一种lkb1蛋白检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种LKB1蛋白检测方法，包括以下步骤：制备LKB1单克隆抗体；用量子点标记LKB1单克隆抗体，得到量子点LKB1单克隆抗体；用量子点LKB1单克隆抗体与标本反应；将反应后的标本置于显微镜下观察。本发明还提供了含有量子点LKB1单克隆抗体的检测试剂盒。本发明的检测方法以量子点LKB1单克隆抗体作为探针，与LKB1蛋白结合的特异性增强，毒性减小使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；操作简单、灵敏度高。
【专利说明】—种LKB1蛋白检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种LKBl蛋白检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]人LKBl (Liver Kinase BI)基因或称 STKll (Serine-Threonine kinase 11)基因，定位于人染色体19pl3.3位置，含10个外显子，编码的LKBl蛋白由433个氨基酸组成，分子量约为50kDa，包括激酶区域(44-309)、N端调节域和C端调节域。N端调节域含一个核定位序列，使LKBl蛋白定位于细胞核内。LKBl基因编码一种丝-苏氨酸蛋白激酶，参与多种生物学过程，包括细胞周期阻滞、P53介导的凋亡、细胞极性诱导等，介导TGF-β、G蛋白偶联等信号通路，在细胞生长、分化调控中发挥着重要作用，几乎在人体多种组织中均有表达，以上皮、睾丸生精小管、肝脏、小肠和骨骼肌最多。LKBl基因是肿瘤易患综合症，即PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome, PJS)的致病基因，在高达90%的PJS病人中可检测到LKBl基因的胚系突变。LKBl基因的功能异常还与全身多种散发性肿瘤的发生密切相关，如在30-40%的非小细胞肺癌、20%的宫颈癌、19%鳞状细胞癌及13%乳腺侵润性导管癌中均有LKBl基因的失活。另外，LKBl基因在恶性肿瘤发生中起着重要作用，已有研究证实LKBl能够使细胞周期停滞在Gl期，抑制细胞生长。LKBl基因是一个较为普遍的抑癌基因。LKBl基因表达情况对肿瘤发生和预后影响都是一个重要的中间指标，对揭示LKBl基因抑制细胞恶性增殖的分子背景有重要的意义，因此，LKBl基因表达情况的检测，即LKBl蛋白水平检测或LKBlmRNA的水平检测是亟待解决的问题。
[0003]目前，LKBl蛋白的检测方法主要为免疫组织化学法，一种现有技术利用兔源多克隆抗体作为一抗，然后用标记了化学显色试剂或者荧光基团的二抗对一抗进行标记，一抗与LKBl蛋白结合后再用化学显色试剂的颜色或者荧光基团的荧光信号来判断LKBl蛋白的丰度。这种间接的检测方法步骤繁琐耗时长，并且由于多克隆抗体的特异性不强导致非特异性信号的产生，对检测结果的准确性有很大影响。还有一种现有技术是利用DAB显色的原理，对LKBl鼠源单克隆抗体进行显色标记，然后LKBl抗原免疫组化染色，再用光学显微镜观察，出现棕黄色或棕褐色的为阳性，综合考虑阳性细胞着色深浅和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。这种方法中使用的DAB染色剂有毒性，为疑似致癌物质，不安全，另外，显色剂显色反应受温度影响大，且显色时间受到限制，不能长期保存，实验人员无法将组织切片保存进行重复观察。
[0004]量子点具有宽的激发光谱和窄的发射光谱(光谱宽在20_40nm之间)，通过改变量子点的尺寸或者改变量子点内核的组分可以在很大范围内调节量子点的发射光谱。量子点与有机荧光团相比有几个突出的光学特点:窄的发射光谱能减少光谱重叠，从而能同时区别多个荧光团；宽的激发光谱能在单一波长下激发多种颜色的光谱。此外量子点具有光稳定性和抗降解性，对细胞的毒性小。这些独特的光学性质使量子点能在体内跟踪多个细胞和制备体外多个分子生物传感器，而且由于量子点的可调谐的发光波长，使量子点能促进组织深层的细胞成像。
【发明内容】
[0005]本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种LKBl蛋白检测方法，包括以下步骤:
[0006]用量子点标记LKBl单克隆抗体，得到量子点LKBl单克隆抗体；
[0007]用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应；
[0008]将反应后的标本置于显微镜下观察，
[0009]其中，所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
[0010]优选地，所述的用量子点标记LKBl单克隆抗体包括以下步骤:
[0011 ]将量子点表面用GHS进行修饰，得到GSH-量子点；
[0012]在GSH-量子点中加入SMCC，形成SMCC-GHS-量子点；
[0013]将SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。
[0014]优选地，所述的将量子点表面用GHS进行修饰为:
[0015]将量子点加入到GHS中进行反应,得到第一反应液；
[0016]将第一反应液离心，收集沉淀；
