液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，属于液体乳分析技术领域。本发明中，试样采用乙酸水溶液进行提取，乙腈沉淀蛋白并稀释，Acquity UPLC BEH HILIC（100mm×2.1mm i.d.，粒径1.7 μm）分离，电喷雾离子源多反应监测（MRM）模式串联质谱进行测定。本发明优化了提取溶剂、提取时间、净化方式和仪器测定条件等。结果表明：三聚氰胺在0.02 ng/mL?20 ng/mL，舒巴坦在 0.05 ng/mL?100 ng/mL范围内具有较好的线性关系，相关系数大于0.99。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在82.5%?103.5%之间，相对标准偏差（RSD n=6）在0.9 %?5.1%之间，三聚氰胺和舒巴坦的方法定量限分别为10 μg/kg和1.0 μg/kg。本发明前处理操作简单快捷，亲水作用色谱?串联质谱法检测灵敏度高，定性定量准确。
【专利说明】
液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，属于液体乳分析技 术领域。
【背景技术】
[0002] 三聚氰胺学名三氨三嗪，别名蜜胺，是一种重要的含氮杂环有机化工原料，白色结 晶粉末，无味，常用于生产塑料、胶水、阻燃剂和化肥。蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量 一般不超过30%，而三聚氰胺的分子式含氮量约为66%。通用的蛋白质测试方法凯氏定氮法 是通过测定含氮量来估算蛋白质含量，因此，添加三聚氰胺会使得液体乳中蛋白质测试含 量偏高。长期摄入三聚氰胺会造成生殖和泌尿系统的损害，膀胱和肾部结石，并可进一步诱 发膀胱癌。
[0003] 目前报道的食品或饲料中三聚氰胺的检测方法主要有液相色谱法、液质联用法、 气质联用法、酶联免疫法等，测定复杂基质的食品中三聚氰胺均需经过固相萃取净化或衍 生化，操作繁琐。
[0004] 2008年10月7日发布国家标准GB/T 22388 -2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺 检测方法》，确定了高效液相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法和气相色谱-质谱联用法作为 三聚氰胺的3种测定方法。3种方法均使用固相萃取柱对样品进行净化，操作步骤相对比较 繁琐，前处理时间长。尤其GC-MS (或GC-MS/MS)净化后还需要进一步衍生化。
[0005] 同年10月15日质检总局发布国家标准GB/T 22400 -2008《原料乳中三聚氰胺快 速检测液相色谱法》，该标准只针对原料奶和不含添加物的液态奶，采用乙腈作为样品的蛋 白沉淀剂和三聚氰胺提取剂，磷酸盐为流动相，强阳离子交换色谱柱进行液相色谱分离测 定。磷酸盐使用后需要长时间冲洗色谱系统，否则遇到高比例有机相磷酸盐就会析出，造成 单向阀堵塞及其他部件的磨损，缩短仪器使用寿命。
[0006] 舒巴坦是一种竞争性不可逆的β-内酰胺酶抑制剂，对青霉素酶和头孢菌素酶有强 的不可逆的抑制作用。舒巴坦对于β-内酰胺类抗生素有增效作用，医学上用舒巴坦与氨苄 西林或头孢哌酮联合治疗敏感细菌所致的呼吸道、尿路感染等疾病。舒巴坦可能引起过敏 反应，可透过胎盘到达胎儿，乳汁中亦可检出舒巴坦，虽其在孕妇、乳妇的应用尚无问题发 生的报告，但应用时仍须权衡利弊。
[0007] 牛奶中残存抗生素药物问题受到普遍关注。β-内酰胺类抗生素是医学和兽医上的 一类重要的抗菌药物，应用十分广泛。许多国家都对该类药物在动物上的使用以及在动物 源性食品中的残留进行了严格监控。有关抗生素残留的检测方法日趋完善，于是一些不法 分子为了逃避抗生素的检测，向牛奶内添加内酰胺酶(β-lactamase)，可以使β-内酰胺类 抗生素如常用的青霉素降解，使微生物法、酶联免疫法等常规的检测方法失效，从而无法正 确判断是否为"无抗奶"，掩盖抗生素超标的事实。而舒巴坦不可逆的与内酰胺酶结合，使 溶液中游离的酶减少甚至为零，无法用现有的方法有效检测，纵容了抗生素滥用及非食用 物质内酰胺酶的违法添加行为，严重威胁消费者的身体健康。
