专利名称：一种检测食品中三聚氰胺含量的elisa方法
技术领域：
本发明涉及一种检测食品中三聚氰胺含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)，属于食品安全监督或食品分析的研究领域。
背景技术：
三聚氰胺(melamine)，化学名称为2，4，6-三氨基-1，3，5_三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺等，是一种重要的氮杂环有机化工原料，用途十分广泛。三聚氰胺最主要的用途是作为生产三聚氰胺甲醛树脂(MF)的原料，被广泛运用于木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业；三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。由于三聚氰胺分子中含有大量氮 元素，而常规的“凯氏定氮法”测饲料或食品中蛋白质含量时不能排除这类“伪蛋白氮”的干扰，因而一些不法分子为降低成本在小麦粉、大米粉、饲料、奶粉等植物性或动物性高蛋白类食品中添加这种非食品性化工原料，以提高其产品中的蛋白质含量。2007年，美国爆发宠物食品受污染事件。事后调查表明掺杂了彡6. 6%三聚氰胺的小麦蛋白粉是宠物食品导致中毒的原因。2008年9月，中国爆发三鹿婴幼儿奶粉受污染事件，导致食用了受污染奶粉的婴幼儿产生肾结石病症，其原因也是奶粉中含有三聚氰胺。根据美国食物及药物管理局(FDA)的标准，三聚氰胺每日可容忍摄入量为每日O. 63毫克/公斤体重。FDA指出，除婴儿食品外，普通食物中含有三聚氰胺和其类似物质限量值为
2.5mg/kg，婴儿食品中则不应该含有任何剂量的三聚氰胺。欧盟、澳大利亚和新西兰等许多国家和地区也普遍采用2. 5mg/kg为最低检出值。2008年10月7日，我国卫生部、工业与信息化部、农业部、国家工商管理总局、国家质检总局五部门联合制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为lmg/kg ;含乳15%以上的其他食品中三聚氰胺的限量值为2. 5mg/kg。现有的文献报道的三聚氰胺的检测方法主要有重量法(包括苦味酸法及升华法)、电位滴定法、液相色谱检测法、液相色谱-质谱联用检测法、气相色谱-质谱检测法以及试剂盒检测法(ELISA)等。前三种方法对仪器的要求较低，但前处理方法和检测限不能达到目前对食品中三聚氰胺的检测要求。高效液相色谱法简便、快速，适用于食品中含量较高的三聚氰胺的定量工作，若同时利用二极管阵列检测器可作初步定性，成本低于质谱法，易于推广。而液质联用法不需要进行衍生化，简化了样品处理的步骤，与气相色谱质谱联用法和液相色谱法相比，具有高灵敏度和高选择性的特点，更适合于食品中三聚氰胺的快速筛查和定量分析。我国已有GB/T22388-2008和GB/T22400-2008两个标准，包含了 HPLC法和HPLC-MS法，并把HPLC法作为快速筛分原料乳中三聚氰胺的手段。HPLC-MS也是美国FDA用于检测和定量食品中三聚氰胺的基本分析方法，其检测限可达ppb级。酶联免疫吸附法则比较简单快速，可以节约较多的资源。现在市场上已有三聚氰胺的试剂盒出售和相关文献的报道。国内已有申请ELISA测定食品中三聚氰胺含量的专利，如专利号为CN101206223A (中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所)，专利号为CN101407580A (吉林大学)，专利号为CN101429243A (浙江大学)。但是所报道的方法的检测灵敏度均不够高，不能很好的满足现实生活中对三聚氰胺检测的需要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种检测食品中三聚氰胺含量的酶联免疫吸附分析方法，其特点是基于抗原与抗体之间特异性反应而建立的分析方法。本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外均为重量份数。检测食品中三聚氰胺含量的酶联免疫吸附分析方法三聚氰胺完全抗原的制备及检测食品中三聚氰胺含量的ELISA方法，包括以下步骤步骤一三聚氰胺修饰物的制备；步骤二 免疫原和包被抗原的制备； 步骤三三聚氰胺单克隆抗体的制备；步骤四建立测定三聚氰胺的酶联免疫吸附分析方法；步骤五ELISA对加标样品中三聚氰胺含量的测定。其中，所述步骤一包括I)三聚氰胺半抗原A (Hapten A)的合成称取2-氯-4，6- 二氨基-1，3，5_三嗪(CAAT)加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入对氨基苯甲酸溶于氢氧化钾的无水甲醇中。反应回流5 12小时，直到CAAT反应完全。反应混合物过滤，并用无水乙醇和蒸馏水各洗三次，得到白色粗产物。再用甲醇/ 二氯甲烷按一定的溶剂比过柱，得到纯品。其反应式如下
权利要求
1.一种检测食品中三聚氰胺含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 步骤一三聚氰胺修饰物的制备； 步骤二 免疫原和包被抗原的制备； 步骤三三聚氰胺单克隆抗体的制备； 步骤四建立测定三聚氰胺的酶联免疫吸附分析方法； 步骤五=ELISA对加标样品中三聚氰胺含量的测定。
2.根据权利要求I所述的方法，其中，所述步骤一包括 1)三聚氰胺半抗原A(Hapten A)的合成 称取2-氯-4，6- 二氨基-1，3，5-三嗪(CAAT)加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入对氨基苯甲酸溶于氢氧化钾的无水甲醇中；反应回流5 12小时，直到CAAT反应完全；反应混合物过滤，并用无水乙醇和蒸馏水各洗三次，得到白色粗产物；再用甲醇/ 二氯甲烷按一定的溶剂比过柱，得到纯品；其反应式如下
