专利名称：一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用。
背景技术：
安培免疫分析方法将高灵敏度的电化学传感技术与特异性免疫反应结合起来，通过电流变化监测抗原-抗体反应，由于其操作简便、样品需求量少、无需分离、检测范围宽、快速灵敏、结果准确等特点，在社会各个领域的应用越来越广泛。其测量一般包括两个步骤首先通过一个竞争或夹心式的免疫反应(生物辨识组件，如抗体包被膜)将酶标抗体结合在传感器表面，而后通过一个酶催化反应(如HRP酶对H2O2催化)引起测试体系电信号变 化并进行测定。安培免疫传感器利用利用抗原、抗体作为分子识别原件，把抗原-抗体特异性反应过程中产生的信号通过换能器转变成电信号，从而对被测物进行定量分析。现有的安培免疫传感器的制备过程中，抗体的固定是至关重要的步骤。传统固定法法有物理吸附、化学交联以及溶胶-凝胶包埋等。其中采用物理吸附法固定抗体重复性差，传感器灵敏度低；采用化学交联和溶胶-凝胶包埋不能控制抗体的取向，并且容易造成抗体失去活性，因此现有的安培免疫传感器存在检测速度慢，检测误差大及灵敏度低的缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高的夹心免疫传感器的制备方法及其应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法，包括以下步骤
(O二抗探针的制备
a.Fe304/Au胶纳米磁珠制备
将IOOmL的O. 01wt%氯金酸(HAuCl4)置于烧杯中加热，煮沸后迅速加入2. 5mL的lwt%柠檬酸三钠，继续煮沸IOmin直至溶液变为深红色，轻微搅拌冷却后得到胶体金溶液；将O. 2g的四氧化三铁加入90mL的50wt%乙醇溶液中超声分散均匀后，加入300uL的3-巯丙基三乙氧基硅烷(3-MPTES)和500uL氨水，60 V恒温水浴，通N2保护，反应6h后，用O. ImoI/L盐酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到硅烷化四氧化三铁；将上述的得到胶体金溶液与硅烷化四氧化三铁混合，轻微搅拌至溶液无色透明，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au胶纳米磁珠；
b.二抗探针Fe3O4Au-HRP-Ab2的制备
将Fe304/Au胶纳米磁珠加入水中，超声波震荡,得到I. Omg/mL的Fe304/Au纳米悬浮液，将Fe3O4Au纳米悬浮液用O. IM NaCO3调pH至8. 2，加入体积分别为Fe304/Au纳米悬浮液1/5的I. Omg/mL辣根过氧化物酶(HRP)和10 μ g/mL被测物二抗(Ab2), 4°C搅拌24h，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗3次，再加入与Fe304/Au纳米悬浮液等体积的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐(PBS)缓冲液分散后，得到二抗探针溶液；
(2)电极修饰及抗体结合
a.电极修饰
采用Y-Al2O3抛光的玻碳电极(GCE)作为工作电极，依次在去离子水和乙醇中超声5min,然后将玻碳电极置于O. 08mM氯金酸中，在室温,-O. 5V的电压下电沉积金15s,用去离子水洗净后，得到Au/GCE电极；
b.抗体结合
将20 μ L的O. 5 mg/mL被测物一抗(Ab1)滴至Au/GCE电极表面，4°C温育2h后，将未结合在工作电极表面的被测物一抗用磷酸盐缓冲液轻微冲洗掉，然后将20 μ L的3wt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)滴至工作电极表面，室温温育lh，封闭非特异性活性位点，将工作电极表面用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，洗净剩余的牛血清蛋白，获得牛血清蛋白封闭的Abl/Au/GCE电极；
(3)夹心免疫传感器的组装
将Abl/Au/GCE电极置于被测物抗原溶液中，室温下温育O. 2-lh后，用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，再将Abl/Au/GCE电极置于20 μ L二抗探针溶液中，室温下温育O. 2-lh,用磷酸盐缓冲液轻微冲洗后，即组装成夹心免疫传感器。步骤(I)中所述的硅烷化四氧化三铁的制备过程如下。所述的被测物为三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素。一种磁性夹心纳米免疫传感器的应用，所述的磁性夹心纳米免疫传感器可用于测定食物中三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素的浓度。工作原理在工作电极表面修饰纳米金再结合被测物一抗，并在溶液中和被测物抗原温育结合，将标记有HRP酶的被测物二抗分别与在工作电极表面的被测物一抗一抗原温育结合，形成“三明治”复合物，在外加磁场作用下，包被了“夹心免疫复合物”的纳米磁珠被吸附到电极表面，并加入HRP酶催化底物过氧化脲(包含30%H202的固体，俗称固体H2O2,比H2O2稳定且对抗体/抗原干扰小)，通过传感器电流输出信号的大小来测定抗原的浓度。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用，包括二抗探针Fe3O4Au-HRP-Ab2的制备，电极修饰及一抗结合，最后将Abl/Au/GCE电极置于被测物抗原溶液中结合抗原，再与二抗探针结合即组装成磁性夹心纳米免疫传感器，优点如下
