专利名称：用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法
技术领域：
本发明涉及对血液保存或血液代用品中高铁血红蛋白(MetHb)含量的测定方法，特别是涉及一种用拉曼光谱法测定高铁血红蛋白(MetHb)含量的方法。
背景技术：
目前，供血短缺的情况日益凸显，血液代用品的研发势在必行，高铁血红蛋白(MetHb)含量这一指标在血液代用品质量控制中必不可少。其中，基于血红蛋白的氧载体(HBOCs)是目前研究较多的一类血液代用品，美国FDA已将高铁血红蛋白(MetHb)含量作为HBOCs产品必检指标。现有对血液或血液代用品中MetHb含量的测定方法主要都是利用可见光或紫外光光源产生的光谱测定，主要有氰化物法、计算分光光度法和等吸 收点法(阚雪梅，et al.，高铁血红蛋白含量测定方法研究进展.军事医学科学院院刊，(04) :p. 385-388.)。血液代用品制备过程中会涉及到血红蛋白的改构，改构的血红蛋白光学性质改变，并且其粒径小于可见光波长，测量时引起光散射，导致测量结果不准确。以上方法用于血液代用品质控时分别存在以下缺陷氰化物法测定原理是利用弱酸性条件下加入氰化物与MetHb结合形成MetHb -CN,从而使MetHb的特征吸收峰消失。加入氰化物前后吸收值的变化与MetHb的含量成正比。本测定方法基于吸收值的变化，除MetHb外其他成分在加入氰化物前后吸收值不发生变化，方法准确度不受溶液中其他成分的影响。氰化物法适用于几乎所有红细胞和无基质血红蛋白样品(血红蛋白溶液)，不受种属差异的限制。对于HbV (微囊包裹的血红蛋白)等容易引起光散射或膜难以破坏不能完全释放血红蛋白的样品，不能使用以血红蛋白光学吸收特性为基础的测定方法，包括氰化物法。氰化物遇酸或紫外线照射可产生剧毒的HCN气体，试剂保存时间短，所以，氰化物法不适合HBOCs (血红蛋白氧载体)的在线检测。计算分光光度法是利用物质在一定波长处吸收值与浓度之间呈线性关系及多组分物质在某波长处吸收值等于各组分吸收值之和建立的。利用分光光度计直接测定样品在多个波长处的吸收值来计算MetHb含量，主要有三波长法、四波长法和连续波谱法。计算分光光度法原理多被各种血气分析仪采用。计算分光光度法易受血红蛋白种属来源和溶液PH影响。它是将红细胞溶血后释放血红蛋白，测定样品在某些波长处的吸收值，操作简单、快速、安全，但是计算公式推导过程相对复杂。在推算MetHb含量计算公式时需要特定条件下各成分的消光系数ε，对于文献中无法查到的ε需要实验计算，相对麻烦。等吸收点法是相同浓度的两种物质在某波长处的吸收值相同，该波长称为这两种物质的等吸收点。如文献(高铁血红蛋白简易测定法，刘兰廷，黄如衡，军事医学科学院院干IJ，1986年第10卷第3期，229-233)报导，使用兔血进行实验得到，相同浓度的O2Hb (氧和血红蛋白)和MetHb吸收曲线在某波长处相交，即两者的消光系数相同，当样品总浓度相同，O2Hb与MetHb比例不同，在该波长处的吸收值仍相同。等吸收点法是利用等吸收点和郎伯比尔定律得到MetHb含量的计算公式
权利要求
1.用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%-行測定的方法，包括以下步骤 I)针对待测样品的种类制备不同高铁血红蛋白含量的标准溶液将质量浓度为10%的K3Fe(CN)6溶液以不同体积分别与待测样品混合，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液，用已知的检测方法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb% ； 2 )用显微共焦拉曼光谱仪对上述含有不同高鉄血红蛋白含量的标准溶液进行检测，测定范围在1200-1300(^1之间，得到含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的拉曼光谱；并对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑； 3)确定拉曼光谱法的測定公式按算式1 =レllW xlOO计算含有不同高铁血红蛋白含量的标准溶液的PR值，其中I1215为拉曼光谱在拉曼频率为1215cm—1处的峰強度 值，I1227为拉曼光谱在拉曼频率为1227cm—1处的峰强度值；依据PR值与步骤I)定值的MetHb%值确定线性关系式PR=kl MetHb%+a, kl为斜率，a为截距，再反推确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式； 4)按步骤2)的操作測定待测样品的拉曼光谱，并按步骤3)的操作得到待测样品的PR值，代入步骤3)确定的拉曼光谱法PR_MetHb%推导算式，得到待测样品的MetHb%結果。
2.根据权利要求I所述方法，其特征在于，所述待测样品为无基质血红蛋白、血液代用品或血液，待测样品形式为液体原样或袋装样品，所述种类为动物或人；步骤3)线性关系PR=kl MetHbW+a中的kl和a的数值需要通过测定相应种类已知高铁血红蛋白含量的样品确定。
