用于检测外周血中循环肿瘤细胞ror1蛋白的试剂及其应用的制作方法

用于检测外周血中循环肿瘤细胞ror1蛋白的试剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了用于检测循环血液中ROR1蛋白的试剂及其应用。其中，用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂。该试剂包括：ROR1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。本发明利用ROR1只在癌细胞表达，而不在正常成人组织细胞表达这一特性，应用本发明的试剂检测循环血液中从原发肿瘤病灶脱落到血中的循环肿瘤细胞或肿瘤干细胞表达的ROR1蛋白，克服了传统方法的局限性，大大提高了循环肿瘤细胞检测的准确性和可靠性。本发明的试剂能够用于帮助检测肿瘤病人循环血中的肿瘤细胞，这对于肿瘤的疾病诊断，治疗效果的评估及癌转移监测是一个潜在的突破点。
【专利说明】用于检测外周血中循环肿瘤细胞R0R1蛋白的试剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白质检测【技术领域】，具体而言，涉及一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂及其应用。
【背景技术】
[0002]在肿瘤的生长过程中，肿瘤细胞会从原发病灶脱落进入到循环系统中成为“循环肿瘤细胞”，并且作为一种检测肿瘤特异的检验指标。肿瘤转移是循环肿瘤细胞从原发肿瘤病灶进入到血液循环之后会依附到远端的组织开始生长发育成新的肿瘤。大量临床数据表明，循环肿瘤细胞是造成肿瘤患者死亡的主要原因。最近开发出来的对于循环肿瘤细胞的分离方法对肿瘤的早期诊断有着非常重要的意义。重要的是循环肿瘤细胞的定量可以用来预测肿瘤转移的后果。另外，肿瘤干细胞(循环肿瘤细胞的一种，会导致肿瘤的产生)可以被用于肿瘤转移以及复发的诊断。因此，循环肿瘤细胞的检测已被公认为可有效地应用于体外早期癌症诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临床筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。然而，如何找到敏感特异和稳定的循环肿瘤细胞标记物以准确识别循环肿瘤细胞是目前困扰开发循环肿瘤细胞检测技术的难题。
[0003]捕获循环肿瘤细胞的方法报道很多，基本分为三大类:抗体直接捕获，富集，过滤。相比之下，如何准确识别鉴定分离出的细胞为循环肿瘤细胞报道甚少，主要原因是缺乏稳定特异的肿瘤细胞识别物。现有的包括美国药监局批准的“细胞寻找系统(CellSearchSystem)”方法都采用细胞角蛋白(CK)和/或EpCAM阳性，⑶45阴性的有核细胞作为识别循环肿瘤细胞的判断标准。但是越来越多的试验证明并非所有癌细胞都表达EpCAM。癌症发展进程中或在转移时，某些癌症的EpCAM表达增高而某些癌症的EpCAM降低。癌细胞特别在由上皮细胞源性到间质细胞性转换期间，CK和EpCAM表达都降低。EpCAM表达低的癌细胞容易从实体肿瘤脱落，而特殊结构功能的细胞角蛋白会促使癌细胞更具可塑性和迁移性。虽然人们试图用更多的肿瘤标记物抗体来增强鉴定循环肿瘤细胞的准确性和敏感性，由于这些肿瘤表达的蛋白或者只在部分人群中表达或者随肿瘤发展的不同阶段而改变，所以检测成本增加又解决不了根本问题。
[0004]ROR归属于膜表面氨酸激酶家族，有RORl和R0R2成员，最先在脑胶质瘤细胞中发现。两者的基因分别在染色体I和9号上，编码104KD的蛋白。一直以来认为两个ROR受体都为“孤儿”受体，直到最近才发现Wnt5A是R0R2的内原性配体。然而RORl的内原性配体至今还没找到。ROR在胚胎神经器官发育表达很高而在成熟后消失。近来发现RORl在急性和慢性白血病细胞中表达并对癌细胞的生长起决定作用。然而如何监测RORl以及在肿瘤诊断、治疗、转移中的应用进展甚少。

【发明内容】

[0005]本发明旨在提供一种用于检测循环血液中肿瘤细胞表达的RORl蛋白的试剂及其应用，以解决现有缺乏简便，灵敏和可靠的癌症早期诊断和癌症转移监测的技术问题。
[0006]为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂。该试剂包括:R0R1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。
[0007]进一步地，核染料为DAPI ;淋巴细胞识别抗体为⑶45。
[0008]进一步地，RORl抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或免疫血清。
