专利名称：一种新型聚芴衍生物的合成及检测肿瘤标志物免疫传感器的应用技术领域的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫标记物的合成及免疫检测技术领域，更具体的说是一种新型聚芴衍生物的合成本及利用该新型聚芴衍生物为免疫标记物的流动注射荧光传感器的方法。
背景技术：
共轭聚合物是一类结构上具有长程π键共轭体系的聚合物。共扼聚合物发展至今，其种类较多，主要有聚苯撑(ΡΡΡ)、聚苯撑乙烯撑(PPV)、聚乙快(PA)、聚唾吩(PT)、聚苯胺(ΡΑΝΙ)、聚苯硫醚(PPS)、聚毗咯(ΡΡΥ)、聚二乙炔(PDA)等共轭聚合物。共轭聚合物通常情况下很容易和带有受体性质的基团或物质发生作用，从而使得这些聚合物本身的物理、 化学性质发生变化，生成一些具有特定功能的材料。共轭聚合物共价键构成链状结构，HOMO 能量较高，受激发的电子可以在η共轭所产生的通道上沿整个分子链离域，共轭聚合物的分子链结构具有了“分子导线”的特征。自共轭聚合物具有荧光放大效应被发现以来，共轭聚合物荧光敏感材料迅猛发展，具体的应用主要集中在离子检测，有机小分子检测和生物分子体系检测等，具有深厚的发展潜力和广阔的应用前景。
在煤焦油中有一种具有荧光的片状晶体，Berthelot将其命名为芴(fluorene)。 由于荷结构单元的9位、2位以及7位碳是易修饰位点,通过这些易修饰位点不仅可以修饰成芴的衍生物，而且可以合成聚芴。聚芴(PF)是一种刚性平面联苯结构的化合物，本身具有较高的光和热稳定性。由于聚芴具有的这些特性，科学家开始对聚芴的性质和功能进行深入的研究。经过人们的不懈努力，聚芴及其衍生物的合成有了明显的进展。聚芴及其衍生物的固体薄膜具有较高的荧光量子产率约在60% 80%，且带隙大于2. 90 eV，其荧光发射峰在450 nm左右，因此被认为最有前途的蓝色发光材料。并且，它还具有良好的化学稳定性、热稳定性和溶解性，容易调节颜色和良好的空穴传输能力。聚芴还可以通过共聚、共混和改性等方法得到在整个可见光范围内可调的发光功能材料。芴类生色团在高效稳定的电致蓝光材料、白光材料、多功能化、有机激光/主体材料、相结构的调整以及有机纳米发光材料等方面得到了广泛应用，逐渐成为有机电子学领域的明星分子。
近年来，恶性肿瘤也就是癌症成为了人类健康和生命安全的一个严重威胁。对肿瘤标志物的检测称为免疫分析。免疫传感器是利用抗原和抗体之间的特异性免疫反应，抗体是上百个氨基酸分子高度有序排列而成的生物大分子。当免疫系统暴露在抗原物质时， 抗体中有对抗原结构进行识别、结合的部位，根据“匙-锁”模型，抗体可与其相应的抗原高度专一地结合。对癌症的早期诊断和低含量抗原的测定具有重要的意义也成为了众多分析人员的重要追求。而且，随着现代生物传感器技术的不断发展，免疫分析在微生物检验、药物分析、临床诊断、食品安全与环境监测等领域得到了广泛的应用。传统的免疫分析技术酶联免疫吸收分析、放射免疫分析、胶体金免疫技术一般耗时较长并且加样、温育、洗涤等操作繁琐，而新式的免疫分析方法高效液相色谱化学发光免疫分析、微流控芯片化学发光免疫分析、毛细管电泳化学发光免疫分析等一般需要贵重的仪器，不利于普及。在九十年代， 国内外出现了一种新型的免疫分析法——流动注射免疫分析法。流动注射免疫分析法综合了流动注射和免疫分析的特点，能够利用计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数据处理，在免疫分析上具有很突出的优点。荧光分析是一种非破坏性的、灵敏度高的分析方法。通过流动注射的荧光免疫分析就结合了两者的优点，一定具有较好的应用前旦-5^ O发明内容
本发明要解决的技术问题是合成了一种发蓝光的聚芴衍生物，并且利用其作为信号分子提供了一种灵敏度高、检测速度快、试剂用量少，检测肿瘤标志物的流动注射荧光传感器。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下措施来实现的一种聚芴衍生物的合成及其用来检测检测肿瘤标志物的流动注射荧光传感器的制备方法，其包括以下步骤(1)聚芴衍生物的合成(PF-NH2)；(2)合成二氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2)；(3)将二抗修饰在PF-NH2OSiO2 ；(4)按照现有方法制备金纳米粒子(AuNPs)，四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4)金纳米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu)；(5)将一抗修饰在Fe3O4OAu表面；(6)利用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制备流动注射荧光流通池；(7 )将制作好的化学发光传感器结合流动注射化学发光仪对免疫标记物进行检测。