[0008] 2011年以来，舒巴坦就被列入国家风险监控项目，但至今未发布国家标准。现有测 定舒巴坦的方法包括高效液相色谱法、液-质联用法、分光光度法、褶合光谱法和旋光法等。 其中，液相色谱法和液-质联用法是应用最多的方法。
[0009] 液体奶中三聚氰胺的检验属于出厂前每批次都必须检验的项目，检验工作量大。 舒巴坦被列入国家风险检测项目后，乳品企业也加强了对舒巴坦的检验。因此，液体乳中三 聚氰胺和舒巴坦往往需要同时检验，而现有检测方法需要进行两次检验才能完成。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种能同时测定液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测 方法。本发明的检测方法能用于大批量液体乳样品的快速检测，将大大提高液体乳中三聚 氰胺和舒巴坦这两种非法添加物的检测效率，降低乳品企业和检验机构的检测成本。
[0011]技术方案 一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，包括以下步骤： (1)前处理 制备试样： 称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL乙酸溶液，超声提取15miη，取出放至室温后用 乙酸溶液定容至25mL，混合均匀;从比色管中取lmL样品提取液，置于5 mL刻度管中，用乙腈 定容至5 mL，涡旋混合lmin，静置，用0.22μπι有机微孔滤膜过滤后，收集滤液为试样;所述乙 酸溶液为质量浓度为2%的乙酸溶液； 制备标准工作溶液： 将三聚氰胺和舒巴坦的标准储备液用不含目标待测物的液体乳基质溶液配制梯度标 准工作溶液；所述三聚氰胺标准储备液：以体积比为1:1的甲醇-水溶液为溶剂，浓度为 0.2mg/mL;所述舒巴坦标准储备溶液：以超纯水为溶剂，浓度为lmg/mL; (2 )获得标准质量色谱图、回归方程 梯度标准工作溶液用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得标准质量色谱 图； 以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中三聚氰胺、舒巴坦的相 应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程； (3) 定性分析 试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量 色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有三聚氰胺 或/和舒巴坦； (4) 定量计算 采用外标法定量:根据试样质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用步骤(2)的回归 方程，计算得到三聚氰胺或/和舒巴坦的浓度； (5) 超高效液相色谱-串联质谱联用仪的仪器的参数如下： 液相色谱参数： 色谱柱:Acquity UPLC BEH HILIC，柱长 100mm，柱内径2.1mm，填料粒径 1.7 μπι; 流动相:Α: 10 mm〇L/L的乙酸铵溶液，Β:乙腈； 梯度洗脱，梯度条件见表A，柱温:40°C，进样体积:2yL; 表A液相色谱梯度条件
"梯度变化曲线为6"是指梯度变化曲线为直线； 质谱参数： 离子源：电喷雾电离源;扫描方式:多反应监测；电离电压:3.2kV;离子源温度：150°C; 雾化温度:450 °C ;锥孔气流速:50L/h;雾化气流速:800L/h;碰撞室压力：3.6 X 10_3 mPa;其 他质谱参数见表B; 表B其他质谱参数
