专利名称：辣根细胞内外钙离子交换动态检测方法
技术领域：
本发明涉及辣根细胞内外钙离子交换动态的测定方法，属于分析化学和细胞生物学领域。
背景技术：
细胞膜的存在使得细胞内的各种物质能够稳定存在并进行生命体的化学反应，同时还能够选择性地运输对生命体至关重要的物质如Na+、K+、Ca2+、CF等。生命体系中的信号传递与细胞之间的离子跨膜运输有着至关重要的联系，而离子的运输通常就是由细胞膜上的各种离子通道完成的。膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一(或多个)离子通道分子活动的技术。然而，植物细胞膜片钳检测存在困难，如去壁活细胞初生壁的迅速生长造成质膜与微电极之间难以形成高阻封接；细胞膜破损后更难封接及检测；膜片钳检测需破膜，造成实验结果偏离真实值；细胞内外液中其它离子干扰严重。稀土处理后，对植物细胞造成伤害，导致膜片钳无法对植物细胞实现连续检测。非损伤微测技术是实时、动态地测量活体或者非损伤性地测量材料表面的离子和分子的流速和运动方向，是基于物理学、化学、电学、生物学等原理集成的一项尖端技术。该技术并不探讨细胞内外的离子交换，同时，该技术的测试仪器昂贵，在我国使用不广泛。离子选择性电极是一种能在多种离子存在下，用电位法测定溶液中给定离子活度的分析测量工具，因而又称为电位型化学传感器。电荷(电子和离子)在液/液界面或称之为两种互不相溶电解质溶液界面上的转移反应过程是最基本的物理化学过程之一。微、纳米级液/液界面常用于研究离子和加速离子在液/液界面上的快速转移反应动力学。膜片钳数据中的I V曲线为各个膜电位处的电流值曲线，受此启发，根据离子选择性电极的原理，加之电化学的分析手段，我们开发了一种检测辣根细胞内外Ca2+交换的新方法。采用这种方法研究活细胞表面Ca2+浓度的变化，进而探讨离子通道性质和功能的变化。该方法弥补了传统检测方法膜片钳测定植物细胞的部分缺憾。在进行细胞测试时，无限接近细胞，对细胞无损伤。该方法将化学、细胞生物学、生物电化学等相关交叉学科研究方法组合，为外来物质尤其是金属离子对细胞膜离子交换能力的检测，提供新的借鉴。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的辣根细胞内外Ca2+交换的检测方法，具有灵敏度高、准确度好、选择性强、操作简单、分析速度快等优点。本发明的循环伏安法检测微电流法，实现了稀土离子对植物细胞内外表面Ca2+的连续检测。本发明所述的用电化学循环伏安测定辣根细胞内外Ca2+交换的方法，是以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的DCE溶液，为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca2+交换进行动态连续检测。上述方案中纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。本发明还公开了所述方法在测定稀土离子对细胞表面Ca2+迁移影响中的应用。具体是以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的DCE溶液为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca2+交换进行检测；随后向细胞溶液中滴加一定浓度稀土离子，孵化5 min，进行循环伏安测定。得到不同浓度稀土离子处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面迁移的循环伏安曲线。本专利的创新之处在于
膜片钳记录的全细胞记录图表示的是细胞内外的K+交换的通道电流(包括稳态电流和 尾电流)，随着测试样品的加入，细胞内外的K+交换发生了变化，反映在通道电流改变上，并呈现剂量-效应关系，通道电流的变化反映了稀土离子对细胞K+通道功能的影响。(图2)我们通过循环伏安法测定细胞的表面Ca2+交换情况，得到闭合的循环伏安电流曲线。随着稀土离子的加入，细胞的循环伏安电流曲线电流差值发生了变化，同时也呈现出剂量-效应关系。电流差值的变化与测试细胞溶液中的Ca2+浓度成比例关系，而Ca2+浓度的变化是由于细胞内外Ca2+交换量发生变化引起的。经过反复的与膜片钳数据比较实验验证，我们发现循环伏安电流差值的变化即能相应地反映稀土离子对细胞Ca2+通道功能的影响。文献报道，通过膜片钳技术很难实现对植物细胞内外Ca2+的交换和通道的功能特异性的检测。因此，我们选用循环伏安法对辣根细胞进行特异性的连续动态检测，反映稀土离子对辣根细胞内外Ca2+的交换和通道功能的影响，并实现了对辣根细胞进行动态连续检测。本发明采用如下技术方案