[0009]根据本发明的另一个方面，提供了一种用于检测循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂盒。该试剂盒包括如权利要求1或2的试剂。
[0010]根据本发明的再一个方面，提供一种上述试剂在制备诊断癌症的试剂盒中的应用。
[0011]根据本发明的再一个方面，提供一种上述试剂在体外检测循环肿瘤细胞RORl蛋白的应用。
[0012]根据本发明的再一个方面，提供一种帮助癌症诊断的检测方法。该方法包括以下步骤:1)从外周血或生物体液中分离非红细胞非白细胞的混合细胞群；2)检测细胞是否表达RORl基因和蛋白；以及3)根据RORl基因和/或蛋白表达信息帮助癌症诊断。
[0013]根据本发明的再一个方面，提供一种用于帮助治疗方案的制定、评估癌症治疗效果和存活率的方法。该方法包括以下步骤:1)从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离肿瘤细胞；2)监测肿瘤细胞中RORl基因和/或蛋白表达水平；以及3)根据RORl基因和/或蛋白表达水平帮助治疗方案的制定，判断癌症治疗效果和存活率，其中治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
[0014]根据本发明的再一个方面，提供一种用于帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性的方法。该方法包括以下步骤:1)从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离循环肿瘤细胞；2)监测循环肿瘤细胞中RORl基因和/或蛋白表达水平；以及3)根据RORl基因和/或蛋白表达水平帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性，其中治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
[0015]根据本发明的再一个方面，提供一种帮助癌症诊断检测方法、帮助评估癌症治疗效果和存活率的方法或帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性，其中，从生物体液中分离肿瘤细胞采用选自抗体直接捕获法、循环肿瘤细胞富集分离方法、过滤法中的一种；优选地，生物体液包括循环血液、骨髓、胸水、脑脊液、淋巴液、腹水、尿液、唾液、痰液、冲灌液、精液、腺体分泌物、炎性渗出物；优选地，RORl蛋白检测方法包括:免疫荧光法如荧光显微镜、流式细胞技术、微流体、免疫沉淀、西点墨点法、，酶联免疫吸附测定、放射免疫分析法、和质谱方法；优选地，通过聚合酶链式反应和/或逆转录聚合酶链式反应检测RORl基因的表达水平；优选地，循环血液取自正常人或癌症病人，癌症病人包括患有上皮来源的实体瘤的病人；优选地，癌症病人包括患肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、食管癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、脑癌、神经胶质瘤、胰腺癌、和/或皮肤癌的病人；优选地，通过RORl抗体检测RORl的蛋白表达水平，采用荧光标记进行标记，荧光标记采用免疫组织化学染色、免疫荧光抗体染色及其后续的借助荧光显微镜和/或荧光分析技术进行的定性与定量分析。
[0016]根据本发明的再一个方面，提供一种用于抗肿瘤药物或抑制癌细胞转移的药物筛选的方法。该方法包括:1)从来自患癌的实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞；2)监测循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平；以及3)根据预定频率和用量和给药时间给予患癌的实验动物候选化合物，4)再次从来自给予候选化合物的患癌的实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞；5)再次监测来自给予候选化合物的实验动物的循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平，其中循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平低于在步骤2)中所监测的循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平的候选化合物即为目标化合物。
[0017]本发明的用于检测循环血液中RORl蛋白的试剂包括RORl抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞分离抗体，利用RORl只在癌细胞表达，而不在正常成人组织细胞表达这一特性，应用本发明的试剂检测循环血液中从原发肿瘤病灶脱落到血中的循环肿瘤细胞或肿瘤干细胞表达的RORl蛋白，克服了传统方法的局限性，大大提高了循环肿瘤细胞检测的准确性和可靠性。临床前结果显示，本发明的试剂可以提供定量的、可重复的结果帮助医生们治疗病人。本发明的试剂能够用于帮助检测肿瘤病人循环血中的肿瘤细胞，这对于肿瘤的疾病诊断，治疗效果的评估及癌转移监测是一个潜在的突破点。