本发明所述二氧化硅包覆的聚芴衍生物及二氧化硅包覆的四氧化三铁的制备包括以下步骤(O 1,4- 二溴对苯二胺(化合物I)(a)在氮气环境中，加入250 mL无水四氢呋喃(THF)，然后再加入4. 2 g氢化钠(NaH)， 加入5. 17 g对二苯胺后加热回流I h。冷却至室温后加入25 g碳酸二叔丁基酯,搅拌30 min后加入4. 2 g NaH，回流12 h。加入大量水使过多的反应物水解，然后用大量乙酸乙酯萃取，有机层用无水硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤，减压蒸馏，在乙酸乙酯中结晶得到白色的N， N' -2 (叔丁氧擬基)_1，4-二氨基苯。
(b)在氮气环境中，加入9 mL无水乙醚和9 mL无水THF，加入(I) - (a)所得N, N' -2 (叔丁氧羰基)_1，4-二氨基苯，冷却至-45 °C，逐滴加入25 mL 1.3 M的叔丁基锂的戊烷溶液，在-45 °C搅拌3 h，然后在-55 1逐滴加入2 mL —氯三甲基硅烷，反应室温搅拌反应12 h。向反应液中加入10 mL 10%的盐酸溶液，用乙酸乙酯萃取，有机层用MgSO4 干燥，过滤，减压蒸馏，过 柱可得白色的N，N' _2 (叔丁氧羰基)-1，4-二氨基-2，5-2 (三甲基娃烧基)苯。
(C)在氮气环境中，加入无水二氯甲烷，加入(I)- (b)所得N，N' -2 (叔丁氧羰基)_1，4-二氨基-2,5-2(三甲基硅烷基)苯，再加入1.53 g NBS，反应在室温搅拌3 h，加入 5 mL水，用二氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，减压蒸馏，重结晶可得白色N，N' -2 (叔丁氧擬基)_1, 4- 二氨基-2，5-2溴苯。
(d)在氮气环境中，加入10 mL三氟乙酸和10 mL无水二氯甲烷于装置中，加入(I)_ (c)所得N, N' -2 (叔丁氧擬基)-1，4-二氨基-2，5_2溴苯,室温揽拌12 h,然后减压蒸馏，蒸干。向其中加入5 mL无水二氯甲烷，再加入无空气饱和碳酸氢钠溶液，控制pH 8 9，搅拌3 h，用除空气的二氯甲烷萃取，合并有机层，用MgSO4干燥，减压蒸馏，重结晶得到1，4- 二溴对苯二胺。
2) 2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)_芴(化合物2)的合成在氮气环境中，加入4 g 2，7-二溴荷和80 mg四丁基溴化铵,加入60 mL二亚甲基亚砜(DMSO)，直接加入8 ml 50%氢氧化钠(NaOH)溶液。将溶有5 g 3-二甲基氨基丙基氯的盐酸盐((CH3)2N(CH2)3Cl .HCl)的溶液加入到20 mL (DMSO)并滴加到混合物中，搅拌12 h。 向反应液中加入50 mL的水，溶解剩余盐类。将得到的产品萃取、洗涤。洗涤后的溶液用无水MgSO4干燥，减压过滤，旋蒸蒸除溶剂，得到黄色2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)-芴。
(3)对二乙烯基苯(化合物3)的合成(a)在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入5.8 g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，O. 10 g过氧化苯甲酰，再加入2. O mL对二甲苯和60 mL四氯化碳(CC14)。磁力搅拌器搅拌至所有固体溶解。加热回流12 ho停止反应后，趁热过滤，洗漆沉淀，滤液冷却后进行重结晶，得到白色针状结晶，即对二溴二甲苯。
b)在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入4. 94 g (3) - (a)制得对二溴二甲苯和9. O g三苯基磷，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛。过滤、洗涤沉淀，得到白色粉末状对二溴二甲苯的季磷盐。
(C)在氮气环境中，将(3)- (b)所得对二溴二甲苯的季磷盐转移到250 mL的三颈烧瓶中，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛。向反应溶液中逐滴滴加20 mL 5% NaOH溶液，搅拌反应物12 h，停止反应。萃取洗涤沉淀，无水MgSO4干燥过夜。减压蒸除溶剂，得到白色针状对二乙烯基苯。