电极制备以硼娃毛细管(外径I. O mm,内径O. 58 mm, L = 10 cm)为材料制备纳米毛细管，通过调节 P_2000 Puller 的 5 个参数(Heat, Filament, Velocity, Delay, Pull),制备内外管径比为2的毛细管(patch-type)。在使用前，毛细管需通过BX-41光学显微镜(Olympus)初步检查其外形，特别是管口是否平整。管口不规整以及管口不是圆形的毛细管都不能使用。实验中，我们需要在毛细管内注入DCE有机溶液，而硼硅毛细管是亲水性的，为了防止管外的水相进入管内而影响实验的准确性，必须先把纳米毛细管的内壁硅烷化使其变为疏水性的。毛细管内表面疏水化的方法是把纳米毛细管尖端浸入到三甲基氯硅烷溶液，持续片刻(毛细效应使三甲基氯硅烷进入毛细管)，然后从管后端用注射器将进入毛细管的三甲基氯硅烷慢慢往管端推动，使其到达管尖，毛细管内不能存留气泡并使其在管内保留大约30 min，而后从管后端将多余的三甲基氯硅烷吸出。硅烷化后的纳米毛细管静置一夜，晾干备用。辣根细胞内外Ca2+交换检测
纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。水相中参比电极为Ag/AgCl电极(直径为O. 20 mm的银丝作阳极，直径为I mm的钼丝作阴极，电解KCl的水溶液制得Ag/AgCl电极)，支持电解质用LiCl ;有机相中的参比电极用Ag/AgTPBCl(把少量TBATPBC1溶于DCE溶液中，直径为O. 2 mm的银丝为阳极，直径为I mm的钼丝为阴极，电解TBATPBC1的DCE溶液，可制备得到Ag/AgTPBCl电极)，支持电解质用TBATPBC1。BAS 100B电化学工作站(美国Bioanalytical Systems公司)用于记录实验的循环伏安图。所有实验均在室温下进行(25±2 °C)。在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有钙离子载体II (又名N，N，N'，N'-四环己基-3-氧杂戊二酰胺)的DCE溶液，利用循环伏安法来检测溶液中Ca2+的浓度变化，电化学池设计的表示式如下
AglAgCl|CaCl2| IOmM TBATPBC1+ O.5 I mM Ca2+ ionophore II Ag|AgTPBCl为了确定Ca2+标准曲线(图3)，我们采用滴定法，对不同浓度Ca2+在液/液界面的转移进行了循环伏安检测。将Ca2+浓度(X)与相对应的扩散电流(y)作图，得到电流与Ca2+浓度的关系式，为后续的细胞内外Ca2+交换定量计算提供基础。在实验过程中，在钙离子载体的浓度选择上做了大量工作，最终确定O. 5 I mM为较合适浓度。检测过程中，设置电压范围也存在困难，经过反复摸索，最终确定，辣根叶肉细胞的设置电压为-300 mV到400 mV，辣根根尖细胞的设置电压为-200 mV到700 mV。将毛细管电极无限接近电解池内的细胞，利用循环伏安法检测细胞表面Ca2+浓度。使用的电化学池表示式如下
Ag I AgCl I extracellular fluid| |IOmM TBATPBC1+ O. 5 I mM Ca2+ ionophoreIII Ag I AgTPBCl
随后向细胞溶液中滴加一定浓度La(III)，孵化5 min，进行循环伏安测定。得到不同浓度La (I II)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面迁移的循环伏安曲线，结果见图4和图5。由图4和图5可知，不同浓度La(III)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面的迁移均得到了良好的循环伏安响应。本发明具有如下优点根据本发明，实现不同浓度的稀土 La(III)对植物细胞表面Ca2+影响的连续测定；改变Ca2+载体浓度，可实现不同植物，不同叶片，不同生长周期的细胞内外Ca2+交换的检测。本发明借助于循环伏安法，简便仪器进行测定。根据本发明实现细胞内外Ca2+交换的检测对各种活细胞膜离子交换能力的研究具有重要意义。
图I为装置示意图。图2不同浓度稀土 La(III)处理的辣根叶肉细胞K+通道电流全细胞记录图循环伏安图；(a :辣根叶肉细胞；b :经30 μΜ La(III)处理的辣根叶肉细胞；c :经80 μΜ La(III)处理的辣根叶肉细胞)。图3不同浓度Ca2+的循环 伏安图(钙离子浓度为0. 05 mM)
图4不同浓度稀土 La(III)处理的辣根叶肉细胞内外Ca2+交换检测曲线；(a:辣根叶肉细胞；b:经30 μΜ La(III)处理的辣根叶肉细胞；c :经80 μΜ La(III)处理的辣根叶肉细胞)。
图5不同浓度稀土 La(III)处理的辣根根尖细胞内外Ca2+交换检测曲线；(a :辣根根尖细胞；b:经30 μΜ La(III)处理的辣根根尖细胞；c :经80 μΜ La(III)处理的辣根根尖细胞)。
具体实施例方式( I)纳米毛细管拉制
以硼娃毛细管(外径I. O mm,内径O. 58 mm, L = 10 cm)为材料制备纳米毛细管,设置拉制仪(P_2000 Puller)参数(Heat, Filament, Velocity, Delay, Pull),拉制毛细管，得到尖端内外管径比为2. O的毛细管。(毛细管长度为10 cm，从中间拉断，得到两根一端有尖端的纳米毛细管)
(2)纳米毛细管内壁疏水化处理
