专利名称：检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
背景技术：
草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5_烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来,得到了广泛的应用。但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入作物，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护作物免受药害，最终达到增产增收的目的。目前，国际上在耐草甘膦转基因植物的研究方面，已经取得了突破性进展。美国孟山都(Mosanto)和Calegene等公司在基于对EPSP合成酶的编码基因aroA的研究，已获得耐草甘膦转基因大豆、玉米、油菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已经进入商品化生产。Mosanto公司生产的耐草甘膦二型转基因玉米在2007年的播种面积预计超过3200万英亩，相当于美国玉米播种面积的40%。2004年，中国农业科学院生物技术研究所发现了一个新的耐草甘膦基因G2-aroA (中国专利，申请号03826892. 2，授权公告号CN100429311C)。目前尚没有抗G2_aroA蛋白的单克隆抗体，也未见利用G2_aroA蛋白单克隆抗体鉴别转G2-aroA基因植物的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的酶联免疫试剂盒中含有独立包装的抗所述G2_aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9 ;所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5Fll产生；所述杂交瘤细胞株AntiG2_5Fll在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5772。所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗体和/或所述G2-aroA蛋白标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述多克隆抗体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫脊椎动物得到的。在本发明的一个实施例中，所述多克隆抗体具体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫家兔(体重约2kg的新西兰大耳白兔)得到的。所述G2-aroA蛋白标准品可为G2-aroA蛋白或由所述G2-aroA蛋白配制成的一系列不同浓度的G2_aroA蛋白溶液。所述一系列不同浓度的G2-aroA蛋白溶液具体可为从浓度为10 μ g/mL开始，按照2倍比进行稀释所得的溶液。所述G2-aroA蛋白溶液的溶剂具体可为PBST。所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的包被缓冲液和/或洗涤液和/或底物缓冲液和/或终止缓冲液和/或封闭液；在本发明的一个实施例中，所述包被缓冲液具体为碳酸盐缓冲液，其溶剂为水，Na2CO3和NaHCO3 ;溶质Na2CO3和NaHCO3在所述包被缓冲液中的浓度分别为15mM和35mM ;所述包被缓冲液的pH为9. 6。在本发明的一个实施例中，所述洗涤液具体为PBST，其溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2PO4、NaCl和吐温20 ; 溶质Na2HPO4、KH2PO4和NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为8. 3mM、I. 5mM和200mM ;所述吐温20在所述洗涤液中的体积百分含量为O. 1% ;所述洗涤液的pH为 7. 5。在本发明的一个实施例中，所述底物缓冲液具体为PNPP缓冲溶液，其溶剂为水，溶质为MgCl2和二乙醇胺；溶质MgCl2在所述底物缓冲液中的浓度为ImM ;所述二乙醇胺在所述底物缓冲液中的体积百分含量为9. 7% ;所述底物缓冲液的pH为9. 8。在本发明的一个实施例中，所述终止缓冲液具体为3M的NaOH水溶液；在本发明的一个实施例中，所述封闭液具体为3% (3g/100ml)的BSA，其溶剂为水，溶质为牛血清白蛋白(BSA)、Na2CO3和NaHCO3 ；Na2CO3和NaHCO3在所述封闭液中的浓度分别为15mM和35mM ;所述封闭液的pH为7. 5。在本发明的一个实施例中，所述标记酶具体为碱性磷酸酯酶。所述酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测所述G2-aroA蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。所述酶联免疫试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用也属于本发明的保护范围；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。在本发明的一个实施例中，所述待测植物具体为玉米，如玉米品种综31。所述酶联免疫试剂盒在定量检测G2-aroA蛋白含量中的应用也属于本发明的保护范围；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。由杂交瘤细胞株AntiG2-5Fll CGMCC No. 5772产生的单克隆抗体在制备所述的酶联免疫试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。利用本发明所提供的酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、特异性强的优点。保藏说明参椐的生物材料(株)AntiG2_5Fll科学描述小鼠杂交瘤细胞保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号保藏日期2012年2月7日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 577
