专利名称：一种乳制品中蛋白掺假的分析方法
技术领域：
本发明属于液相色谱分析技术领域，具体涉及ー种乳制品中蛋白掺假的分析方法。
背景技术：
随着生活水平的日益提高，人们对乳及乳制品的需求量呈现出持续上升的趋势。在巨大的市场利益的驱动下，不少乳品生产的企业或个人往乳品中掺假以牟取暴利。乳中富含蛋白质、脂肪、碳水化合物，按照人类所需的营养，乳中营养价值最高的成分是蛋白质，因此，对乳及乳制品的检测，主要指标之一就是蛋白质；相应的，目前乳产品的掺假主要是针对乳蛋白的掺假。如2005年在山东发现有牛奶被添加皮革水解蛋白；2008年石家庄三鹿集团在奶粉中添加了三聚氰胺，导致多名婴幼儿出现肾结石病症；而后蒙牛、伊利、大白 兔、毒奶粉等类似事件频频爆发，让乳制品的安全问题再次成为全球瞩目的焦点。显然，现有的乳制品安全控制体系依然不够完备，不能完全保障乳制品的安全性。特别是2008年9月的“毒奶粉”事件，使得我国牛奶产业发生惊天逆变，乳制品生产急剧萎縮，消费量明显下滑。“毒奶粉”事件严重打击了中国消费者对乳制品的消费信心，国内乳品市场形势不容乐观。监测是保障市场食品安全的重要管理措施，也是我国政府管理部门的常规工作，但目前在牛奶蛋白掺假监测方面存在如下问题一、检测方法存在漏洞牛奶/奶粉中蛋白质的含量測定方法是凯氏定氮法，这种方法将氮元素含量转换成蛋白质来进行定量，只要加入含氮量高的各种化合物都能产生类似的掺假效果，所以说要根本解决牛奶/奶粉的掺假问题，还要从蛋白质的測定手段上来解决；ニ、蛋白质是由氨基酸组成，理论上检测所有必需氨基酸的含量和比例可以达到控制蛋白质的掺假，目前所有必需氨基酸的同时检测一般采用的都是氨基酸分析仪，检测成本相当高，基层检测部门很难拥有这样的检测资源。因此，迫切需要ー种简单实用检测方法，有效地控制市场上的牛奶蛋白掺假现象，为政府部门的高效管理提供技术支撑。现有的乳制品蛋白掺假的检测，一类是针对非蛋白含氮物掺假的检測，目前国内外对此研究较为成熟，已有现行的国际标准对其进行严格的监控；另ー类是阵对非乳蛋白掺假的检测，目前主要是利用蛋白质的氨基酸组成、溶解性、抗原特异性及分子量、带电量等方面的差异性进行检测，但大多操作较麻烦，用时较长，且目前尚未见以氨基酸模式判别牛奶蛋白掺假的报道。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术的上述不足，提供ー种操作简单、能够快速得出分析结果、分析成本低、易于推广应用的乳制品中蛋白掺假的分析方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现
一种乳制品中蛋白掺假的分析方法，包括如下步骤(1)样品液和标准液的制备将样品分为两份，ー份进行碱解，一份酸解；碱解后以酸进行中和，酸解后进行蒸干并以稀酸复溶，复溶液以衍生剂进行衍生化，有机滤膜过滤，得到样品液；分别配制色氨酸标准溶液以及苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的混合标准溶液衍生液；
(2)含量測定分别将步骤(I)中所述的标准溶液、混合标准溶液衍生液及样品液注入高效液相色谱仪中，然后测量标准溶液、混合标准溶液衍生液及样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸相对应的峰面积，计算样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的含量。碱解使样品中蛋白质水解以得到色氨酸，酸解使样品中蛋白质水解以得到苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸。依据世界卫生组织(WHO)所提出氨基酸模式标准中的10种氨基酸，选定其中易于检测的4种必需氨基酸色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸进行測定，以构成合理的氨基酸简洁模式。
