不同基质乳制品中三聚氰胺含量的拉曼光谱测量方法与流程

本发明涉及乳制品中的三聚氰胺含量检测领域，尤其涉及不同基质乳制品中的三聚氰胺含量的检测方法。

背景技术：
国家发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T22388-2008)，规定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三种测定方法，即高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法(GC-MS)，气相色谱-质谱/质谱法(GC-MS/MS)]。虽然这些方法可以进行准确的定性及定量分析，但由于操作复杂、操作条件苛刻、耗材成本高、测试速度慢等限制，使得这些方法只能在实验室进行检测。中国检验检疫科学研究院公开了专利申请公开号为CN101477051，题目为《用于液态奶中三聚氰胺现场快速检测的拉曼光谱法及试剂盒》，该专利申请公开了一种采用拉曼光谱法定量检测液态奶中三聚氰胺含量的方法，该方法主要通过研究生鲜奶的拉曼光谱特征峰强随三聚氰胺浓度变化的特征曲线，并利用特征曲线和待测生鲜奶的拉曼光谱。它能够比较快速实现对三聚氰胺的检测，对生鲜奶中三聚氰胺的含量有比较好的检测效果。但对其它液态奶进行检测时，由于各种不同液态奶中成分不同，它们的特征曲线会和生鲜奶有一定差异，而如果仍然按照生鲜奶的特征曲线进行定量计算，会导致计算结果和实际值会有比较大的差异。实际测量结果表明该方法对市售的各种液态奶检测时有比较大的测量偏差。产生测量偏差主要是由于各种不同液态奶中成分不同，而这些不同的基质会对拉曼光谱检测带来很大的影响。因此，解决乳制品中不同基质对测量的干扰是应用拉曼光谱对乳制品中三聚氰胺定量检测面临的主要困难。有鉴于此，确有需要提供一种能快速地和/或准确地对不同基质乳制品中的三聚氰胺含量进行定量分析的方法。

技术实现要素：
本发明的目的旨在解决现有技术中存在的上述问题和缺陷的至少一个方面。鉴于上述分析可知，本发明的目的之一是建立一套利用拉曼光谱解决乳制品中不同基质干扰的测试和数据分析方法，利用拉曼光谱法实现对不同基质乳制品中三聚氰胺的定量检测。根据本发明的一个方面，提供了一种用于不同基质乳制品中三聚氰胺含量检测的拉曼光谱测量方法，其包括以下步骤：(a)建立不同基质乳制品的特征曲线的数据库；(b)量取多份某一未知基质的待测乳制品，向其中添加不同浓度的三聚氰胺标准液，得到一系列已知三聚氰胺相对浓度的该基质的乳制品样本；(c)对于所述乳制品样本进行拉曼光谱测试分析并获得相对应的特征峰强，从而获得所述乳制品样本的特征峰强随三聚氰胺相对浓度变化的特征曲线的斜率；(d)利用所述乳制品样本的特征曲线的斜率在步骤(a)中建立的数据库中搜索以找到与之相匹配的特征曲线；(e)利用该特征曲线和待测乳制品的特征峰强计算该待测乳制品中的三聚氰胺的浓度。进一步地，在步骤(b)中，在添加三聚氰胺标准液到待测乳制品中之后，还将水、有机溶剂或盐加入到所述待测乳制品中，待混合均匀、经离心处理后，取其清液待测。另外，向所述清液中添加纳米材料增强剂，混合均匀后，形成所述待测乳制品的样本。在另一实施例中，在步骤(c)中，所述获取特征峰强的方法是：将获得的乳制品样本的拉曼光谱进行扣背底处理，以获得平坦的拉曼光谱；将拉曼光谱中的第一特征峰拉曼频移处的峰面积除以第二特征峰拉曼频移处的特征峰面积，从而获得特征峰强。具体地，所述第一特征峰的拉曼频移在707cm-1附近；所述第二特征峰的拉曼频移在935cm-1附近。在另一实施例中，在步骤(a)中，通过高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、或气相色谱-质谱联用法来检测一系列具有相同基质的乳制品样本中三聚氰胺的浓度；利用拉曼光谱法获取这些相同基质的乳制品样本的特征峰强，从而建立该基质乳制品的特征峰强随三聚氰胺浓度变化的特征曲线；之后，通过检测多种不同基质乳制品的特征曲线，建立不同基质乳制品特征曲线数据库。优选地，水包括去离子水或蒸馏水；有机溶剂包括酒精或丙酮；盐包括氯化钾或氯化钠。优选地，所述纳米材料增强剂包括为尺度在1-1000nm范围内的金属纳米材料、金属纳米线、金属纳米团簇、碳纳米管和碳纳米颗粒中任一种或他们的组合。更优选地，所述金属纳米颗粒材料包括金、银、铜、镁、铝、铁、钴、镍、钯、铂的纳米颗粒材料。