专利名称：甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法
甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法本发明属于生物体外诊断试剂技术领域，具体涉及ー种甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法。ELISA试剂的具体检测方法很多，各种方法都不可缺少酶结合物。酶结合物在ELISA实际中非常关键，其灵敏度、显色背景和稳定性对试剂质量至关重要。高灵敏度、低显色背景和良好的稳定性是高品质ELISA试剂所要达到的基本要求。酶结合物的灵敏度在很大程度上是由其自身的性质决定的，但酶结合物所用稀释液对其灵敏度有一定的影响，酶稀释液的良好与否还对酶结合物的稳定性和显色背景有非常明显影响。因此，制备性能良好的酶稀释液是ELISA试剂生产的重要环节。 常见的用于甲状腺素酶稀释液一般使用缓冲系统(如PBS)、小牛血清(或牛血清白蛋白等)、解离剂、防腐剂及表面活性剂等制备而成。但用该稀释液制备的工作浓度酶结合物稳定性较差，有效期很短。为了保持酶结合物的稳定，传统的酶联免疫体外诊断试剂中的酶结合物是以浓缩液的形式储存的，当使用时用酶稀释液作适当倍数的稀释，现配现用，一般在2-8°C保存不超过一周。用户使用比较麻烦，而且往往由于稀释液误差造成实验结果不准确。如何提高酶联免疫体外诊断试剂中的酶结合物的稳定性，又能方便检验人员的使用，是众多诊断试剂制造商长期以来努力解决的问题。本发明为了克服现有技术的不足，提供了ー种甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法。为了实现上述目的，本发明设计了ー种甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，包括以下步骤，在500ml蒸馏水中依次加入下列物质A)配制缓冲液，pH值为7. 0-8. 0 ；B)在上述缓冲液中加入明胶，浓度为0. 3-1. 3g/L，加热搅拌，使其充分溶解；C)加入BSA，浓度为0. 5-1. 5g/L，搅拌，使其充分溶解；D)加入解离剂，浓度为0. 2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解；E)加入Tween-20，浓度为0. lml/L-1. 2ml/L，搅拌，使其充分溶解；F)加入Proclin300，浓度为0. 2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解；G)加入酚红I %的无水こ醇溶液1ml，终浓度为l_2ml/L，搅拌，使其充分溶解；H)待充分溶解后补足蒸馏水至IL ；I)最后用IOM NaOH或IOM HCL调pH值为7. 0-8. 0得到酶稀释液；J)将浓缩酶结合物以所需的比例加入到上述酶稀释液中充分混匀即可。
所述缓冲液为浓度为0. 05M-0. 2M PBS或浓度为0. 01-0. 2M Tris-HCL缓冲液。所述解离剂为ANS解离剂。所述的酶结合物为使辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶与抗原或抗体通过化学交联而成的复合物。所述浓缩酶结合物与酶稀释液的比例为I : 2000。 本发明同现有技术相比，通过改进酶联免疫体外诊断试剂中的酶稀释液来提高酶结合物的稳定性，提高灵敏度。下面结合实施例对本发明作进ー步描述。 实施例I :在500ml蒸馏水中依次加入下列物质。A)配置Tris-HCL缓冲液，其中Tris 12. Ilg ；HCL 49ml ；缓冲液的pH值为7. O-8. 0 oB)在上述缓冲液中加入明胶0. 5g，终浓度为0. 3-1. 3g/L，加热搅拌，使其充分溶解。C)加入BSA 0. 5g，浓度为0. 5-1. 5g/L，搅拌，使其充分溶解。D)加入ANS 0. 5g，浓度为0. 2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解。E)加入 Tween-200. 5ml，浓度为 0. lml/L-1. 2ml/L，搅拌，使其充分溶解。F)加入Proclin3000. 5ml，浓度为0. 2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解。G)加入酚红(1%的无水こ醇溶液)lml，终浓度为l_2ml/L，搅拌，使其充分溶解。H)待充分溶解后补足蒸馏水至1しI)最后用IOM NaOH或IOM HCL调pH值为7. 4得到酶稀释液。J)将浓缩酶结合物以I : 2000的比例加入到上述酶稀释液中充分混匀即可。实验ー用抗T4-HRP酶结合物溶液(I 2000)检测血清或血浆标本中的T4，采用如下步骤(I)在已包被T4_IgG抗原的微孔板中依次加入标本50ul，同时做两孔阴性对照、一孔阳性对照、一孔空白对照，然后每孔(除空白对照孔外)加入本发明实施例I制备的抗T4-HRP酶结合物溶液50ul，置37°C孵育30分钟。(2)弃去孔内液体，用洗涤液洗板5次。(3)各孔加底物溶液A 50ul，底物液B 50ul，置37°C孵育15分钟。(4)各孔加终止液50ul,终止反应。(5)将反应板置酶标仪比色计450nm波长处用空白孔校零，读取各孔OD值。(6)计算，CutOff值=(阴性对照平均OD值+阳性对照平均OD值)X0. 5。(7)结果判断标本OD值小于CutOff值为阳性，大于或等于CutOff值为阴性。在已包被T4_IgG抗原的微孔板中加入经系列稀释的抗体，按照常规反应过程进行试验，分别对比传统甲状腺素酶结合物和本发明酶结合物，加显色剂显色，用2M硫酸溶液終止反应后，在酶标仪上读数，结果如下
权利要求
1.ー种甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，包括以下步骤，在500ml蒸馏水中依次加入下列物质 A)配制缓冲液，pH值为7.0-8. 0 ； B)在上述缓冲液中加入明胶，浓度为0.3-1. 3g/L，加热搅拌，使其充分溶解； C)加入BSA，浓度为0.5 -1. 5g/L，搅拌，使其充分溶解； D)加入解离剂，浓度为0.2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解； E)加入Tween-20，浓度为0.lml/L-1. 2ml/L，搅拌，使其充分溶解； F)加入Proclin300，浓度为0.2-1. 2g/L，搅拌，使其充分溶解； G)加入酚红I%的无水こ醇溶液1ml，终浓度为l_2ml/L，搅拌，使其充分溶解； H)待充分溶解后补足蒸馏水至IL； I)最后用IOMNaOH或IOM HCL调pH值为7. 0-8. 0得到酶稀释液； J)将浓缩酶结合物以所需的比例加入到上述酶稀释液中充分混匀即可。
2.根据权利要求I所述的甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，其特征在于所述缓冲液为浓度为0. 05M-0. 2M PBS或浓度为0. 01-0. 2M Tris-HCL缓冲液。
3.根据权利要求I所述的甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，其特征在于所述解离剂为ANS解离剂。
4.根据权利要求I所述的甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，其特征在于所述的酶结合物为使辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶与抗原或抗体通过化学交联而成的复合物。
全文摘要
本发明属于生物体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种甲状腺素酶联免疫体外诊断试剂盒中酶结合物稀释液的制备方法，其步骤为在500ml的蒸馏水中依次加入下列试剂，待前一种溶解后再加入后一种；Tris；HCL；明胶；BSA；ANS；Tween-20；Proclin300；酚红；待充分溶解后补足蒸馏水至1L；用NaO或HCL调PH值为7.4。将浓缩酶结合物以所需的比例加入到上述酶稀释液中充分混匀。本发明同现有技术相比，通过改进酶联免疫体外诊断试剂中的酶稀释液来提高酶结合物的稳定性，提高灵敏度。
文档编号G01N33/535GK102645530SQ20121009959
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者曹纹野, 李子樵 申请人:上海蓝怡科技有限公司