专利名称：促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂及其制备方法
促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂及其制备方法本发明涉及ー种诊断试剂，具体的说是ー种用于促卵泡成熟激素(FSH)荧光磁微粒酶免检测试剂和制备方法。卵泡刺激素又称促卵泡激素(Follicle Stimulating Hormone, FSH)是一种糖蛋白激素，分子量约为30KD，属于糖蛋白激素家族。FSH是由两个非共价结合可解离的亚基所组成，称为a-亚基和￠-亚基，在同一种内a-亚基是确定的，甚至在所有哺乳动物中的a-亚基的氨基酸序列都是保守的，它们的a-亚基可以互换，而￠-亚基不能互換，￠-亚基具有激素各自的特异性，又具有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素。a -亚基和P -亚基单独都不具有生物活性，只有当两者结合在一起引起立体结构上的变化，才具有生物活性。FSH能促进颗粒细胞增生、刺激类固醇生成、调节配子细胞的发育和成熟，是下丘脑-垂体-性腺轴中的主要激素之一。在动物繁殖育种、超数排卵、胚胎移植、卵母细胞成熟、体外受精和人类相关疾病的诊断治疗等领域具有十分广阔和诱人的应用前景。对于女性，该激素在下丘脑-垂体-卵巢调节环路中发挥作用，控制月经周期。FSH和LH从垂体的促性腺细胞中阵发性释放。血中的浓度由类固醇类激素通过下丘脑的负反馈机制控制。在卵巢中FSH和LH—起刺激卵泡的成长和成熟，进而刺激卵泡中雌激素的生物合成。FSH水平在月经周期的中期呈现一高峰，尽管不如LH明显。由于卵巢功能的变化和雌激素水平的下降，绝经期FSH达到高水平。对于男性，FSH能够调节细精管的发育以及精子发生过程。然而，与雌激素不同，雄性激素不能够降低FSH的水平，因此也意味着男性体内的FSH水平只受血清中LH的调节。少精症和无精症的患者通常会出现FSH升高，但具体机制尚不清楚。睾丸肿瘤患者血清中FSH的浓度一般会降低。男性体内出现高水平的FSH时，可能为原发性睾丸衰竭或先天性睾丸发育不全。FSH检测对查明下丘脑-垂体-卵巢系统的功能失常有作用。FSH和LH检测用于先天性的疾病，如染色体异常的先天性疾病、闭经(病因)、多囊性卵巣(PCO)和绝经期综合征等。荧光免疫分析技术早在20世纪40年代就有应用，当时是用荧光素标记抗原或抗体，但由于高本底和检测仪器的灵敏度低，一直未能实现荧光免疫分析的临床应用。此后，又发展了ー项新的技术，微粒子荧光免疫分析，即利用发光的化学反应chemiluminescence,CL)和生物反应(bioluminescence,BL)分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。这ー方法，从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段，近十年来获得了很大的发展。荧光微粒酶免法以其灵敏度高，快速(几秒钟内产生发光信号)，简便，测试中不使用有害的试剂，因此成为非放射性免疫分析法中很有前途的方法之一。
荧光磁微粒酶免法，无论从灵敏度、检测时间、线性范围、试剂的稳定性、有无环境污染等方面对比，其优势都极为突出。而目前国内荧光磁微粒酶免检测项目的开展，主要依赖国外的全自动测定仪器与配套试剂，价格昂贵，因而增加了医患双方的负担。本发明为了克服现有技术的不足，提供了一种促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂。为了实现上述目的，本发明设计了ー种卵促泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试齐U，其特征在于包括磁珠，以及与磁珠结合的酶结合物，所述的酶结合物为采用AP标记的促卵泡成熟激素抗体，所述的磁珠包被有促卵泡成熟激素抗体。 所述的酶结合物包括缓冲液25-250mmol/L，稳定剂l-20mmol/L，电解质50-300mmol/L,促进剂4_5mmol/L,防腐剂2_5mmol/L ;其余为去离子水。所述磁珠的微粒直径为1-1. 5_。所述缓冲液为Mes缓冲液、磷酸缓冲液、或甘氨酸缓冲液中的ー种，缓冲液的PH值为6-8 ;所述的防腐剂为叠氮化钠。促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂的制备方法，采用如下エ艺步骤缓冲液在常温下稀释促卵泡成熟激素抗体和磁微粒球，抗体和磁微粒球的比例为I至4 1，将两者混匀后振荡吸附16至24小时，加入缓冲液封闭2至3小时，去除封闭液即可。本发明同现有技术相比，可以应用到市面上以荧光磁微粒酶免法为检测手段的仪器上，且具有简便，快速，稳定的检测能力，可以替代外国高昂的试剂。下面结合实施例对本发明作进ー步描述。本发明包括磁珠，以及与磁珠结合的酶结合物，酶结合物为采用AP标记的促卵泡成熟激素抗体，磁珠包被有促卵泡成熟激素抗体。