3.根据权利要求I所述的方法，其中，所述步骤二包括 分别称取Hapten A或Hapten B,或Hapten C和二环己基碳二亚胺，N-轻基琥拍酰亚胺，一同溶解于二甲基甲酰胺中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5 20分钟，取上层清液，缓慢加入到O. 0Γ0. 02%的牛血清白蛋白即BSA和O. 0Γ0. 02%卵清白蛋白即0VA，搅拌Γ10小时，离心分离，取上层清液，透析数天，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，HaptenA-BSA、Hapten B-BSA 和 Hapten C-BSA 为免疫原；Hapten A-OVA> Hapten B-0VA 和 HaptenC-OVA为包被抗原，即分别是包被抗原A、包被抗原B和包被抗原C。
4.根据权利要求I所述的方法，其中，所述步骤四包括 (1)溶液配制； (2)间接竞争ELISA步骤； (3)ELISA的优化条件和灵敏度； (4)ELISA的标准曲线； (5)ELISA的特异性。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(I)溶液配制包括 (a).碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液； (b).磷酸缓冲液； (c).酪蛋白溶液； (d).磷酸缓冲液-吐温储备液； (e).底物溶液；(f)· H2SO4 溶液； (g)RPMI-IMO 培养液。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(2)间接竞争ELISA步骤包括 (a).加入包被抗原于酶标板中，每孔200μ L，冰箱4°C过夜； (b)·用PBST缓冲液，PBST储备液，1:10稀释，350 μ L/孔，洗板三次； (c).加入酪蛋白进行封阻，每孔300μ L，室温保温保湿放置I小时；(d).用PBST缓冲液洗板三次； (e).在酶标板的每孔中依次分别加入100μ L标准溶液和100 μ L一定稀释度的单克隆抗体，室温保温保湿放置I小时； (f)·用PBST缓冲液洗板三次； (g).加入酶标二抗(羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶，GaMIgG-HRP),每孔200μ L，室温保温保湿放置I小时； (h).用PBST缓冲液洗板三次； (i).加入底物溶液，每孔200μ L，室温保温保湿避光反应，在微量振荡器上振摇约15 25分钟； (j) ·加入5%H2S04溶液，每孔5(Γ100 μ L，终止酶反应； (k).用酶标仪测定吸光度，作出标准曲线，进行结果分析与讨论。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(3)ELISA的优化条件和灵敏度 包括抗原浓度为10(T2000ng/mL ;抗体稀释度为I :2000(Tl :50000 ;羊抗兔辣根过氧化物酶稀释度为I :500(Tl :10000 ;封阻液为l%casein ;孵育时间为Ih ;显色时间为15min。
8.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(4)ELISA的标准曲线包括 分别选用包被抗原A、包被抗原B和包被抗原C作为包被抗原，考察了 ELISA的灵敏度； 分别以目标物浓度的对数为横坐标，以相对信号B/BplOO。/。为纵坐标作出标准曲线； B0 :标准浓度为Ong/mL所对应的吸光度；B :其它标准浓度所对应的吸光度。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，所述(5)ELISA的特异性包括 ELISA特异性可用交叉反应率的大小来表示； 交叉反应率CR%=三聚氰胺的IC5tl/测试物质的IC5tlX 100% ； 交叉反应率越小，ELISA的特异性越高。
10.根据权利要求I所述的方法，其中，所述步骤五包括 选择四种样品纯牛奶、奶粉、猪饲料和鸡饲料进行加标反应实验；同一样品取两份，一份加入适量的三聚氰胺溶液，一份作为空白样品；纯牛奶样品稀释后直接用ELISA测定，奶粉样品用PH=7. 4磷酸缓冲液溶解后稀释直接用ELISA测定，动物饲料样品加入三氯乙酸溶液，超声提取20min后，4°C下lOOOOg/lOmin离心，上清稀释后用ELISA直接测定。
全文摘要
本发明公开了检测食品中三聚氰胺含量的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。其特点是合成了三种不同的三聚氰胺半抗原衍生物，并将衍生物与载体蛋白质交联，合成三种免疫原和包被抗原，运用杂交瘤单抗制备技术制得单克隆抗体。四种样品即纯牛奶、奶粉、鸡饲料和猪饲料中加入不同量的三聚氰胺，并用ELISA直接测定，加标回收率为72.6–133.3%，相对标准偏差为0.8–18.9%；加标样品同时用HPLC和ELISA检测并比较测定结果，回归曲线为Y=1.5589x-1.4004，线性相关系数为0.9902，表明两种方法有较好的相关性。
文档编号G01N33/531GK102879572SQ20121036337
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者邓安平, 曹碧云, 杨红, 宋娟 申请人:苏州大学