[0018]附图表说明
[0019]说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
[0020]图1示出了实施例1中免疫荧光染色法用于检测癌症病人血中RORl表达的循环肿瘤细胞；
[0021]图2示出了实施例2中RORl在癌症病人血中循环肿瘤细胞的检测-流式细胞仪法;
[0022]图3示出了实施例4中循环肿瘤细胞在不同恶性程度(临床分期)的肺癌病人中的检测；
[0023]图4示出了实施例5中RORl蛋白在肝癌病人癌组织的表达结果；以及
[0024]图5示出了实施例6中荷瘤小鼠血中RORl阳性的循环肿瘤细胞的检测结果。
【具体实施方式】
[0025]需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0026]本发明的用于检测循环血液中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂包括RORl抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞分离抗体，可用于肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、结直肠癌等病人治疗效果、存活率的评估及癌细胞转移的监测。
[0027]本发明的用于检测循环血液中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂可以单独使用，也可以与其他肿瘤标记物联用以特异识别鉴定全血或分离出的循环肿瘤细胞。例如用RORl抗体与RORl结合然后用免疫荧光等技术识别血中循环肿瘤细胞并定量RORl表达水平。本发明中是首次利用RORl抗体、缓冲液及标记物检测循环血液中循环肿瘤细胞表达的RORl蛋白。
[0028]本发明的RORl抗体可以是抗人或动物的单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体，或免疫血清等。本发明的用于检测循环血液中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂包括但不局限于下述成份=RORl抗体、缓冲液、标记的IgG(如荧光、酶等)。荧光检测办法包括:免疫组织化学染色，免疫荧光抗体染色及其后续的借助荧光显微镜和/或荧光分析技术，如流式细胞仪(Flow Cytometry),突光分光光度计和微流体(microfluidics)等,进行的定性与定量分析。
[0029]本发明的用于检测循环血液中RORl蛋白的试剂可以用于全血和各种办法分离的循环肿瘤细胞，包括抗体直接捕获法(如FDA批准的“细胞寻找系统”)，各种循环肿瘤细胞富集分离方法及各种过滤方法等。
[0030]本发明的用于检测循环血液中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂可以用于健康人筛选，根据能否捕获到表达RORl的细胞(循环肿瘤细胞或其他细胞如干细胞等)帮助诊断受试
者是否患有癌症。
[0031]本发明的用于检测循环血液中RORl蛋白的试剂可以用于帮助进行疗效和存活率评估。癌症病人经治疗(包括手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗或以上联合疗法)后，根据能否捕捉到RORl表达的循环肿瘤细胞，细胞数量和RORl表达水平帮助判断癌症患者对所施加的治疗方案的敏感性，治疗效果及存活率。
[0032]本发明的用于检测循环血液中RORl蛋白的试剂可以用于帮助监测判断癌细胞转移、耐药、及复发的可能性。根据能否捕捉到RORl表达的循环肿瘤细胞，细胞数量和/或RORl表达水平帮助判断癌症患者治疗后是否有转移及转移的程度，以及在治疗过程中是否产生耐药，及治疗后的存活过程期间是否复发的早期预警。
[0033]RORl蛋白检测方法包括但不限于如下方法:免疫荧光法如荧光显微镜或流式细胞技术(Flow Cytometry)、微流体(microfluidics)、免疫沉淀、西点墨点法(蛋白质印迹法，WesternBlotting)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)和质谱方法等。