1)本发明制备过程中的抗体浓度、抗体固定过程参数均经过试验优化，使抗体的固定效果好，提高了免疫传感器的灵敏度；
2)本发明制备过程中提供的抗体及酶的量有助于传感器电流输出信号的放大，进而提升传感器的检测速度、准确性与灵敏度，但又将抗体及酶的用量控制在有效范围内，降低制备成本；
3)Fe304、金体胶等均具有良好的生物兼容性，通过静电引力负载抗体非常牢固，并可保证其长期保持生物活性，从而保证免疫传感器具有良好的准确性和稳定性；
4)采用外加磁场控制这一宏观的手段，除了使待测样品快速从复杂的检测背景中分离富集外，还保证了一次性免疫传感器表面结构稳定，从而具有稳定的检测性能；5)Fe3O4Au胶纳米磁珠具有强大的电信号放大功能，这源于该纳米微粒比表面积大、生物相容性好，能够负载大量的HRP酶。综上所述，本发明一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用，具有检测速度快、准确性和灵敏度高，低成本的优点。
图I为本发明磁性夹心纳米免疫传感器的制备原理图。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。一、具体实施例
本发明一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法，具体包括以下步骤
(O二抗探针的制备
a.Fe304/Au胶纳米磁珠制备
al.将IOOmL的O. 01wt%氯金酸(HAuCl4)置于烧杯中加热，煮沸后迅速加入2. 5mL的lwt%柠檬酸三钠，继续煮沸IOmin直至溶液变为深红色，轻微搅拌冷却后得到胶体金溶液；a2.将O. 2g的四氧化三铁加入90mL的50wt%乙醇溶液中超声分散均匀后，加入300uL的3-巯丙基三乙氧基硅烷(3-MPTES)和500uL氨水，60°C恒温水浴，通N2保护，反应6h后，用O. lmol/L盐酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到硅烷化四氧化二铁。
a3.将上述胶体金溶液与上述硅烷化四氧化三铁混合，轻微搅拌至溶液无色透明，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au胶纳米磁珠；
b.二抗探针Fe3O4Au-HRP-Ab2的制备
将Fe304/Au胶纳米磁珠加入水中，超声波震荡，得到I. Omg/mL的Fe304/Au纳米悬浮液Fe3O4Au纳米悬浮液用O. IM NaCO3调pH至8. 2，加入体积分别为Fe304/Au纳米悬浮液1/5的I. Omg/mL辣根过氧化物酶(HRP)和10 μ g/mL被测物二抗(Ab2), 4°C搅拌24h，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗3次，再加入与Fe3O4Au纳米悬浮液等体积的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐(PBS)缓冲液分散后，得到二抗探针溶液；
(2)电极修饰及抗体结合
a.电极修饰
采用Y -Al2O3抛光(将O. 5g Y -Al2O3溶于水，超声形成悬浮液，滴涂在麂皮上，将电极面朝下，在麂皮上顺时针磨20圈左右得到Y-Al2O3抛光的电极)的玻碳电极(GCE)作为工作电极，依次在去离子水和乙醇中超声5min，然后将玻碳电极置于O. OSmM氯金酸中，在室温，-O. 5V的电压下电沉积金15s,用去离子水洗净后,得到Au/GCE电极；
b.抗体结合
将20 μ L的O. 5 mg/mL被测物一抗(Ab1)滴至Au/GCE电极表面，4°C温育2h后，将未结合在工作电极表面的被测物一抗用磷酸盐缓冲液轻微冲洗掉，然后将20 μ L的3wt%牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)滴至工作电极表面，室温温育lh，封闭非特异性活性位点，将工作电极表面用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，洗净剩余的牛血清蛋白，获得牛血清蛋白封闭的Abl/Au/GCE电极；
(3)磁性夹心纳米免疫传感器的组装
将Abl/Au/GCE电极置于被测物抗原溶液中，室温下温育O. 2-lh后，用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，再将Abl/Au/GCE电极置于20 μ L二抗探针溶液中，室温下温育O. 2-lh,用磷酸盐缓冲液轻微冲洗后，即组装成夹心免疫传感器。上述实施例中被测物可为聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素。二、具体应用实施例