一、FSH免疫反应试剂的制备，采用如下エ艺步骤a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混匀，加入去离子水定容至IOOOml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量卵泡成熟激素抗体混匀，然后加入磁珠混匀器中，每12颗磁珠IOOul包被液，4度20小时。b.封闭弃去包被液，加入含有1% BSA和0. 5%防腐剂(叠氮化钠)的磷酸盐缓冲液(PH7. 4)，再加入每12颗磁珠300ul的封闭液进行封闭，37度3小吋。c.封装弃去封闭液，进入烘箱烘干，温度为37度，烘干时间为4小吋，以每组试剂中放12颗磁珠，分装到每个试剂杯中。d.酶标志物的制备用含有2.5%BSA、1.5%的脱脂奶粉和0.05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(PH7. 4)配制缓冲系统。卵泡成熟激素抗体用过碘酸盐氧化法与碱性磷酸酶交联。配制成I : 1000的浓度分装到每个试剂杯中。e.冻干预冻；_35°C箱体预冻2h_3h。一次冻干_30で恒温抽真空，箱体真空度在10-30pa，持续12h-15h。二次冻干一次冻干结束后，升温至25°C，然后25°C恒温保持2h-3h。
f.封ロ 用封ロ器将姆一个试剂杯ロ封好。g.分装每20个试剂杯排放于一个试剂板上，并保存在铝制的防湿袋中。ニ、FSH试剂的使用方法A)从铝片保护层中取出FSH免疫反应试剂杯。B)在试剂杯中加入10 0微升缓冲液和50微升标准品或稀释液后的样品溶液,在磁石磁珠振动器上搅拌，在37度的室温下，使抗原抗体反应10分钟。C)用洗脱液冲洗试剂杯，除去其中游离的酶联标记物和样品成分。D)加入基质液后，在磁石磁珠振动器上搅拌，同时用荧光检测器检测荧光物质的荧光强度，激发波长363mm，荧光吸收波长447mm，并计算出荧光物质的生成速度。E)根据标准液检测绘制的荧光物质生成速度标准曲线，计算出样品FSH的浓度。如果检测结果超过200mIU/ml时，要用样品稀释液提高稀释倍数重新稀释。三、实验结果的计算作图法以标准品抗原含量的Ig值为横坐标(X)，以其对应的信号值为纵坐标(y)绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的rate值在标准曲线上查出相应的抗原含量Ig值，从而计算出抗原的含量。计算法以标准品抗原含量值的Ig值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量(y)，求出回归方程，将待测样本的信号值带入回归方程，从而计算出相应的抗原的含量。
权利要求
1.一种促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂，其特征在于包括磁珠，以及与磁珠结合的酶结合物，所述的酶结合物为采用AP标记的促卵泡成熟激素抗体，所述的磁珠包被有卵泡成熟激素抗体。
2.根据权利要求I所述的促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂，其特征在于所述的酶结合物包括缓冲液25-250mmol/L，稳定剂l-20mmol/L，电解质50-300mmol/L，促进剂4-5mmol/L,防腐剂2_5mmol/L ;其余为去离子水。
3.根据权利要求I所述的促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂，其特征在于所述磁珠的微粒直径为1-1. 5mm。
4.根据权利要求2所述的促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂，其特征在于所述缓冲液为Mes缓冲液、磷酸缓冲液、或甘氨酸缓冲液中的ー种，缓冲液的PH值为6-8 ;所述的防腐剂为叠氮化钠。
5.一种促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂的制备方法，采用如下エ艺步骤缓冲液在常温下稀释促卵泡成熟激素抗体和磁微粒球,抗体和磁微粒球的比例为I至4 1，将两者混匀后振荡吸附16至24小时，加入缓冲液封闭2至3小时，去除封闭液即可。
全文摘要
本发明涉及一种诊断试剂，具体的说是一种促卵泡成熟激素荧光磁微粒酶免检测试剂，其特征在于包括磁珠，以及与磁珠结合的酶结合物，所述的酶结合物为采用AP标记的促卵泡成熟激素抗体，所述的磁珠包被有促卵泡成熟激素抗体。本发明同现有技术相比，可以应用到市面上以荧光磁微粒酶免法为检测手段的仪器上，且具有简便，快速，稳定的检测能力，可以替代外国高昂的试剂。
文档编号G01N33/74GK102621334SQ201210099609
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者李子樵, 许嘉悦 申请人:上海蓝怡科技有限公司