[0034]本发明还提供了一种用于检测RORl基因表达水平的试剂盒。基因检测方法包括但不限于以下方法:聚合酶链式反应(PCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等。适用于从受试者(正常或癌症病人)获得的生物体液提取物，包括但不限于血液、骨髓、胸水、脑脊液、淋巴液、腹水、尿液、唾液、痰液、冲灌液、精液、腺体分泌物、炎性渗出物等。此试剂盒可以单独使用，也可以与其他肿瘤标记物或医院现有及待开发的其它临床肿瘤检测方法联合使用。
[0035]本发明中的试剂、试剂盒可以用于检测实验动物的循环肿瘤细胞用于抗肿瘤新药开发，筛选包括抗肿瘤药物和抑制癌细胞转移药物的评估。实验动物包括但不限于荷瘤的免疫缺欠的小鼠(肿瘤源于接种的人源性的细胞系或人原代肿瘤组织或细胞)或非免疫缺欠的小鼠(自发肿瘤、药物诱导、转基因或由基因改变造成的，或接种同源性的细胞发生的)。
[0036]实施例1.RORl在循环肿瘤细胞上的检测-免疫荧光染色法
[0037]循环肿瘤细胞RORl蛋白检测试剂包括:固定液，缓冲液，荧光偶联的抗RORl抗体，荧光偶联的抗CD45抗体混合液，DAPI荧光染剂及封片液。RORl抗体是从CHO细胞转染人RORl细胞外片段获得的重组蛋白制备而成(R0R1抗体重组蛋白序列如下)。将固定在玻片上的富集的肺癌循环肿瘤细胞与PBS室温孵育5分钟后，吸弃PBS。加入l:200AlexaFlour 488偶联的抗RORl抗体及l:400Alexa Flour 594偶联的抗⑶45抗体混合液(0.5%BSA-PBS),室温避光孵育30分钟。吸弃抗体。使用0.5%BSA-PBS洗涤玻片3次，每次3分钟。每个玻片滴加20微升含DAPI封片液，封片。荧光显微镜下观察。如图1所示，肿瘤细胞为RORl+ (绿色)/DAPI+/CD45-，白细胞为R0Rl-/DAPI+/CD45+(红色)。RORl抗体重组蛋白序列如下:
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[0039]61 depmnnitts lgqtaelhck vsgnppptir wfkndapvvq eprrlsfrst iygsrlrirn
[0040]121 ldttdtgyfq cvatngkevv sstgvlfvkf gppptaspgy sdeyeedgfc qpyrgiacar
[0041]181 fignrtvyme slhmqgeien qitaaftmig tsshlsdkcs qfaipslchy afpycdetss
[0042]241 vpkprdlcrd eceilenvlc qteyifarsn pmilmrlklp ncedlpqpes peaancirig
[0043]301 ipmadpinkn hkcynstgvd yrgtvsvtks grqcqpwnsq yphthtftal rfpelngghs
[0044]361 ycrnpgnqke apwcftlden fksdlcdipa cds
[0045]实施例2.流式细胞仪法用于检测癌症病人血中RORl表达的循环肿瘤细胞
[0046]将癌症病人的循环肿瘤细胞与荧光标记的RORl抗体或对照抗体(Isotype IgG)在孵育液中4° C孵育20分钟。孵育液含3%FBS和IM HEPES的磷酸缓冲液(pH7.4)。用磷酸缓冲液洗两次后用流式细胞仪进行测定。结果用Flowjo软件分析并在图2中所示。图为代表性数量的循环细胞检测检测结果。左边为荧光标记的同型对照抗体染色的细胞(蓝色)；右侧为荧光标记的RORl抗体染色的细胞(红色)。
[0047]实施例3.肺癌病人循环肿瘤细胞的检测:R0R1试剂盒与传统方法的比较
[0048]对临床病例诊断为·原发性肺癌的25例病人进行了对比研究。从每例肺癌病人富集的肿瘤细胞悬浮后均分两部分。一部分用现有的技术检测循环肿瘤细胞的角蛋白(CK)表达；另一部分用本发明的技术检测循环肿瘤细胞的RORl蛋白。丙酮固定后，前者用FITC-偶联的抗CK抗体混合物(抗CK18等)和DyLight 549-偶联的抗⑶45抗体染色，细胞核用DAPI染色；后者用实施例1描述的RORl蛋白试剂检测。循环肿瘤细胞为CK或RORl阳性，CD45阴性，和核染色阳性。如表1所示，用目前现有技术检测到的循环肿瘤细胞(CK18+/DAPI+/⑶45-)的数量明显少于用本发明的技术检测到的肿瘤细胞(R0R1+/DAPI+/⑶45-)的数量。用本发明检测出的循环肿瘤细胞数量也与肺癌恶性程度成正相关。
[0049]表1
[0050]
[0051]
【权利要求】
1.一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂，其特征在于，包括:R0R1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述核染料为DAPI;淋巴细胞识别抗体为CD45。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述RORl抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或免疫血清。
