自猪单独分离的肽及其用途
【专利摘要】本发明提供一种自猪单独分离的肽及其用途。该肽具有序列表SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，其具有抑菌及杀菌活性，可用于治疗大肠杆菌(Escherichia?coli)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)所引起的感染。
【专利说明】自猪单独分离的肽及其用途
【技术领域】
[0001]本发明关于一种自猪单独分离的肽，详言之，关于一种具有抑菌及杀菌活性的肽。【背景技术】
[0002]为解决动物肠道功能失调，使用抗生素为目前最常用的方法，然而过度使用抗生素会造成细菌产生抗药性、药物残留以及环境污染等问题。
[0003]抗菌肽(antimicrobial peptide, AMPs)在近年来渐渐受到重视,早在1950年代，就有科学家发现在不同动物的血液中，存在具有抗菌活性的物质，后来发现昆虫巨噬细胞会分泌带正电的AMPs到细胞外以降低细菌感染的机会。1983年，Lehrer和Selsted在兔子肺脏巨噬细胞中纯化出两种具有三对半胱氨酸残基构成二硫键的AMPs，并将其命名为防御素(defensin)。2005年Zilbauer等人发现肠道受细菌感染初期，防御素的量会向上调节提升，此外也有许多证据显示，低浓度或失活的防御素会影响肠内的动态平衡造成肠道慢性疾病，如克隆氏症和溃疡性结肠炎(Wehkamp et al.，2005)。
[0004]抗菌肽分布于脊椎动物、非脊椎动物、植物、细菌及真菌，属先天性免疫反应的其中一部分。防御素为AMPs家族之一，具广泛的抗菌活性，以猪肠道防御素(Porcine β -defensin2, pBD2)为例，许多猪只病原菌对pBD2有很高的感受性。
[0005]AMPs具有物理性破坏细菌细胞膜的作用机制，为古老的体内抗菌武器，因此有着极大的潜力可辅助抗生素的使用(Linde等人，2008)，但以化学合成AMPs的费用昂贵，故开发产制AMPs的策略将有前景。
【发明内容】
[0006]为达上述及其它目的，本发明提供一种自猪单独分离的肽，该肽具有序列表SEQID NO:1所示的氨基酸序列，且该氨基酸序列含有6个半胱氨酸(cysteine)残基构成的二硫键，其特征在于，该肽用以抑菌及杀菌。
[0007]根据本发明，该肽含有36个氨基酸残基，且具有约5至7kDa的分子量。
[0008]于具体应用，本发明自猪单独分离的肽可与大肠杆菌(Escherichia coli)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的磷脂外膜作用，使其渗透压失衡导致凋亡，因此实现抑菌及杀菌用途。
[0009]本发明还提供一种可编码上述肽的核苷酸片段，其具有序列表SEQID NO:2所示的核酸序列。
[0010]本发明自猪单独分离的肽可于毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达,经本发明的实例证实，本发明于毕赤酵母中产生的肽具有抗菌效果，且该肽可进一步纯化。
[0011]制备本发明自猪单独分离的肽的方法包括下列步骤:将该肽片段的核酸片段构筑于表达载体；将该表达载体转化至毕赤酵母中，以表达该肽片段；以及自该毕赤酵母分离该肽片段。
[0012]本发明所用的表达载体可为(但不限于):PGAPZaA、及pPICZaA，并可将表达载体转化至毕赤酵母中进行重组肽表达，经本发明的实例证实，该重组肽对于大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有抑制效果。
[0013]为实现上述抑菌及杀菌目的，本发明另提供一种医药组合物，包括医药有效量的肽及医药上可接受的载剂，其特征在于，该肽为具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且该菌为大肠杆菌及金黄色葡萄球菌。
[0014]本发明的医药组合物的形式可为(但不限于):包埋物、浸泡液、饲料、饲料添加物、口服液、注射疫苗、贴片、粉剂、锭剂、注射液体、悬浮液、外用液、滴剂、擦剂、涂剂、霜剂、油膏、软膏、糊剂、胶以及凝胶。一具体实例中，该医药组合物为霜剂、锭剂或粉剂。
[0015]本发明的医药组合物可选用适当载剂，例如(但不限于):赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基质、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂及或香料。
[0016]本发明中，适当的润滑剂包含(但不限于):甘油及油类，且该油类可为花生油或蓖麻油；适当的基质包含(但不限于):碳氢化合物，且该碳氢化合物包含(但不限于):硬石蜡、软石蜡、石蜡油、甘油、蜂蜡、金属皂、天然油、羊毛脂及其衍生物、脂肪酸及其混合物；适当的天然油包含(但不限于):杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油及橄榄油；适当的脂肪酸包含(但不限于):硬脂酸及油酸；适当的表面活性剂包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及非离子表面活性剂，且该表面活性剂可包含(但不限于):山梨醇酐酯、聚氧乙烯及其衍生物、聚羧乙烯及其衍生物，且该聚氧化乙烯的衍生物可为聚氧乙烯脂肪酸酯，该聚羧乙烯的衍生物可为卡波树脂(carbopol);适当的悬浮剂包含(但不限于):天然树脂、纤维素衍生物无机物质、聚乙二醇540、聚乙二醇3350及丙二醇；适当的胶凝剂包含(但不限于):纤维素衍生物、乙烯基聚合物、聚羧乙烯衍生物、果胶及胶类，该纤维素衍生物可为甲基纤维素、羟基乙基纤维素或羧甲基纤维素，且该胶类可为阿拉伯树胶、黄蓍胶、藻胶、琼脂或明胶。
[0017]可将本发明的医药组合物以口服、浸泡、注射、涂抹或贴片的方式给药至人体或动物体内，其中，该动物可为畜产动物或水生动物，例如(但不限于):猪、牛、羊、鸡或养殖鱼。优选可将本发明的医药组合物以口服方式给药至猪体内，以抑制或降低猪体内的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染的病症。