把纳米毛细管尖端浸入到三甲基氯硅烷溶液，持续片刻(毛细效应使三甲基氯硅烷进入毛细管)，然后从管后端用注射器将进入毛细管的三甲基氯硅烷慢慢往管端推动，使其到达管尖，毛细管内不能存留气泡并使其在管内保留大约30 min，而后从管后端将多余的三甲基氯硅烷吸出。硅烷化后的纳米毛细管静置一夜，晾干备用。(3)电极制备
Ag/AgCl的制备直径为O. 25 mm的银丝作阳极，直径为I mm的钼丝作阴极，电解KCl的水溶液。Ag/AgTPBCl的制备把少量的氯化四苯硼四丁基铵(TBATPBC1)溶于DCE溶液中，直径为O. 25 mm的银丝作为阳极，直径为I mm的钼丝作为阴极，电解TBATPBC1的DCE溶液。( 4 )实验装置的搭建
检测前，在步骤(2)疏水化处理的纳米毛细管中通过注射器注入一定量(纳米毛细管体积的2/3)含有Ca2+选择性载体的1，2- 二氯乙烷(DCE)有机溶液。将Ag/AgTPBCl电极一端插入到上述毛细管(有机相)至尖端，将组装后的电极尖端插入细胞液(水相)中，露在纳米毛细管外面的Ag/AgTPBCl电极用电化学工作站的连接夹夹住，并固定。将Ag/AgCl电极一端插入细胞溶液(水相)(2 mL)中，另一端用电化学工作站的连接夹夹住，并固定。(装置示意图如图I)
(5)循环伏安法检测微电流
所述循环伏安法检测辣根细胞表面Ca2+的具体实验过程在BAS 100B电化学工作站(美国Bioanalytical Systems公司)上完成。纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。纳米毛细管中的Ca2+选择性载体对Ca2+的运输作用形成的微电流，调节测试参数(电压范围，扫速，灵敏度)，通过循环伏安法检测这种微电流。通过微电流的变化，确定迁移至界面附近的Ca2+浓度的变化，进而确定细胞内外Ca2+交换能力。辣根叶肉细胞的分离纯化依据文献(Sarhan F，Cesar D, High yield isolationof mesophyll protoplasts from wheat, barley and rye[J], Physiologia PIantarum,1988，72(2) : 337-342)进行。取辣根幼叶剪成小块(I mmX2 mm)，放在盛有5 mL酶液的小培养皿中，使去除下表皮的一面接触酶液并铺满一层，在25-28 ° C下酶解3-4 h。酶液由I. 0%纤维素酶(R-10)和0. I果胶酶(Y-23)溶于0. 8 M的甘露醇溶液，甘露醇为渗透压稳定剂。用吸管将酶解液吸至5 mL离心管中，以600 rpm离心5 min使细胞沉降留沉淀。、在普通倒置光学显 微镜下观察即可看到大量的球形细胞。将毛细管电极无限接近电解池内的辣根叶肉细胞，利用循环伏安法检测细胞表面Ca2+浓度。电化学池设计的表示式如下
Ag I AgCl Iextracellular fluid IOmM TBATPBC1 + 1 mM Ca2+ ionophore 11Ag I AgTPBCl
测定时，设置电压为-300 mV到400 mV，扫速为20 mV/s，测试灵敏度为10 nA，对细胞溶液进行循环伏安检测(图3 a)，得到良好的循环伏安响应。随后向细胞溶液中滴加一定浓度稀土镧La(III)，孵化5 min，进行循环伏安测定。得到不同浓度La(III)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面迁移的循环伏安曲线，结果见图3 (b-c)。由图3 (b-c)可知，不同浓度La (I II)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面的迁移均得到了良好的循环伏安响应。与对照细胞相比，30 μΜ La(III)处理的辣根叶肉细胞溶液Ca2+浓度下降，表明30 μΜ La(III)处理后，Ca2+由辣根叶肉细胞外进入细胞内的量增加。当细胞经80 μΜ La(III)处理，细胞表面Ca2+浓度比对照细胞低，但高于80 μΜ La(III)处理的细胞，表明高浓度La(III)处理后，辣根叶肉细胞Ca2+内流量增加，增加量小于30 μΜLa(III)处理细胞。由此可以判断稀土 La(III)对细胞Ca2+交换能力的影响。实施例2
纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。水相中参比电极为Ag/AgCl电极(直径为O. 20 mm的银丝作阳极，直径为I mm的钼丝作阴极，电解KCl的水溶液制得Ag/AgCl电极)，支持电解质用LiCl ;有机相中的参比电极用Ag/AgTPBCl(把少量TBATPBC1溶于DCE溶液中，直径为O. 2 mm的银丝为阳极，直径为I mm的钼丝为阴极，电解TBATPBC1的DCE溶液，可制备得到Ag/AgTPBCl电极)，支持电解质用TBATPBC1。BAS 100B电化学工作站用于记录实验的循环伏安图。实验在室温下进行(25±2 °C)。辣根根尖细胞的分离纯化依据文献(Sarhan F，Cesar D, High yield isolationof mesophyll protoplasts from wheat, barley and rye[J], Physiologia PIantarum,1988，72(2) : 337-342)进行。