(4)聚芴衍生物(PF-NH2)的合成在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中依次加入O. 19g (I)制得1，4-二溴对苯二胺，O.10 g (2)制得 2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)-芴，O. 10 g (3) 制得二乙烯基苯、25 mg的醋酸钯(Pd (OAc) 2)、0. 3· g的三苯基磷(PPh3)、60 mL DMF、50mL三乙胺，在150 °〇加热回流48 h。反应停止后，用三氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤， 减压蒸馏，得到棕黄色新型聚芴衍生物(pf-nh2)。
(5)将(4)制备的PF-NH2配制溶液(I nM，溶于DMF中)。在一个100 mL的单口瓶中加入I mL PF-NH2溶液，8 mL乙醇，搅拌分散均匀。然后加入O.1 mL氨水溶液(25%)， 10 μ L的正硅酸四乙酯溶液(TE0S，体积浓度1/20的TEOS乙醇溶液)搅拌30 min。继续加入10 μ L TEOS溶液并搅拌30 min直到加入的TEOS溶液总量为50 μ L。反应结束后， 在10000 r .HiirT1转速下离心分离，用乙醇洗涤沉淀，反复三次。在真空干燥箱中以50 V 干燥5 h得到二氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2X
(6)在一个10 mL的小烧杯中加入(5)制备的PF-NH2OSiO2 O. 02 g,将I mL新制备的N，N’ -羰基二咪唑溶液(⑶I，100 mg .mL-1,溶于DMS0)加入并搅拌4 h。反应完全后，加入过量的二次水是过量⑶I分解，在10000 r · miiT1转速下离心分离，用二次水洗涤沉淀，反复三次。将修饰的PF-NH2OSiO2溶于磷酸缓冲溶液中(PBS，pH 7. 4)，加入一定量的二抗(Ab2)原溶液并在4 °C下活化2 h。在10000 r .HiirT1转速下离心分离，加入I mL牛血清白蛋白(BSA，1%)在4 °C下活化2 h。在10000 r ^mirT1转速下离心分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab2浓度为20 Ug-mr1.
(7)利用传统方法制备金纳米粒子(AuNPs)和四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4)铁。在一个100 mL的圆底烧瓶中加入O.1 g Fe3O4纳米粒子,加入10 mL乙醇,然后加入O. 5 mL APTES并磁力搅拌I h，用磁铁进行分离，用二次水冲洗。加入I mL AuNPs(l%)，加入10 mL 并磁力搅拌2 h。用磁铁进行分离，用二次水冲洗。在真空干燥箱中以50 °C干燥10 h即得金纳米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu )。
(8)将(7)Fe304@Au制备粒子O. 01 g溶于PBS中，加入一定量的一抗(Ab1)原溶液并在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，加入I mL BSA溶液，在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab1浓度为20 μ g
(9)在I mL的离心管中加入10 μ L (7)制备的Ab1溶液，然后加入10 μ L—定浓度的抗原(Ag)溶液，并在4 °C下活化2 h。加入10 UL (6)制备的Ab2溶液，并在4 °C 下活化2 h。用磁铁进行分离，用吸液枪小心的吸取上清液，并用PBS洗涤，反复三次。
(10)利用流动注射化学发光测定(9)中所得物质的荧光信号。
本发明所述肿瘤标志物为人绒毛膜促性腺激素(HCG、)CA19-9、甲胎蛋白(AFP)、 癌胚抗原。
本发明的有益效果(I)本发明利用合成了一种新型的聚芴衍生物，并表现了较好的蓝光，荧光效率就高， 具有较好的应用价值。通过对该聚芴衍生物进行包硅处理，提高了生物相容性，降低了有机物本身毒性的影响。
(2)利用金包覆的四氧化三铁作为基底材料，可以很好的实验进行控制。
(3)流动注射化学发光的方法进行测定操作快速简单，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。