[0017]将所得沉淀用potassium t-butoxide溶液溶解,得到第二液体；
[0018]将第二液体透析，去除第二液体中的GSH与potassium t-butoxide,得到GSH-量子点。
[0019]优选地，所述的SMCC-GHS-量子点的制备方法为:
[0020]将GSH-量子点与sulfo-SMCC水溶液混合反应，得到第三反应液；
[0021]在第三反应液中加入巯基乙醇，得到第四反应液；
[0022]将第四反应液进行层析，得到第五反应液，再将层析后得到的第五反应液离心，离心所得沉淀重新溶解，得到SMCC-GHS-量子点。
[0023]优选地，所述的SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应为:
[0024]LKBl单克隆抗体中加入DTT溶液进行还原，得到还原的LKBl单克隆抗体；
[0025]将SMCC-GHS-量子点与还原的LKBl单克隆抗体混合反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。
[0026]优选地，所述的用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应包括以下步骤:
[0027]将标本用固定液进行固定；
[0028]用洗涤液冲洗固定后的标本；
[0029]过氧化氢处理标本；
[0030]封闭液处理标本；
[0031]将量子点LKBl单克隆抗体与标本进行反应。
[0032]本发明还提供了 LKBl蛋白检测试剂盒，包括量子点LKBl单克隆抗体。
[0033]优选地，还包括固定液和洗涤液。
[0034]优选地，还包括封闭液。
[0035]优选地，还包括过氧化氢。
[0036]优选地，还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为过表达LKBl蛋白的细胞，所述的阴性对照品为LKBl表达沉默的细胞。
[0037]优选地，所述的固定液选自戊二醛、多聚甲醛、乙醇、甲醇或丙酮。
[0038]优选地，所述的洗涤液为PBS溶液。
[0039]优选地，所述的封闭液为正常山羊血清。
[0040]本发明的LKBl蛋白检测方法利用抗原抗体特异性结合的原理，以量子点LKBl单克隆抗体作为探针与抗原(LKB1蛋白)结合，利用量子点发出的荧光对LKBl蛋白进行定位、定性及定量研究。细胞样品或组织样本被制成标本后，加入量子点LKBl单克隆抗体反应，将反应后的标本置于荧光显微镜下观察。LKBl蛋白与量子点LKBl单克隆抗体特异性的结合后，LKBl蛋白发出荧光，能够发出荧光的细胞为阳性细胞，不能发出荧光的为阴性细胞，还可通过综合考虑阳性细胞荧光强度和阳性细胞占所观察同类细胞的比例两项指标，进行半定量判断结果。
[0041]本发明的有益效果在于，本发明的检测方法以量子点LKB I单克隆抗体作为探针，与LKB I蛋白结合的特异性增强，毒性减小使用更安全，着色标本可长期保存，进行重复观察；本发明的检测方法的有益效果还在于操作简单、灵敏度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1是荧光显微镜下乳腺癌细胞BT474涂片图。
[0043]图2是荧光显微镜下胃癌细胞BGC823涂片图。
【具体实施方式】
[0044]为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。本发明的LKBl蛋白检测方法利用抗原抗体特异性结合的原理，以量子点LKBl单克隆抗体作为探针与抗原(LKB1蛋白)结合，利用量子点发出的荧光对LKBl蛋白进行定位、定性及定量研究。
[0045]本发明的LKB I蛋白检测方法采用以下技术方案实现:
[0046]用量子点标记LKBl单克隆抗体，得到量子点LKBl单克隆抗体；
[0047]用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应；
[0048]将反应后的标本置于显微镜下观察，
[0049]其中，所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
[0050]LKBl单克隆抗体可选用鼠源LKBl单克隆抗体,本实施例中选用的是abeam公司的鼠抗人LKBl单克隆抗体abl5095，也可选用其他LKBl单克隆抗体。
[0051]量子点可选用CdSe、CdTe, CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdTe/CdS/ZnS、CdSe/CdS/ZnS、CdSe/CdZnS、CdSe:Mn2+、CdTe:Mn2+、CdSe:Zn2+或 CdTe:Zn2+，不限于以上。本实施例中使用的量子点是CdSe/CdZnS。
[0052]本实施例中，量子点LKBl单克隆抗体采用以下方法制备:
[0053]将量子点表面用GHS进行修饰，得到GSH-量子点；
[0054]在GSH-量子点中加入SMCC，形成SMCC-GHS-量子点；
[0055]将SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。[0056]本实施例中米用SMCC (Succinimidyl 4_ (N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,琥拍酰亚胺_4_环已烧-1-碳酸酯)作为螯合剂，连接LKBl单克隆抗体与GHS-量子点，SMCC分子一端的NHS酯基团与LKBl单克隆抗体的伯氨反应形成稳定的酰胺键，SMCC的另一端(马来酰亚胺基团一端)可与GHS-量子点的巯基发生特异性交联。