[0012]本发明建立了同时测定液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的超高效液相色谱-串联质谱 分析方法。试样采用乙酸水溶液进行提取，乙腈沉淀蛋白并稀释，Acquity UPLC BEH HILIC (100mmX2.1mm i.d·，粒径1.7 μπι)分离，电喷雾离子源多反应监测(MRM)模式串联质谱进 行测定。本文考察和优化了提取溶剂、提取时间、净化方式和仪器测定条件等。结果表明：三 聚氰胺在0.02 ng/mL-20 ng/mL，舒巴坦在0.05 ng/mL-100 ng/mL范围内具有较好的线性 关系，相关系数大于〇. 99。在高中低三个添加水平下，实际样品的回收率在82.5%-103.5%之 间，相对标准偏差(RSD n=6)在0.9 %-5.1%之间，三聚氰胺和舒巴坦的方法定量限分别为10 yg/kg和1.0 yg/kg。本发明前处理操作简单快捷，亲水作用色谱-串联质谱法检测灵敏度 高，定性定量准确。本发明能极大提高液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的检测效率，降低检测成 本。
[0013]有益效果 (1)提尚检测效率 GB/T 22388 -2008国家标准液相色谱-串联质谱法检测三聚氰胺所需检验周期约为 140 min，其中样品提取和净化需要130 min;舒巴坦的文献(薛霞等《亲水作用色谱-串联质 谱法测定液态奶中舒巴坦》，分析测试学报，2012，31 (6) :700-704)检验周期也需要约 140min。本发明前处理时间仅需25min，仪器测定8min，整个检验周期需要33min。由此可见， 本发明能极大的提高检验效率。若进行批量化检测，检验效率高的优势将更加明显。
[0014] (2)降低检测成本 本发明将三聚氰胺和舒巴坦的两次检验合并为一次实验，且无需固相萃取在净化，大 大降低了实验成本。本发明与GB/T 22388 -2008液相色谱-串联质谱法检测，仪器检测成本 相当，只计算前处理成本。GB/T 22388 -2008每次试验费用约为32元;《亲水作用色谱-串联 质谱法测定液态奶中舒巴坦》文献检测舒巴坦每次试验费用约为30元；因此，分次检测三聚 氰胺和舒巴坦前处理费用共为62元。而本发明前处理费用只需5元。比较发现，本发明前处 理成本降低十倍以上，还减少一次上机检测成本。
[0015] (3)定性定量准确 本发明采用亲水作用色谱-串联质谱法检测液体乳中三聚氰胺和舒巴坦，与液相色谱 法相比，质谱定性更准确;本发明中三聚氰胺检出限为3.0 yg/kg，定量限为10 yg/kg，完全 满足国家标准对三聚氰胺的要求;舒巴坦0.3 yg/kg，定量限为1.0 yg/kg，检出限不高于现 有文献报道水平，甚至低于部分文献检出限水平。
【附图说明】
[0016] 图1三聚氰胺(6ng/mL)和舒巴坦(4ng/mL)MRM色谱图； 图2空白液体乳(不含三聚氰胺和舒巴坦的纯牛奶)的MRM色谱图； 图3三聚氰胺浓度为10yg/kg、舒巴坦浓度为lyg/kg的空白纯牛奶加标样品MRM色谱图； 图4三聚氰胺浓度为25狀/1^、舒巴坦浓度为lOyg/kg的空白纯牛奶加标样品MRM色谱 图； 图5三聚氰胺浓度为KOyg/kg、舒巴坦浓度为lOOyg/kg的空白纯牛奶加标样品MRM色谱 图。
【具体实施方式】 [0017] 实施例！ 1、仪器与材料 超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾(ESI)电离源(XEV0 TQ-S美国Waters公司）； 色谱柱：Acquity UPLC BEH HILIC(100mmX2.1mm i. d, 1.7 μπι)，（美国Waters公司）。
[0018] 三聚氰胺标准物质(纯度彡97.0%)，购于德国Dr. Ehrenstorf er公司；舒巴坦标准 物质(纯度彡99.0%)，购于德国Dr. Ehrenstorf er公司；乙腈、乙酸铵(色谱纯）；冰乙酸(优级 纯）;超纯水:Mi 1 i-Q超纯水机制备;氮气(>99.999%)。
[0019] 2、前处理 2.1标准储备液 准确称取10. 〇mg(精确至0. lmg)三聚氰胺标准物质于50mL容量瓶中，用1:1甲醇-水溶 液进行溶解并定容至刻度，配制成浓度为〇.2mg/mL的三聚氰胺标准储备溶液，于4°C避光保 存。