[0018]为了治疗被大肠杆菌或金黄色葡萄球菌感染的动物，本发明将具有序列表SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的肽应用于制备免疫诱导剂，用以抑菌及杀菌。具体而言，本发明的肽以破坏大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的细胞膜的作用机制，达到抑菌及杀菌功效，进而使给药免疫诱导剂的受感染动物增加免疫力。
[0019]本发明的肽另可应用于筛选能增加动物免疫力的免疫诱导剂的方法，包括下列步骤:将所欲筛选的免疫诱导剂与饲料混合，以获得混合物；将该混合物给药至动物；检测该动物体内如序列表SEQ ID NO:1所示的肽片段的表达量；以及以该肽片段的表达量高低来判断该免疫诱导剂对该动物杀菌及抑菌的影响，其中，该菌包含大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1显示本发明自猪单独分离的肽的pBD2基因片段的电泳图，以设计的引物进行pBD2基因的PCR，其基因片段长度为108bp，测试的粘合温度范围为67 V至59°C，结果在59°C有最明显条带，表示增幅较多pBD2基因；
[0021]图2是pPICZ a A/mPBD2双酶切电泳确认图，其特征在于，M表示Ikb的DNA标记(marker),条带(lane) I及lane2分别为不同转殖菌株的质粒纯化后经EcoRl及Xbal双酶切的基因片段；
[0022]图3显示纯化的mpBD2基因片段与质粒pPICZ a A浓度比较，其特征在于，M表示Ikb的DNAmarker, Ianel及lane2表不pPICZ a A质粒，lane3表不纯化的pBD2基因片段；
[0023]图4显示以Tricine-SDS-PAGE分析不同酵母菌转殖菌株诱导表达后细胞外液蛋白质变化情形，其中，M表示蛋白质标记(protein marker), Ianel至lane7各自表示不同酵母菌转殖菌株表达的重组蛋白的分析结果；
[0024]图5显示以pPICZ a A/mPBD2转殖菌株诱导表达的上清液的Western Blot Histaq标定分析,其中,M表示protein marker, Ianel至lane6各自为不同酵母菌转殖菌株表达的重组蛋白；以及
[0025]图6A-6B显示本发明自猪单独分离的肽的抗肠道有害菌活性分析，图6A为对金黄色葡萄球菌的抗菌结果，图6B为对大肠杆菌的抗菌结果，其纵轴(log cfu/ml)表示存活菌数，其中，CTRL表示没有添加本发明自猪单独分离的肽的对照组，CTRL ID表示对照组以37°C培养一天，mPBD21D表示对照组添加20ul lmg/ml的肽以37°C培养一天，Amp’ ID表示对照组添加20ullmg/ml的Ampicillin的正对照以37°C培养一天。
【具体实施方式】
[0026]以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明也可通过其它不同的实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所揭示的精神下赋予不同的修饰与变更。
[0027]实施例1本发明自猪单独分离的肽片段的制备
[0028]1.将自猪单独分离的肽片段的核酸片段构筑于表达载体
[0029]以已知方法自猪舌头组织中萃取RNA，以逆转录酶将所有萃取的RNA逆转录为cDNA。
[0030]以对应猪肠道防御素(Porcine β _defensin2, pBD2)的部分序列(108bp片段)为基础，使用由Sigma公司代为合成的两个引物，设计的引物如下表1。
[0031]表1
[0032]
【权利要求】
1.一种自猪单独分离的肽，其具有序列表SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，且该氨基酸序列含有6个半胱氨酸残基构成的二硫键，其特征在于，该肽用于抑菌及杀菌。
2.如权利要求1所述的肽，其特征在于，该菌包含大肠杆菌(Escherichiacoli)及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。
3.一种自猪单独分离的核苷酸，其具有序列表SEQ ID NO:2所示的核酸序列，且编码如权利要求1所述的肽。
4.一种制备如权利要求1所述的肽的方法，包括下列步骤: 将如权利要求1所述的肽片段的核酸片段构筑于表达载体； 将该表达载体转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)中，以表达该肽片段；以及 自该毕赤酵母分离该肽片段。
5.一种于毕赤酵母中用于表达如权利要求1所述的肽的用途。
6.一种医药组合物，包括医药有效量的如权利要求1所述的肽及医药上可接受的载剂。
7.如权利要求6所述的医药组合物，其特征在于，该载剂可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基质、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料。
8.如权利要求6所述的医药组合 物，以口服、浸泡、注射、涂抹或贴片的方式给药至动物体内。
9.一种如权利要求1所述的肽的用途，用于制备免疫诱导剂。
10.一种用以筛选能增加动物免疫力的免疫诱导剂的方法，包括下列步骤: 将所欲筛选的免疫诱导剂与饲料混合，以获得混合物； 将该混合物给药至动物； 检测该动物体内如序列表SEQ ID NO:1所示的肽片段的表达量；以及 以该肽片段的表达量高低来判断该免疫诱导剂对该动物杀菌及抑菌的影响， 其特征在于，该菌包含大肠杆菌或金黄色葡萄球菌。
【文档编号】G01N33/68GK103539850SQ201210245816
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月16日 优先权日:2012年7月16日
【发明者】孙舜国, 郑永祥, 李欣颖 申请人:拜宁生物科技股份有限公司