4.一种用于检测循环肿瘤细胞RORl蛋白的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述的试剂。
5.—种如权利要求1至3中任一项所述的试剂在制备诊断癌症的试剂盒中的应用。
6.—种如权利要求1至3中任一项所述的试剂在体外检测循环肿瘤细胞RORl蛋白的应用。
7.一种帮助癌症诊断的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)从外周血或生物体液中分离非红细胞非白细胞的混合细胞群； 2)检测所述细胞是否表达RORl基因和/或蛋白；以及 3)根据所述RORl基因和/或蛋白表达信息帮助癌症诊断。
8.一种用于帮助治疗方案的制定、评估癌症治疗效果和存活率的方法，其特征在于，包括以下步骤: O从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离肿瘤细胞； 2)监测所述肿瘤细胞中RORl基因和/或蛋白表达水平；以及 3)根据所述RORl基因和/或蛋白表达水平帮助治疗方案的制定，判断所述癌症治疗效果和存活率， 其中所述治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
9.一种用于帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性的方法，其特征在于，包括以下步骤: O从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离循环肿瘤细胞； 2)监测所述循环肿瘤细胞中RORl基因和/或蛋白表达水平；以及 3)根据所述RORl基因和/或蛋白表达水平帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性， 其中所述治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
10.根据权利要求7至9任一项所述的帮助癌症诊断检测方法、帮助评估癌症治疗效果和存活率的方法或帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性的方法，其特征在于，所述从生物体液中分离肿瘤细胞采用选自抗体直接捕获法、循环肿瘤细胞富集分离方法、过滤法中的一种；优选地，所述生物体液包括循环血液、骨髓、胸水、脑脊液、淋巴液、腹水、尿液、唾液、痰液、冲灌液、精液、腺体分泌物、炎性渗出物；优选地，RORl蛋白检测方法包括:免疫荧光法如荧光显微镜、流式细胞技术、微流体、免疫沉淀、西点墨点法、酶联免疫吸附测定、放射免疫分析法、和质谱方法；优选地，通过聚合酶链式反应和/或逆转录聚合酶链式反应检测所述RORl基因的表达水平；优选地，所述循环血液取自正常人或癌症病人，所述癌症病人包括患有上皮来源的实体瘤的病人；优选地，所述癌症病人包括患肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、食管癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、脑癌、神经胶质瘤、胰腺癌、和/或皮肤癌的病人；优选地，通过RORl抗体检测RORl的蛋白表达水平，采用荧光标记进行标记，所述荧光标记采用免疫组织化学染色、免疫荧光抗体染色及其后续的借助荧光显微镜和/或荧光分析技术进行的定性与定量分析。
11.一种用于抗肿瘤药物或抑制癌细胞转移的药物筛选的方法，包括: 1)从来自患癌实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞； 2)监测所述循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平；以及 3)根据预定频率和用量及给药时间给予所述患癌的实验动物候选化合物， 4)再次从来自给予所述候选化合物的所述患癌实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞； 5)再次监测来自所述给予候选化合物的所述实验动物的所述循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平，其中所述循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平低于在步骤2)中所监测的所述 循环肿瘤细胞中RORl基因或蛋白表达水平的候选化合物即为目标化合物。
【文档编号】G01N33/53GK103792364SQ201210428989
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】张宝弘, 林平 申请人:张宝弘