[0057]LKBl单克隆抗体与量子点的连接方法还可以通过EDC HCl和NHS共同作用等其他方式实现，并不限于以上。
[0058]另外，GHS-量子点的制备方法优选为:
[0059]将量子点加入到GHS中进行反应,得到第一反应液；
[0060]将第一反应液离心，收集沉淀；
[0061]将所得沉淀用potassium t-butoxide溶液溶解,得到第二液体；
[0062]将第二液体透析，去除第二液体中的GSH与potassium t-butoxide,得到GSH-量子点。
[0063]在SMCC-GHS-量子点制备中，为了提高SMCC-GHS-量子点的回收率，在进行SMCC-GHS-量子点纯化前在反应液中加入巯基乙醇，再对反应液进行层析，本实施例中采用的是柱层析的方法，再将层析后得到的反应液离心，离心所得沉淀重新溶解，得到SMCC-GHS-量子点。
[0064]在SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应制备量子点LKBl单克隆抗体的步骤中，为了提高SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体的作用，SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体混合反应之前，在LKBl单克隆抗体中加入DTT溶液进行还原，得到还原的LKBl单克隆抗体。
[0065]另外，所述的用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应包括以下步骤:
[0066]将标本用固定液进行固定；
[0067]用洗涤液冲洗固定后的标本；
[0068]过氧化氢处理标本；
[0069]封闭液处理标本；
[0070]将量子点LKBl单克隆抗体与标本进行反应。
[0071]为了使细胞内的物质尽量保持原有的形态、结构、位置，在标本上加入了固定液，本实施例中固定液优选为戊二醛、多聚甲醛、乙醇、甲醛或丙酮，更优选为多聚甲醛或丙酮，最优选为丙酮。洗涤液优选为PBS溶液。为了减少量子点LKBl单克隆抗体与除LKBl蛋白外的其他蛋白的非特异性结合，在量子点LKBl单克隆抗体处理标本之前加入封闭液，所述的封闭液优选为血清，更优选为正常山羊血清或牛血清蛋白(BSA)，最优选为正常山羊血清。
[0072]本发明还提供了 LKBl蛋白检测试剂盒，包括量子点LKBl单克隆抗体，还包括固定液、洗涤液、过氧化氢、封闭液、阳性对照品和阴性对照品。
[0073]所述的阳性对照品为过表达LKBl蛋白的细菌，所述的阴性对照品为LKBl表达沉默的细菌。所述的固定液选自戊二醛、多聚甲醛、乙醇、甲醇或丙酮。所述的洗涤液为PBS溶液。所述的封闭液为正常山羊血清。
[0074]以下为实施例。[0075]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0076]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0077]实施例1
[0078]LKBl蛋白检测步骤:
[0079](I) CdSe/CdZnS 量子点表面 GSH 修饰
[0080]在Iml的CdSe/CdZnS量子点溶液中缓慢加入Iml浓度为200mg/ml的GSH溶液，加热至60°C进行反应。GSH包被CdSe/CdZnS量子点形成GSH-量子点，GSH-量子点沉淀，离心收集沉淀。用Iml浓度为100mg/ml的potassiumt-butoxide溶解沉淀,水浴超声5min。水浴超声后的水溶液用0.2 μ m滤膜过滤，然后在IOmM PBS溶液中透析除去多余的GSH和potassium t—butoxide。
[0081](2) SMCC螯合的量子点合成
[0082]在上述Iml GSH-量子点PBS溶液中加入100 μ I浓度为ImM的sulfo-SMCC水溶液，反应30min。然后加入ImM巯基乙醇。再将反应混合物过NapTM_5柱子，用PBS溶液洗脱。洗脱液15000g离心5min去除聚合的量子点。
[0083](3) SMCC-GSH-量子点与LKBl单克隆抗体螯合
[0084]Img LKBl单克隆抗体溶于Iml水中，加入20 μ I浓度为IM的DTT对LKBl单克隆抗体进行还原；在10禮PBS溶液中进行透析；还原后的LKBl单克隆抗体加入到上述制备的SMCC-GSH-量子点中孵育lh，让LKBl单克隆抗体与量子点结合；然后在IOmMPBS溶液中进行透析；0.2 μ m滤膜过滤去除聚合的量子点。
[0085](4)利用量子点-LKBl单克隆抗体进行冰冻切片的免疫组化检测
[0086]a.冰冻切片4?8 μ m,室温放置30min后,浸入4°C丙酮中固定10分钟；
[0087]b.PBS 冲洗，5minX3 次；
[0088]c.用3%过氧化氢孵育5?10分钟消除内源性过氧化物酶活性；
[0089]d.PBS 冲洗，5minX3 次；
[0090]e.5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的QDs-LKBl抗体，37°C孵育f 2小时或4°C过夜；
[0091 ] f.PBS 冲洗，2 分钟 X 3 次;