图I为纯化后G2_aroA蛋白SDS-PAGE电泳鉴定图。其中，泳道I为蛋白Marker，自上到下依次为72KD、45KD、32KD、14. 4KD ;泳道2_4均为原核重组表达载体pET-28a-G2_aroA中表达后纯化所得的G2-aroA蛋白，上样量分别为5μ 1、10μ 1、15μ I。图2为SDS-PAGE检测纯化后单克隆抗体的纯度。其中，泳道I为蛋白Marker ;泳道2为纯化后的单克隆抗体，较大的目的条带为重链，较小的目的条带为轻链。图3为酶联免疫试剂盒检测G2_aroA蛋白浓度的标准曲线。图4为重组表达载体pS3300-UMG2的质粒图谱。图5为载体pS3300-UG0的质粒图谱。图6为转G2_aroA基因玉米的PCR鉴定图谱。其中，泳道I为阳性对照；泳道2为DNA Marker (D2000);泳道3为空白对照组；泳道4为阴性对照组；泳道5_24为20株转G2-aroA基因玉米植株。图7为转G2-aroA转基因玉米植株的草甘膦耐性田间鉴定图。其中，I所示一行玉米为mG2-aroA转基因玉米植株；2所示一行玉米为空载体转基因玉米植株；3所示一行玉米为未转基因的玉米植株。图8为载体pUC19-UG2的质粒图谱。图9为载体pCAMBIA3300的质粒图谱。图10为载体pS3300的质粒图谱。图11为重组表达载体pS3300-UG2的质粒图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。弗氏完全佐剂北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM001 ；弗氏不完全佐剂北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM002 ；HAT :北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM003 ；PEG4000 :北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM005 ；RPMI 1640培养基北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM006 ；胎牛血清(FBS):北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CWM007 ；山羊抗小鼠I gG (H+L) -HRP :北京康为世纪生物科技有限公司，产品目录号为CffO102 ；K8 :孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810的提取液。。实施例I、杂交瘤细胞株的获得及抗G2_aroA蛋白单克隆抗体的制备Balb/C小鼠北京维通利华实验动物有限公司Sp2/0 :北京康为世纪生物科技有限公司、
一、免疫原S780的制备将序列I所示的DNA片段连接到原核表达载体pET_28a(+)的多克隆位点中，得到表达G2_aroA蛋白的原核表达载体pET-28a-G2_aroA。将pET-28a-G2_aroA转化大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导其表达G2-aroA蛋白，收集菌体后，将菌体通过超声波破碎，将所表达蛋白释放到提取液中，后用His标签蛋白纯化试剂盒(购自北京康为世纪生物科技有限公司，目录号CW0009A)纯化，G2-aroA蛋白经纯化后进行SDS-PAGE电泳检测。SDS-PAGE电泳鉴定结果如图I所示。经page胶鉴定，纯度能够达到95 %，经eppendorf蛋白核酸测定仪biophotometer plus测定浓度为I. 3mg/ml,将纯化后的G2-aroA蛋白作为免疫原S780。
G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。二、动物免疫以5只6周龄的雌性Balb/C小鼠为试验动物，按照如下免疫程序及流程进行免疫I、免疫前采用断尾采血法采集血清，用作阴性对照。2、初次免疫将浓度为O. 64 μ g/ μ I的G2_aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80 μ g的G2-aroA蛋白(250 μ I乳化好的免疫原)。3、第一次加强免疫初次免疫21天后，将浓度为O. 32 μ g/μ I的G2_aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏不完全佐剂，用磁力搅拌器充分搅拌乳化，直到滴入水中不扩散，得到免疫原。用乳化好的免疫原采用背部皮下多点注射的方法免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射40 μ g的G2-aroA蛋白(250 μ I乳化好的免疫原)。4、第二次加强免疫第一次加强免疫14天后，进行第二次加强免疫。具体方法同步骤3的第一次加强免疫。5、终加强免疫第二次加强免疫14天后，将浓度为O. 8 μ g/μ I的G2_aroA蛋白溶液经无菌过滤器过滤后，得到免疫原。用所得免疫原脾内注射加强免疫Balb/C小鼠，注射剂量为每只小鼠注射80 μ g的G2-aroA蛋白(100 μ I的免疫原)。三、细胞融合和克隆化在第二次加强免疫14天后，断尾采血法采集血清，并用间接ELISA法(以S780为包被抗原)测定血清效价。在上述步骤一终加强免疫后第3天，选择上述间接ELISA法测定血清效价最佳的小鼠(效价为I : 720000)取脾细胞，再将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按9 I (数量配比)的比例，用PEG(PEG4000)常规融合方法进行细胞融合。融合后的第3天和第6天进行换液处理，第7天采用间接ELISA法(以S780为包被抗原)对融合细胞上清进行筛选，选取阳性细胞孔，将孔内细胞分别转入24孔培养板扩增培养。待细胞长至显微镜视野1/3时，收集细胞上清液，采用间接ELISA法(分别以S780、K8 (孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)作为包被抗原)进行复筛，从中选择与S780及阳性反应均较强，同时与K8和阴性均未反应的细胞(表I中的粗体的5F11)，应用有限稀释法进行亚克隆。