3.根据权利要求I或2所述方法，其特征在于，所述步骤2)中用origins.0软件对拉曼光谱进行基线校准和曲线顺滑。
4.根据权利要求I或2或3所述方法，其特征在于，所述步骤I)中所述已知的检测方法包括氰化物法、计算分光光度法、血气分析法和等吸收点法。
5.根据权利要求I或2或3所述方法，其特征在于，针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量MetHb%-行測定，所述步骤I)用等吸收点法定值标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度MetHb% ;所述等吸收点法包括在比色皿中加入50 u I不同高铁血红蛋白含量的溶液和3mL缓冲液1/60M pH6. 6PBS，用紫外/可见分光光度计测量A590和A630的吸光度，代入MetHb含量的计算公式= 式中，Ex、E分别为630nm与590nm的吸光度；R为100%高铁血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为1.27±0.01，r为100%血红蛋白在630nm和590nm吸光度的比例常数，为0. 05±0. 01，定值得到高铁血红蛋白的标准溶液中高铁血红蛋白的质量浓度。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤3)确定的线性关系式为 PR=O. 427MetHb%+17. 2，确定的 PR_MetHb% 推导算式为MetHb%=(0. 0233PR-0. 397)X100%。
7.一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白质量浓度MetHb%进行測定的方法，包括以下步骤 I)用显微共焦拉曼光谱仪对待测牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300(^-1,得到样品的拉曼光谱；用origins. O软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑； 2)读取样品的11215、I1227数据，I1215为在拉曼频率为1215CHT1处的峰强度值，I1227为在拉曼频率为1227cm—1处的峰强度值代入算式
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述牛血红蛋白溶液样品为没有包装的溶液或有透明包装的袋装溶液。
9.一种针对牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行实时在线检测的方法，包括以下步骤 1)在线取需检测的牛血红蛋白溶液样品； 2)用显微共焦拉曼光谱仪对牛血红蛋白溶液样品进行检测，检测范围设置为1200-1300(^-1,得到样品的拉曼光谱；用origins. O软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑； 3)读取样品的11215、I1227数据，I1215为在拉曼频率为1215CHT1处的峰强度值，I1227为在拉曼频率为1227cm—1处的峰强度值代入算式
10.一种针对袋装保存的血液代用品牛血红蛋白溶液中的高铁血红蛋白含量进行无损检测的方法，包括以下步骤 1)直接将袋装保存的牛血红蛋白溶液作为检测样品； 2)用显微共焦拉曼光谱仪隔袋对样品进行检测，检测范围设置为1200-1300(^'得到样品的拉曼光谱；用origins. O软件对该拉曼光谱进行基线校准后再曲线顺滑； 3)读取样品的11215、I1227数据，I1215为在拉曼频率为1215CHT1处的峰强度值，I1227为在拉曼频率为1227cm—1处的峰强度值代入算式
全文摘要
本发明公开了用拉曼光谱法对待测样品中高铁血红蛋白含量MetHb%进行测定的方法，通过确定拉曼光谱法PR-MetHb%推导算式，对待测样品进行拉曼光谱检测并得到其高铁血红蛋白含量MetHb%。本发明具有灵敏度高、结果准确、重复性好、实验步骤简单、分析速度快、试剂无污染、安全的优点，甚至样品无需进行提前处理，隔着包装即可直接进行检测，可以进行实时原位无损检测。本发明可针对无基质血红蛋白、血液代用品或血液中高铁血红蛋白含量的测定，应用前景广阔。
文档编号G01N21/65GK102854177SQ201210335419
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月11日 优先权日2012年9月11日
发明者周虹, 赵莲, 王瑛, 郭延军, 卢明子, 阚雪梅, 尤国兴, 陈赣, 罗鑫, 张宁 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所