[0092]g.复染，脱水透明、封片；
[0093]h.在荧光显微镜下观察。
[0094]其中，CdSe/CdZnS量子点合成过程如下:在25ml三颈烧瓶中混合lgTOPO，3g HDA,66mg cadmium, 4-pentanedionate, 250mg 月桂酸(stearic acid),冲入IS气，加热至 320°C，恒温搅拌30min，快速加入0.2ml 100mg/ml TBP溶液，冷却至300°C恒温，CdSe量子点开始合成，检测其荧光发射波谱，当发射波谱达到635nm时，继续冷却至250°C，恒温，于三颈烧瓶中逐滴加入0.25mlCd-Zn-Se储存溶液，伴随剧烈搅拌，同时检测发射波谱，当红移15nm后继续冷却至100°C，搅拌5h，冷却至50°C时，加入过量的甲醇使量子点产物沉淀，后离心收集沉淀，将所得沉淀用20ml四氢呋喃溶解备用。
[0095]应用例I
[0096]将乳腺癌细胞BT474制成细胞涂片，用实施例1中的LKB I蛋白检测方法对乳腺癌细胞涂片进行观察。图1为荧光显微镜下的观察到的乳腺癌细胞BT474。[0097]应用例2
[0098]将胃癌细胞BGC823制成细胞涂片，用实施例1中的LKB I蛋白检测方法对胃癌细胞涂片进行观察。图2为荧光显微镜下的观察到的胃癌细胞BGC 823。
[0099]应用例3
[0100]将胃癌组织标本与正常胃粘膜标本按照实施例1中的方法在显微镜下观察，综合每张切片中阳性细胞荧光强度和阳性细胞所占观察同类细胞的百分比两个指标，进行半定量检测。
[0101]表1荧光强度评价
【权利要求】
1.一种LKBl蛋白检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 用量子点标记LKBl单克隆抗体，得到量子点LKBl单克隆抗体； 用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应； 将反应后的标本置于显微镜下观察， 其中，所述的标本为细胞标本或组织标本，所述的细胞标本为组织印片、细胞爬片或细胞涂片，所述的组织标本为石蜡切片或冰冻切片。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的用量子点标记LKBl单克隆抗体包括以下步骤: 将量子点表面用GHS进行修饰，得到GSH-量子点； 在GSH-量子点中加入SMCC，形成SMCC-GHS-量子点； 将SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的将量子点表面用GHS进行修饰为: 将量子点加入到GHS中进行反应，得到第一反应液； 将第一反应液离心，收集沉淀； 将所得沉淀用potassium t_butoxide溶液溶解，得到第二液体； 将第二液体透析，去除第二液体中的GSH与potassium t-butoxide,得到GSH-量子点。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的SMCC-GHS-量子点的制备方法为: 将GSH-量子点与sulfo-SMCC水溶液混合反应，得到第三反应液； 在第三反应液中加入巯基乙醇，得到第四反应液； 将第四反应液进行层析，得到第五反应液，再将层析后得到的第五反应液离心，离心所得沉淀重新溶解，得到SMCC-GHS-量子点。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的SMCC-GHS-量子点与LKBl单克隆抗体反应为: LKBl单克隆抗体中加入DTT溶液进行还原，得到还原的LKBl单克隆抗体； 将SMCC-GHS-量子点与还原的LKBl单克隆抗体混合反应，得到量子点LKBl单克隆抗体。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的用量子点LKBl单克隆抗体与标本反应包括以下步骤: 将标本用固定液进行固定； 用洗涤液冲洗固定后的标本； 过氧化氢处理标本； 封闭液处理标本； 将量子点LKBl单克隆抗体与标本进行反应。
7.—种LKBl蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括量子点LKBl单克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括固定液、洗涤液、封闭液和过氧化氢。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为过表达LKBl蛋白的细胞，所述的阴性对照品为LKBl表达沉默的细胞。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述的固定液选自戊二醛、多聚甲醛、乙醇、甲醇或丙酮。
11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液为PBS溶液。
12.根据权利要求8或9 所述的试剂盒，其特征在于，所述的封闭液为正常山羊血清。
【文档编号】G01N33/533GK103884694SQ201210562574
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月21日 优先权日:2012年12月21日
【发明者】万晓春, 王伟, 粟武 申请人:深圳先进技术研究院