步骤(I)中各技术方案的优选为所述碱解为以氢氧化锂溶液为碱，通氮排氧后在105 110°C下进行碱解19 21h ;所述酸解为以盐酸溶液为酸，通氮排氧后在105 110°C下进行酸解2f23h;所述中和为用酸将体系的pH值调至7±0. 05;稀酸复溶为以O. 005、. 015mol/L盐酸水溶液为稀酸；所述衍生化为以衍生剂对酸解复溶液进行室温衍生 50 70min。步骤(I)中技术方案的最优选为，所述碱解为以氢氧化锂溶液为碱，通氮排氧后在110°C下进行碱解20h ;所述酸解为以盐酸溶液为酸，通氮排氧后在110°C下进行酸解22h ；所述中和为用酸将体系的PH值调至7 ;稀酸复溶为以O. 01mol/L盐酸水溶液为稀酸，衍生时间为lh。步骤(I)中，所述中和优选为以浓盐酸为酸，将体系的pH值调至7，震荡3分钟。步骤(I)中，所述衍生化更优选为以衍生剂对酸解复溶液进行室温衍生lh，后加入2倍体积正己烷进行萃取，漩涡震荡lmin，静置lOmin，除去正己烷层，得到余液。正己烷的主要作用是除去过量的衍生剂。上述衍生剂优选为异硫氰酸苯酷。上述衍生剂最优选为为体积比为I: I的O. I mol/L异硫氰酸苯酯-こ腈溶液及Imol/L三こ胺-こ腈溶液。步骤(I)中所述的碱解为以rSmol/L氢氧化锂溶液为碱；酸解为以6mol/L盐酸溶液为酸。步骤(2)中含量測定所用的色谱条件为紫外检测器，检测波长为24(T260nm;色谱柱为碳十八液相色谱柱；こ腈与15 30mmol/L磷酸氢ニ钾组成的缓冲溶液作为流动相；控制こ腈浓度在1(Γ70体积％范围内进行梯度洗脱；流速为0. 5^1. 5ml/min ;柱温为20^35 0C ;进样量为I 20 μし所述的色谱条件优选为紫外检测器，检测波长为254nm ;色谱柱为SunFire C18型色谱柱；こ腈与25mmol/L磷酸氢ニ钾组成的缓冲溶液作为流动相；流速为lml/min ;柱温25°C ;进样量为10 μし梯度洗脱的条件优选为(Tl分钟，こ腈在缓冲溶液中的比例由10体积％上升为25体积％ ； Γ21分钟，こ腈比例由25体积％上升为70体积％。步骤(2)中所述的含量測定，其含量计算方法为标准曲线法，即并通过高效液相分析得到色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程，将所测定的样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸的峰面积按照标准曲线换算，即可计算样品中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸的含量。标准曲线和线性回归方程按照如下步骤制备
用色氨酸标准储备液配制成色氨酸浓度分别为1、5、10、25、50μ g/mL的标准溶液；用苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准储备液配制成苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液，使苏氨酸浓度分别为2、10、20、50、100μ g/mL ;缬氨酸、赖氨酸浓度分别为10、20、50、100、200 μ g/mL ;将苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液进行衍生化；
分别吸取各浓度的色氨酸标准溶液和苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液衍生液
10μ L注入高效液相色谱进行分析，由相应浓度得到的高效液相色谱峰面积，得到色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程， 并得到最低检测限。所述乳制品包括但不限于液体乳类、乳粉类。所述的乳制品优选为牛奶、奶粉。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(O本发明通过碱解、酸解并衍生化的前处理，测定将样品中的色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸，将四者组成的氨基酸简洁模式与合格品氨基酸简洁模式作比对，可以有效地判别乳制品中蛋白是否掺假。(2)本发明所述方法的前处理操作简单，无需对样品进行提取纯化等预处理，可以直接进行水解；
(3)灵敏度高，色氨酸及苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸的衍生物在254nm有较强的吸收，最低检测限为 O. 125 O. 3125 μ g/mL ；
(4)取样少，液体样品取2ml即可，固体样品取样不足O.Ig ；
(5)适用于大批量样品測定，由于可同时进行水解，提取等步骤，单个样品高效液相测定时间在20分钟以内，因此适用于大批量样品測定；
(6)稳定性好，24h内4种氨基酸的峰面积稳定，RSD<5.6% ；
(7)本方法应用于食品安全风险评估领域，能够有效判别出乳制品中蛋白掺假，满足常规检测及乳品的安全控制需要，对企业或监管部门均具有广泛的市场应用前景。