[0020] 准确称取10.0mg(精确至0. lmg)舒巴坦标准物质于lOmL容量瓶中，用超纯水进行 溶解并定容至刻度，配制成浓度为lmg/mL的舒巴坦标准储备溶液，于4°C避光保存。
[0021] 2.2标准工作溶液 超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生 离子增强或抑制作用，因此，采用空白基质稀释标准储备液，得梯度标准工作溶液。取空白 样品（不含三聚氰胺和舒巴坦)按照"2.3"步骤制备空白基质溶液。准确移取三聚氰胺和舒 巴坦的标准储备液适量，用上述空白基质溶液配制梯度标准工作溶液。
[0022] 2.3 试样 称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL2%乙酸溶液，超声提取15 min，取出放至室温后 用2%乙酸定容至刻度，充分混勾。取lmL试样提取液于5 mL刻度管中，用乙腈定容至5 mL，祸 旋混合lmin，静置，经0.22μπι有机微孔滤膜过滤，滤液(试样)进样测定。
[0023] 3、液相色谱和质谱条件 3.1色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH HILIC(100mmX2.1mm i. d·，粒径 1.7 μπι);流动相：10 mm〇L/L乙酸铵溶液(A)、乙腈(Β)，梯度洗脱，梯度条件见表1;柱温:40°C，进样体积:2yL; 表1液相色谱梯度条件
梯度变化曲线为"6"，表示梯度变化为线性变化。
[0024] 3.2质谱条件 离子源：电喷雾电离源;扫描方式:多反应监测；电离电压:3.2kV;离子源温度：150°C; 雾化温度:450 °C ;锥孔气流速:50L/h;雾化气流速:800L/h;碰撞室压力：3.6 X 10_3 mPa;其 他质谱参数见表2: 表2三聚氰胺和舒巴坦的质谱参数
[0025] 4、标准质量色谱图、回归方程 用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照步骤3的条件，测定标准工作溶液，获得不同浓度 的标准工作溶液的质量色谱图（标准质量色谱图）。其中一个浓度水平的标准工作溶液的质 量色谱图如图1所示。
[0026] 以标准质量色谱图中定量离子对的色谱峰面积y为纵坐标，以标准工作溶液相应 离子的浓度值(ng/mL)x为横坐标，作标准曲线，获得三聚氰胺、舒巴坦的线性回归方程(如 表3所示）。由表3可见，在0.02-20ng/mL范围内，三聚氰胺的浓度与峰面积呈良好的线性关 系，相关系数R 2为〇. 997;在0.05-100 ng/mL范围内，舒巴坦的浓度与峰面积呈良好的线性 关系，相关系数R2为0.999。待测试样中三聚氰胺和舒巴坦响应值应在标准曲线线性范围 内，超过线性范围则应稀释后再进行分析。
[0027] 表3线性回归方程
[0028] 5、方法回收率、精密度和检出限 采用不含三聚氰胺和舒巴坦的纯牛奶，分别加入低中高三个浓度水平的标准溶液，按 照步骤4进行检测，获得质量色谱图，其中空白纯牛奶及其加标样品质量色谱图如图2、3、4、 5所示。其中，图2为空白纯牛奶的质量色谱图；图3为聚氰胺浓度为lOyg/kg、舒巴坦浓度为1 yg/kg的空白纯牛奶加标样品的质量色谱图；图4为三聚氰胺浓度为25^^/!^、舒巴坦浓度为 10yg/kg的空白纯牛奶加标样品的质量色谱图；图5为三聚氰胺浓度为150yg/kg、舒巴坦浓 度为100μ g/kg的空白纯牛奶加标样品的质量色谱图。
[0029] 三聚氰胺和舒巴坦的回收率（回收率:实测值/加入量*100%)，结果如表4所示。由 表4可见，三聚氰胺回收率在82.5%-103.5%范围内；舒巴坦回收率在85.1%-98.5%范围内。
[0030] 对不同试样重复测定6次，测定结果均具有良好的重现性，三聚氰胺和舒巴坦的 RSD 分别为 0 · 9-3 · 7%和 1 · 4-5 · 1%。
[0031] 采用在空白牛奶中添加目标化合物的方法，测得三聚氰胺的检出限（S/N> 3)为3 yg/kg，定量下限（S/N> 10)为10 yg/kg;舒巴坦的检出限（S/N> 3)为0.3 yg/kg，定量下限 (S/N> 10)为1.0 yg/kg。
