含有 DNA和硫醇的混合液所对应的吸附量r ^，求得探针DNA的密度rDNA，其中rDNA为探针DNA 的密度(单位个/cm2), m为碱基数，z为吸附离子所带电荷数。然后基于探针DNA的密度，得出含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比与获得的金电极表面的探针密度的关系图，结果见图3。如图3所示，纵坐标为金电极表面的探针密度(単位个/cm2);横坐标为DNA MCH,表示含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比；红线为DNA+MCH+ 重填，表示根据本发明实施例的在金电极表面形成自组装分子膜的方法所得到的金电极， 其表面的探针密度与含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比的关系曲线；而蓝线为DNA+MCH，表示根据本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备金电极时，不进行重填步骤，即仅在金电极表面形成初级自组装分子膜，不将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，由此得到的金电极表面的探针密度与含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比的关系曲线。由图3可知，含有DNA和硫醇的混合液中DNA和硫醇的体积比相同时，经重填后在金电极表面形成自组装分子膜的金电极，比表面形成初级自组装分子膜的金电极表面的探针密度高，表明将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，能够显著増加金电极表面的探针密度。在本说明书的描述中，參考术语“ー个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“ー些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少ー个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗g的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.ー种在金电极表面形成自组装分子膜的方法，其特征在于，包括将DNA溶液与第一硫醇溶液混合，以便得到含有DNA和硫醇的混合液；将所述金电极置于所述含有DNA和硫醇的混合液中，以便在所述金电极表面形成初级自组装分子膜；以及将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，以便在所述金电极表面形成自组装分子膜。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述DNA溶液为DNA的TE溶液，所述第一硫醇溶液为MCH的こ醇溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DNA溶液中DNA的浓度为20微摩，所述第一硫醇溶液中MCH的浓度为I毫摩。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将DNA溶液、第一硫醇溶液和SPB溶液混合，以便得到含有DNA和硫醇的混合液，其中，所述SPB溶液含有嶙酸ニ氢钾0.0127摩尔嶙酸氢ニ钾0.0272摩尔硫酸钾13.94克去离子水补足至200毫升，所述SPB溶液、DNA溶液与第一硫醇溶液的体积比为94 : 5 : I。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述第二硫醇溶液含有10毫摩MCH10毫升こ醇10毫升去离子水补足至100毫升。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，在将所述金电极置于所述含有DNA和硫醇的混合液中之前，通过机械抛光和电化学抛光的至少ー种，对所述金电极的表面进行抛光处理。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在干，将所述金电极置于所述含有DNA和硫醇的混合液中16-20小吋。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在干，将所述表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中2小吋。
9.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述DNA溶液与第一硫醇溶液的体积比为 I I 5。
10.一种金电扱，其特征在干，所述金电极表面形成有自组装分子膜，所述自组装分子膜是根据权利要求1-9任一项所述的方法形成的。
全文摘要
本发明涉及金电极及其制备方法。其中，在金电极表面形成自组装分子膜的方法包括将DNA溶液与第一硫醇溶液混合，以便得到含有DNA和硫醇的混合液；将金电极置于含有DNA和硫醇的混合液中，以便在金电极表面形成初级自组装分子膜；以及将表面形成初级自组装分子膜的金电极置于第二硫醇溶液中，以便在金电极表面形成自组装分子膜。利用本发明的在金电极表面形成自组装分子膜的方法制备的自组装分子膜排列密度高、缺陷密度小、电化学特性稳定。
文档编号G01N27/327GK102608185SQ201210082608
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月26日 优先权日2012年3月26日
发明者刘大猛, 留丽霞 申请人:清华大学