在另一实施例中，在步骤(c)中，所述获取特征曲线斜率的方法是：根据特征峰强随三聚氰胺浓度的变化通过差量法或直线拟合的方法确定特征曲线的斜率。附图说明本发明的这些和/或其他方面和优点从下面结合附图对优选实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是根据本发明实施例的已经建立的不同基质乳制品的特征曲线的数据库的一部分的示意图。图2a-2c是采用根据本发明实施例的方法测量某一基质的液态奶的三个添加不同浓度的三聚氰胺标准液之后的待测液态奶样本的拉曼光谱图。图3是在本发明中通过计算所获得的图2a-2c中的待测液态奶样本的特征曲线的示意图。具体实施方式下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。在说明书中，相同或相似的附图标号表示相同或相似的部件。下述参照附图对本发明实施方式的说明旨在对本发明的总体发明构思进行解释，而不应当理解为对本发明的一种限制。本发明的主要构思是：对同一基质的已知三聚氰胺浓度的乳制品进行拉曼光谱测试分析；建立同一基质乳制品的三聚氰胺浓度和对应拉曼光谱特征峰强的特征曲线；研究分析多种不同基质乳制品的三聚氰胺浓度和对应拉曼光谱特征峰强的特征曲线以建立所述特征曲线的数据库；对待测乳制品采用相对法进行拉曼光谱多点测量以确定特征曲线的斜率，结合数据库建立待测乳制品的特征曲线，利用特征曲线计算待测乳制品中三聚氰胺的含量。根据本发明的用于不同基质乳制品中三聚氰胺含量检测的拉曼光谱法包括以下步骤：1)制备已知三聚氰胺浓度的样本：乳制品中三聚氰胺的浓度可以通过国家标准测定方法(高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)和气相色谱-质谱联用法[包括气相色谱-质谱法(GC-MS)，气相色谱-质谱/质谱法(GC-MS/MS)])进行测定，通过向其中添加不同浓度的三聚氰胺标准液，获得一系列已知三聚氰胺浓度的样本；2)拉曼光谱测量：取定量样本，向其中添加定量的水、有机溶剂或者盐等化学药品，混匀后离心，取清液待测。将定量清液和纳米材料增强剂混合，利用拉曼光谱仪测量其拉曼光谱；3)特征峰强分析：获取拉曼光谱中三聚氰胺某一特征峰拉曼频移处的信号(或峰面积)相对于另一特征峰拉曼频移处的信号(或峰面积)的相对强度，即某一特征峰的特征峰强；4)建立特征曲线：对相同基质的乳制品，建立特征峰强随三聚氰胺浓度变化的特征曲线；5)建立数据库：对不同基质的乳制品分别建立特征曲线以构成相应的数据库(如图1所示，图1中所示出的三聚氰胺浓度的零点或0ppm，表示牛奶样品中实际上不含有三聚氰胺)；6)相对测量：取多份待测乳制品或奶制品，向其中分别添加不同浓度的三聚氰胺标准液，得到一系列已知三聚氰胺相对浓度的不同基质的乳制品待测样本，按照步骤2)方法测量各待测样品的拉曼光谱(如图2a-2c所示)，获取特征峰强；7)定量分析：利用步骤5)建立的数据库和步骤6)相对测量得到的拉曼光谱的特征峰强，建立待测乳制品的特征曲线(参见图3)。结合特征曲线和待测样本拉曼光谱的特征峰强，定量计算出三聚氰胺浓度。采用上述的相对测试和数据分析方法，可以对乳制品中三聚氰胺含量实现定量检测，当三聚氰胺含量在2.5mg/kg以上时，检测回收率在80％--110％，相对标准偏差小于10％。在本发明中，建立不同基质乳制品的特征曲线的数据库具体步骤为：通过国家规定的高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、或气相色谱-质谱联用法来检测一系列具有相同基质的乳制品样本中三聚氰胺的浓度；利用拉曼光谱法获取这些相同基质的乳制品样本的特征峰强，从而建立该基质乳制品的特征峰强随三聚氰胺浓度变化的特征曲线；之后，通过检测多种不同基质乳制品的特征曲线，建立不同基质乳制品特征曲线数据库。在本发明中，步骤2)中应用的纳米材料增强剂包括为尺度在1-1000nm范围内的金属纳米颗粒、纳米线以及纳米团簇、碳纳米管、碳纳米颗粒中的任一种或他们的组合。所述金属纳米颗粒、纳米线或纳米团簇包括金、银、铜、镁、铝、铁、钴、镍、钯、铂中任一种或他们的组合的的纳米颗粒或材料、纳米线或纳米簇。另外，在步骤2)中，水包括去离子水或蒸馏水；有机溶剂包括酒精或丙酮等；盐包括氯化钾或氯化钠等。在步骤3)中，所述获取特征峰强的方法是：将获得的乳制品样本的拉曼光谱进行扣背底处理，以获得平坦的拉曼光谱；将拉曼光谱中的第一特征峰的拉曼频移处的对应的峰面积除以第二特征峰的拉曼频移处的对应的特征峰面积，从而获得特征峰强。