[0032] 表4加标回收实验
[0033] 6、样品检测 (1)定性分析 用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照步骤3的条件，测定试样，获得试样质量色谱图。 若试样质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰;则表明试样中含有 三聚氰胺或/和舒巴坦。相应的色谱峰是指:试样色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时 间比较，变化范围在±2.5%之内；而且试样色谱峰的相对丰度比与相应标准色谱峰相比， 偏差不超过表5规定的范围。标准色谱峰是指标准质量色谱图中的目标物的色谱峰。
[0034] 表5定性时相对离子丰度的最大允许偏差
[0035] (2)定量计算 采用外标法定量:根据试样质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用步骤4的回归 方程，计算得到三聚氰胺或/和舒巴坦的浓度。
【主权项】
1. 一种液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的快速检测方法，包括以下步骤： (1)前处理 制备试样： 称取5g样品于25mL比色管中，加入15mL乙酸溶液，超声提取15min，取出放至室温后用 乙酸溶液定容至25mL，混合均匀;从比色管中取ImL样品提取液，置于5 mL刻度管中，用乙腈 定容至5 mL，涡旋混合Imin，静置，用0.22μπι有机微孔滤膜过滤后，收集滤液为试样;所述乙 酸溶液为质量浓度为2%的乙酸溶液； 制备标准工作溶液： 将三聚氰胺和舒巴坦的标准储备液用不含目标待测物的液体乳基质溶液配制梯度标 准工作溶液；所述三聚氰胺标准储备液：以体积比为1:1的甲醇-水溶液为溶剂，浓度为 0.2mg/mL;所述舒巴坦标准储备溶液：以超纯水为溶剂，浓度为lmg/mL; (2 )获得标准质量色谱图、回归方程 梯度标准工作溶液用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得标准质量色谱 图； 以标准质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，以标准工作溶液中三聚氰胺、舒巴坦的相 应浓度值为横坐标作图，得线性回归方程； (3) 定性分析 试样用超高效液相色谱-串联质谱联用仪进行检测，获得试样质量色谱图；若试样质量 色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明试样中含有三聚氰胺 或/和舒巴坦； (4) 定量计算 采用外标法定量:根据试样质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用步骤(2)的回归 方程，计算得到三聚氰胺或/和舒巴坦的浓度； (5) 超高效液相色谱-串联质谱联用仪的仪器的参数如下： 液相色谱参数： 色谱柱:Acquity UPLC BEH HILIC，柱长 100mm，柱内径2.1mm，填料粒径 1.7 μπι; 流动相:A: 10 mm〇L/L的乙酸铵溶液，Β:乙腈； 梯度洗脱，梯度条件见表A，柱温:40°C，进样体积:2yL; 表A液相色谱梯度条件"梯度变化曲线为6"是指梯度变化曲线为直线； 质谱参数： 离子源：电喷雾电离源；扫描方式：多反应监测；电离电压:3.2kV;离子源温度：150°C; 雾化温度:450 °C ;锥孔气流速:50L/h;雾化气流速:800L/h;碰撞室压力：3.6 X 10_3 mPa;其 他质谱参数见表B; 表B其他质谱参数
【文档编号】G01N30/06GK106018621SQ201610530506
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】薛霞, 郑红, 王骏, 刘艳明, 宿书芳, 公丕学, 张艳侠, 祝建华
【申请人】山东省食品药品检验研究院