图I是色氨酸标准品色谱 图2是苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准品衍生物色谱 图3是色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸高效液相色谱图标准曲线 图4是牛奶样品碱解处理后色氨酸高效液相色谱 图5是牛奶样品酸解处理后苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸高效液相色谱图。
具体实施例方式以下结合具体实施例进ー步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何形式的限定。
实施例I牛奶样品蛋白模拟掺假判别
(I)准确称取色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准品各O. 010g，分别用O. 01mol/L HCl溶液溶解并定容至10mL，配制成1000 μ g/mL的标准储备液于容量瓶中。用色氨酸标准储备液配制成色氨酸浓度分别为1、5、10、25、50μ g/mL的标准溶液；用苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准储备液配制成苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液，使苏氨酸浓度分别为2、10、20、50、100μ g/mL ;缬氨酸、赖氨酸浓度分别为10、20、50、100、200μ g/mL ;将苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液进行衍生化；分别吸取各浓度的色氨酸标准溶液和苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸混合标准溶液衍生液10 μ L注入高效液相色谱进行分析，由相应浓度得到的高效液相色谱峰面积，得到色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸标准物质峰面积-质量浓度标准曲线和线性回归方程:色氨酸Y= 30400Χ+826. 6，R2=O. 9997，最低检测限O. 125 μ g/mL ;苏氨酸Y=224789X-141332，R2= 0. 9996，最低检测限 0. 125 μ g/mL ;缬氨酸 Y =208213X_155701，R2=0.9999，最低检测限 0.3125 μ g/mL;赖氨酸 Y =271893X_633829，R2= 0.9997，最低检测限0.3125 μ g/mL。(2)碱解(为测量色氨酸)分别取合格品牌牛奶及掺入面粉或淀粉或两者混合物 的牛奶2mL于6支碱解管中，各加入8mol/L氢氧化锂溶液2mL，在管ロ通氮气2min后立即盖紧管盖，置于110°C烘箱中加热20h，取出冷却后用浓盐酸中和至pH=7，震荡3分钟，用超纯水定容至IOOmL,摇匀，过有机滤膜后待测。(3)酸解(为测量苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸)分别取合格品牌牛奶及掺入面粉或淀粉或两者混合物的牛奶2mL于6支酸解管中，各加入浓盐酸2mL，在管ロ通氮气2min后立即盖紧管盖，置于110°C烘箱中加热22h，取出冷却后在50°C条件下旋转蒸发至蒸干，后用
0.01mol/L HCl溶液复溶并定容至100mL。(4)衍生化取酸解液ImL于IOmL离心管中，分别加入0. I mol/L异硫氰酸苯酷-こ腈溶液0. 5mL及I mol/L三こ胺-こ腈溶液0. 5mL室温下放置Ih后，加入正己烷2mL，漩涡震荡lmin，静置lOmin，注射器吸取下层溶液，过有机滤膜后待測。(5)高效液相色谱条件
色谱柱Waters SunFire C18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m);流动相こ腈和磷酸盐缓冲溶液(25mmol/L, pH=2. 5);总流量lml/min ;紫外吸收波长254nm ;梯度洗脱:0 lmin,こ腈比例由10%升至25%，I 21min，こ腈比例由25%升至70% ;柱温30°C ;进样量=IOyL0(6)回收率及相对标准偏差(RSD)