取辣根根尖剪成小块(I mmX2 mm)，放在盛有5 mL酶液的小培养皿中，使去除下表皮的一面接触酶液并铺满一层，在25-28 ° C下酶解3-4 h。酶液由I. 0%纤维素酶(R-10)和0. I果胶酶(Y-23)溶于0. 8 M的甘露醇溶液，甘露醇为渗透压稳定剂。用吸管将酶解液吸至5 mL离心管中，以600 rpm离心5 min使细胞沉降,弃上清液，留沉淀。在普通倒置光学显微镜下观察即可看到大量的球形细胞。在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的DCE溶液，将毛细管电极无限接近电解池内的辣根根尖细胞，利用循环伏安法检测细胞表面Ca2+浓度。电化学池设计的表示式如下
Ag I AgCl Iextracellular fluid| |IOmM TBATPBC1+0. 5 mM Ca2+ ionophore 11Ag I AgTPBCl
测定时，设置电压为-200 mV到700 mV，扫速为20 mV/s，测试灵敏度为10 nA，对细胞溶液进行循环伏安检测(图4 a)，得到良好的循环伏安响应。随后向细胞溶液中滴加一定浓度稀土La(III)，孵化5 min，进行循环伏安测定。得到不同浓度La(III)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面迁移的循环伏安曲线，结果见图4(b-c)。由图4 (b-c)可知，不同浓度La (I II)处理后，细胞表面Ca2+在液/液界面的迁移均得到了良好的循环伏安响应。30 μΜ La(III)处理后，辣根根尖细胞Ca2+交换能力增强，而80 μΜ La(III)处理的辣根根尖细胞的Ca2+交换能力也有所增强，但增加的幅度小于30μΜ La(I II)的处理。
权利要求
1.ー种简易的辣根细胞内外Ca2+交换动态检测方法，其特征在于包括以下步骤 (O以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性； (2)在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的DCE溶液，为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中參比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中參比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca2+交换进行动态检測。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述硼硅毛细管外径I.O _内径O. 58 mm,L = 10 cm。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于纳米毛细管的循环伏安实验采用ニ电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。
4.权利要求I所述的方法在測定稀土金属对辣根细胞内外Ca2+迁移影响中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在干以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的DCE溶液为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中參比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中參比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca2+交换进行检测；随后向细胞溶液中滴加一定浓度稀土离子，孵化5 min，进行循环伏安測定。
6.得到不同浓度稀土离子处理后，细胞内外Ca2+在液/液界面迁移的循环伏安曲线。
7.根据权利要求4和5所述的应用，其特征在于所述稀土金属是稀土镧。
全文摘要
本发明属于用电化学方法研究辣根细胞内外钙离子(Ca2+)交换动态的方法。该方法以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca2+载体的1,2-二氯乙烷(DCE)溶液，为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用纳米管离子选择性微电极，通过循环伏安法对辣根细胞内外Ca2+交换进行动态检测。本发明操作简单且灵敏度高，实现了离子选择性电极与电化学检测技术的完美组合，为研究金属离子对离子通道性质和功能的影响提供了新方法。
文档编号G01N27/48GK102636550SQ20121011403
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月18日 优先权日2012年4月18日
发明者储云霞, 吕晓芬, 蔡称心, 黄晓华 申请人:南京师范大学