经过3次亚克隆最终获得稳定分泌抗G2-aroA蛋白的单克隆杂交瘤细胞株，命名为AntiG2-5Fll。该杂交瘤细胞株已于2012年2月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 5772。上述作为包被抗原的K8 (孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810提取液)、阳性(我公司耐草甘膦材料提取液)、阴性(非转基因材料提取液)具体按照如下方法制备得到取O. 3g样品材料(孟山都(Mosanto)耐草甘膦材料mon810,或实施例2所获得的T6代mG2-aroA转基因玉米，或未转基因的玉米品种综31)，液氮磨碎后，转入2ml离心管中加入Iml样品提取液，剧烈震动 ，4°C提取lh，12000转/分离心10分钟后取上清进行样品测定。其中，样品提取液配方为Tris-Cl(pH8. 0)25mm ;KC1 IOmm ;MgCl2 · 6H20 20mm ;DTT 1mm;PMSF Imm (用前加)。上述间接ELISA法的步骤具体如下I)包被在96孔酶标板中加入100 μ L的2 μ g/mL的抗原溶液，同时设置不包被抗原的对照，4°C包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。上述抗原溶液可为S780、K8、阳性和阴性溶液。2)封闭加入150 μ L/孔的封闭液(3%牛血清蛋白)，在37°C孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4°C冰箱保存备用。3)加待测样品a.对于血清效价检测，第一个孔I : 1000稀释，往下以I : 3的梯度倍比稀释，37°C孵育30min，洗板4次，拍干。b.对于细胞上清检测，吸取细胞上清100μ 1，加入对应的酶标板中，37°C孵育30min,洗板4次,拍干。同时设置未经免疫的小鼠血清/抗体/腹水/细胞上清的对照；以PBS代替待检测样品的对照(阴性对照孔)。4)加酶标二抗取山羊抗小鼠IgG(H+L)_HRP，按I 5000倍稀释后，100 μ I/孔，37°C孵育20至30min，洗涤4次，拍干。5)显色将 20 X TMB 稀释至 1XTMB，按 100 μ I/孔加入，37°C显色 15_30min。6)终止加入终止液(2M H2SO4) 50 μ I/孔。7)读数以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔(以PBS代替待测样品的对照)0D值的比值(P/N)大于2. I为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。ELISA结果判定方法⑴筛选阳性细胞时，若P/N > 2. 1，则判别为阳性细胞；若
I< P/N < 2. 1，则加大包被浓度后再次检测，P/N > 2. I的仍判为阳性。(2)测定效价时，以P/N > 2. I的血清(或是腹水或是抗体)最大稀释倍数表示。表I采用间接ELISA法对融合细胞上清进行复筛的结果
权利要求
1.一种检测或辅助检测G2-aroA蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2_aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9 ;所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5Fll CGMCC No. 5772产生。
2.根据权利要求I所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述酶联免疫试剂盒中还含有分别独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的多克隆抗体和/或所述G2-aroA蛋白标准品和/或用于标记所述单克隆抗体的标记酶；所述多克隆抗体是以所述G2-aroA蛋白为免疫原免疫脊椎动物得到的。
3.权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测G2-aroA蛋白中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
4.权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒在鉴别或辅助鉴别转G2-aroA基因植物中的应用；所述G2-aroA基因编码氨基酸序列为序列表中序列9的蛋白质。
5.权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒在定量检测G2-aroA蛋白含量中的应用；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9。
6.由杂交瘤细胞株AntiG2-5FllCGMCC No. 5772产生的单克隆抗体在制备权利要求I或2所述的酶联免疫试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测耐草甘膦蛋白G2-aroA的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明所提供的酶联免疫试剂盒中含有独立包装的抗所述G2-aroA蛋白的单克隆抗体；所述G2-aroA蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9；所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株AntiG2-5F11 CGMCC No.5772产生。利用本发明所提供的酶联免疫试剂盒可用于定性或定量检测玉米等转基因植物中耐草甘膦蛋白G2-aroA的表达情况，具有快速、灵敏、特异性强的优点。
文档编号G01N33/573GK102645535SQ20121010740
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月12日 优先权日2012年4月12日
发明者刘素霞, 宋哲, 徐晔颍, 李雪峰, 郭旻, 韩庚辰 申请人:北京奥瑞金种业股份有限公司