对牛奶样品I进行3水平添加回收实验，每个添加水平取5个平行样，进行回收率测定，按照上述前处理方法进行处理，样品入高效液相色谱仪检测，根据峰面积外标法计算含量，考察方法的回收率和相对标准偏差(RSD)。结果见表I。
权利要求
1.一种乳制品中蛋白掺假的分析方法，其特征在于包括如下步骤 (1)样品液和标准液的制备将样品分为两份，ー份进行碱解，一份酸解；碱解后以酸进行中和，酸解后进行蒸干并以稀酸复溶，复溶液以衍生剂进行衍生化，有机滤膜过滤，得到样品液；分别配制色氨酸标准溶液以及苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的混合标准溶液衍生液； (2)含量測定分别将步骤(I)中所述的标准溶液、混合标准溶液衍生液及样品液注入高效液相色谱仪中，然后测量标准溶液、混合标准溶液衍生液及样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸相对应的峰面积，计算样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的含量。
2.根据权利要求I所述的分析方法，所述碱解为以氢氧化锂溶液为碱，通氮排氧后在105 110°C下进行碱解19 21h ;所述酸解为以盐酸溶液为酸，通氮排氧后在105 110°C下进行酸解2f23h;所述中和为用酸将体系的pH值调至7±0. 05 ;稀酸复溶为以O. 005、. 015mol/L盐酸水溶液为稀酸；所述衍生化为以衍生剂对酸解复溶液进行室温衍生 50 70min。
3.根据权利要求I所述的分析方法，其特征在于步骤(I)中，所述碱解为以氢氧化锂溶液为碱，通氮排氧后在110°c下进行碱解20h ;所述酸解为以盐酸溶液为酸，通氮排氧后在110°C下进行酸解22h ;所述中和为用酸将体系的pH值调至7 ;稀酸复溶为以O. 01mol/L盐酸水溶液为稀酸；所述衍生化为以衍生剂对酸解复溶液进行室温衍生lh。
4.根据权利要求1、2或3所述的分析方法，其特征在于所述衍生剂为异硫氰酸苯酷。
5.根据权利要求1、2或3所述的分析方法，其特征在于所述衍生剂为体积比为1:1的O. I mol/L异硫氰酸苯酯-こ腈溶液及I mol/L三こ胺-こ腈溶液。
6.根据权利要求I、2或3所述的分析方法，其特征在于碱解为以rSmol/L氢氧化锂溶液为碱；酸解为以6mol/L盐酸溶液为酸。
7.根据权利要求I所述的分析方法，其特征在于步骤(2)中含量測定所用的色谱条件为紫外检测器，检测波长为24(T260nm ;色谱柱为碳十八液相色谱柱；こ腈与15 30mmOl/L磷酸氢ニ钾组成的缓冲溶液作为流动相；控制こ腈浓度在1(Γ70体积％范围内进行梯度洗脱；流速为O. 5 I. 5ml/min ;柱温为20 35。。;进样量为I 20 μし
8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于所述的色谱条件为紫外检测器，检测波长为254nm ;色谱柱为SunFire C18型色谱柱；こ腈与25mmol/L磷酸氢ニ钾组成的缓冲溶液作为流动相；流速为lml/min ;柱温25°C ;进样量为10μし
9.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于梯度洗脱的条件为(Tl分钟，こ腈在缓冲溶液中的比例由10体积％上升为25体积％ ； Γ21分钟，こ腈比例由25体积％上升为7 0体积％。
10.根据权利要求I所述的分析方法，其特征在于步骤(2)中所述的含量測定，其含量计算方法为标准曲线法。
全文摘要
本发明公开了一种乳制品中蛋白掺假的分析方法，其方法为首先将样品分为两份，一份进行碱解，一份酸解；碱解后以酸进行中和，酸解后进行蒸干并以稀酸复溶，复溶液以衍生剂进行衍生化，有机滤膜过滤，得到样品液；分别配制色氨酸标准溶液以及苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的混合标准溶液；再分别将标准溶液和样品液注入高效液相色谱仪中，然后测量标准溶液和样品液的峰面积，计算样品液中色氨酸、苏氨酸、缬氨酸和赖氨酸的含量。该方法操作简单、能够快速得出分析结果、分析成本低、易于推广应用。
文档编号G01N30/88GK102866221SQ20121030971
公开日2013年1月9日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者柳春红, 赖玉婷, 董芷呈, 陈挺强, 王培坚, 李明芬 申请人:华南农业大学