优选地，所述第一特征峰的拉曼频移在707cm-1附近；所述第二特征峰的拉曼频移在935cm-1附近。在本发明中，所述获取特征曲线斜率的方法是：根据特征峰强随三聚氰胺浓度的变化通过差量法或直线拟合的方法确定特征曲线的斜率。同目前国标《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》(GB/T22388-2008)中提到的方法相比，采用拉曼光谱法具有样品前处理简单、实验耗材成本低、可进行现场快速检测等优势。相比于已经报道的其它的拉曼光谱法，本发明最大的优势是解决了基质对检测的干扰。本发明的方法不仅仅局限于对某一种乳制品的检测，对市售的二十多种液态乳制品，它都能实现定量检测，测定限为2.5mg/kg，重现性良好(定量分析，RSD≤10％)。实施例步骤1：向多个离心管中分别倒入500μl已知三聚氰胺浓度的液态奶，向其中分别添加50μl不同浓度的三聚氰胺标准液，并向其中添加800μl无水乙醇，涡旋10秒钟后置于离心机中，于14000rpm转速离心12分钟，取上层清液待测。步骤2：向测试瓶中添加430μl银纳米增强剂的溶液(浓度为100毫克/升，银纳米材料或颗粒的尺度在30-150nm的范围之间)和200μl上述的牛奶清液，涡旋混匀。步骤3：用现有技术中的激光光源发射波长为785nm的拉曼光谱仪检测混合液的拉曼光谱，激光功率为450mw，积分时间为1s，连续扫描光谱15次，取平均光谱。步骤4：将特征峰拉曼频移707cm-1的对应峰的峰面积除以特征峰的拉曼频移为935cm-1的对应峰的峰面积，获得707cm-1拉曼频移处特征峰的拉曼信号的相对强度，即特征峰强。步骤5：对于不同含量三聚氰胺的液态奶样品，建立707cm-1附近特征峰的相对强度随三聚氰胺浓度变化的线性关系的特征曲线。步骤6：对不同基质的液态奶分别建立对应的特征曲线，从而建立多个不同基质的液态奶的特征曲线数据库。如图1所示，其示出了6种不同基质的液态奶(例如牛奶1-6)的拉曼特征峰强随三聚氰胺浓度变化的特征曲线。步骤7：取多份待测的某一未知基质的液态奶，向其中添加不同浓度的三聚氰胺标准液，得到一系列已知三聚氰胺相对浓度的所述未知基质液态奶待测样本。具体地，在本实施例中，量取三份500μl的待测液态奶，并分别向其中添加50μl的水、15ppm三聚氰胺标准液和35ppm三聚氰胺标准液，以与上述步骤1和2所述的步骤相同的方法制备液态奶待测样本(即将步骤1和2中的已知三聚氰胺浓度的液态奶替换成同样体积的待测液态奶，保持其它参数、条件或处理顺序完全相同)。假设待测液态奶中三聚氰胺浓度为X，三个样本中三聚氰胺浓度可以看作为X，X+1.5ppm，X+3.5ppm。步骤8：利用所述待测液态奶的特征曲线的斜率在之前建立的数据库中寻找对应的与之匹配的特征曲线。具体地，按照前面所述的步骤的方法测量各待测样本的拉曼光谱，获取特征峰强，从而获得待测液态奶的特征曲线。其中参考图2a-2c，示出了待测液态奶的拉曼峰强与拉曼频移的拉曼光谱图。通过使用步骤3中的相应的方法，测得三个待测液态奶样本的拉曼光谱，如图2a、2b、2c所示。计算得到特征峰强(707cm-1特征峰拉曼频移处拉曼信号的相对强度)分别为：0.691，1.030，1.426，从而得到三聚氰胺浓度和特征峰强的对应关系，如表1：表1示出待测液态奶样本的三聚氰胺相对浓度与特征峰强的关系利用三聚氰胺相对浓度和特征峰强计算相应的特征曲线的斜率。将X设置为任意某一值，对上述三组数据进行直线拟合(图3是假设X＝0，得到的拟合曲线)，拟合得到斜率为0.21。通过斜率在数据库中查询匹配的特征曲线为Y＝0.21X+0.37。步骤9：利用特征曲线和待测液态奶的拉曼光谱的特征峰强定量计算待测液态奶中三聚氰胺的浓度。待测液态奶样品特征峰强Y＝0.691，利用特征曲线计算得到待测液态奶样品三聚氰胺浓度为1.53ppm，非常接近它的实际浓度1.50ppm(该实际浓度是通过国家规定的检测方法获得的)。对多个样品按照上述方法进行测量，发现三聚氰胺含量小于或等于2.5-5ppm的范围内，回收率在80％--110％之间，相对标准偏差小于10％。对步骤7，同样可以取多份未知基质的已知三聚氰胺相对浓度的样品进行测量，以确定多个未知基质的液态奶乳制品中的三聚氰胺的浓度。虽然本发明总体构思的一些实施例已被显示和说明，本领域普通技术人员将理解，在不背离本总体发明构思的原则和精神的情况下，可对这些实施例做出改变，本发明的范围以权利要求和它们的等同物限定。