一种磁性夹心纳米免疫传感器的应用，磁性夹心纳米免疫传感器可用于测定食物中三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素的浓度。以下以瘦肉精为试验对象，采用本发明的磁性夹心纳米免疫传感器与酶联免疫ELISA试剂盒分别检测火腿肠中的瘦肉精含量，具体如下
取市场收集的火腿肠样品4个，采用粉碎机高度粉碎后，准确称取I. OOOg,加入5. O mL70%甲醇，涡旋振荡5 min，再用超声波提取10 min后定性滤纸过滤、定容。提取液经稀释后分别采用本发明的磁性夹心纳米免疫传感器与酶联免疫ELISA试剂盒进行分析。表I火腿肠样品中的瘦肉精检测结果
权利要求
1.一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)二抗探针的制备 a.Fe304/Au胶纳米磁珠制备 将IOOmL的0. 01wt%氯金酸置于烧杯中加热，煮沸后迅速加入2. 5mL的1 丨％柠檬酸三钠，继续煮沸IOmin直至溶液变为深红色，轻微搅拌冷却后得到胶体金溶液；将0. 2g的四氧化三铁加入90mL的50wt%乙醇溶液中超声分散均匀后，加入300uL的3-巯丙基三乙氧基硅烷和500uL氨水，60°C恒温水浴，通N2保护，反应6h后，用0. lmol/L盐酸洗6次，每次至少lh，再用乙醇和去离子水分别洗涤3次，得到硅烷化四氧化三铁；将上述的得到胶体金溶液与硅烷化四氧化三铁混合，轻微搅拌至溶液无色透明，外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗，真空干燥后得到Fe3O4Au胶纳米磁珠； b.二抗探针Fe3O4Au-HRP-Ab2的制备 将Fe3O4Au胶纳米磁珠加入水中，超声波震荡,得到I. Omg/mL的Fe3O4Au纳米悬浮液，将Fe3O4Au纳米悬浮液用0. IM NaCO3调pH至8. 2，加入体积分别为Fe3O4Au纳米悬浮液1/5的I. Omg/mL辣根过氧化物酶和10 u g/mL被测物二抗，4°C搅拌24h,外加磁铁磁性分离后，用去离子水水洗3次，再加入与Fe3O4Au纳米悬浮液等体积的pH 7. 4含lwt%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液分散后，得到二抗探针溶液； (2)电极修饰及抗体结合 a.电极修饰 采用Y-Al2O3抛光的玻碳电极作为工作电极,依次在去离子水和乙醇中超声5min,然后将玻碳电极置于0. 08mM氯金酸中，在室温，-0. 5V的电压下电沉积金15s,用去离子水洗净后，得到Au/GCE电极； b.抗体结合 将20 ii L的0. 5 mg/mL被测物一抗滴至Au/GCE电极表面，4°C温育2h后，将未结合在工作电极表面的被测物一抗用磷酸盐缓冲液轻微冲洗掉，然后将20 ii L的3wt%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液滴至工作电极表面，室温温育lh，封闭非特异性活性位点，将工作电极表面用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，洗净剩余的牛血清蛋白，获得牛血清蛋白封闭的Abl/Au/GCE电极； (3)磁性夹心纳米免疫传感器的组装 将Abl/Au/GCE电极置于被测物抗原溶液中，室温下温育0. 2-lh后，用磷酸盐缓冲液轻微冲洗，再将Abl/Au/GCE电极置于20 y L二抗探针溶液中，室温下温育0. 2-lh,用磷酸盐缓冲液轻微冲洗后，即组装成夹心免疫传感器。
2.根据权利要求I所述的一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于所述的被测物为三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素。
3.一种根据权利要求I所述的磁性夹心纳米免疫传感器的应用，其特征在于所述的磁性夹心纳米免疫传感器可用于测定食物中三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种磁性夹心纳米免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将胶体金溶液与硅烷化四氧化三铁混合搅拌至溶液无色透明，外加磁铁磁性分离后，得到Fe3O4/Au胶纳米磁珠的步骤；Fe3O4/Au胶纳米磁珠的负载辣根过氧化物酶和被测物二抗得到二抗探针Fe3O4/Au-HRP-Ab2的步骤；玻碳电极电沉积金后再负载被测物一抗，蛋白封闭非特异性活性位点后得到Ab1/Au/GCE电极的步骤；最后将Ab1/Au/GCE电极负载抗原，再结合二抗探针得到夹心免疫传感器的步骤；该磁性夹心纳米免疫传感器可用于测定食物中三聚氰胺、苏丹红、瘦肉精或雌激素的浓度，优点是检测速度快、准确性和灵敏度高，低成本。
文档编号G01N33/553GK102707049SQ201210145999
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月14日 优先权日2012年5月14日
发明者干宁, 朱珊珊, 熊萍, 胡富陶 申请人:宁波大学