图1是化合物I的合成流程图。
图2是化合物2、3的合成流程图。
图3是聚芴衍生物PF-NH2的合成流程图。
图4A是一抗的修饰流程；B是二抗的修饰流程；C是传感器的检测流程图。
具体实施方式
一种检测检测免疫标记物的流动注射荧光传感器的制备方法，其包括以下步骤(1)聚芴衍生物的合成(PF-NH2)；(2)合成二氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2)；(3)将二抗修饰在PF-NH2OSiO2 ；(4)按照现有方法制备金纳米粒子(AuNPs)，四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4)金纳米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu)；(5)将一抗修饰在Fe3O4OAu表面；(6)利用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制备流动注射荧光流通池；(7 )将制作好的化学发光传感器结合流动注射化学发光仪对免疫标记物进行检测。
本发明所述二氧化硅包覆的聚芴衍生物及二氧化硅包覆的四氧化三铁的制备包 括以下步骤(O 1,4- 二溴对苯二胺(化合物I)(a)在氮气环境中，加入250 mL无水四氢呋喃(THF)，然后再加入4. 2 g氢化钠(NaH)， 加入5. 17 g对二苯胺后加热回流I h。冷却至室温后加入25 g碳酸二叔丁基酯,搅拌30 min后加入4. 2 g NaH，回流12 h。加入大量水使过多的反应物水解，然后用大量乙酸乙酯 萃取，有机层用无水硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤，减压蒸馏，在乙酸乙酯中结晶得到白色的N， N' -2 (叔丁氧擬基)_1，4-二氨基苯。
(b)在氮气环境中，加入9 mL无水乙醚和9 mL无水THF，加入(I) - (b)所得N, N' -2 (叔丁氧羰基)_1，4-二氨基苯，冷却至-45 °C，逐滴加入25 mL 1.3 M的叔丁基锂 的戊烷溶液，在-45 °C搅拌3 h，然后在-55 1逐滴加入2 mL —氯三甲基硅烷，反应室温 搅拌反应12 h。向反应液中加入10 mL 10%的盐酸溶液，用乙酸乙酯萃取，有机层用MgSO4 干燥，过滤，减压蒸馏，过柱可得白色的N，N' _2 (叔丁氧羰基)-1，4-二氨基-2，5-2 (三 甲基娃烧基)苯。
(C)在氮气环境中，加入无水二氯甲烷，加入(I)- (b)所得N，N' -2 (叔丁氧羰 基)_1，4-二氨基-2,5-2(三甲基硅烷基)苯，再加入1.53 g NBS，反应在室温搅拌3 h，加入 5 mL水，用二氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，减压蒸馏，重结晶可得白色N，N' -2 (叔丁氧擬基)_1, 4- 二氨基-2，5-2溴苯。
(d)在氮气环境中，加入10 mL三氟乙酸和10 mL无水二氯甲烷于装置中，加入 (I) _ (c)所得N, N' -2 (叔丁氧擬基)-1，4-二氨基-2，5_2溴苯,室温揽拌12 h,然后减 压蒸馏，蒸干。向其中加入5 mL无水二氯甲烷，再加入无空气饱和碳酸氢钠溶液，控制pH 8 9，搅拌3 h，用除空气的二氯甲烷萃取，合并有机层，用MgSO4干燥，减压蒸馏，重结晶得 到1，4- 二溴对苯二胺。
(2)2，7-二溴-9,9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)_芴(化合物2)的合成 在氮气环境中，加入4 g 2，7-二溴荷和80 mg四丁基溴化铵,加入60 mL二亚甲基亚砜(DMSO)，直接加入8 ml 50%氢氧化钠(NaOH)溶液。将溶有5 g 3-二甲基氨基丙基氯的 盐酸盐((CH3)2N(CH2)3Cl .HCl)的溶液加入到20 mL (DMSO)并滴加到混合物中，搅拌12 h。 向反应液中加入50 mL的水，溶解剩余盐类。将得到的产品萃取、洗涤。洗涤后的溶液用无 水MgSO4干燥，减压过滤，旋蒸蒸除溶剂，得到黄色2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二 甲氨基)丙基)-芴。
( 3 )对二乙烯基苯(化合物3 )的合成(a)在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入5.8 g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，O. 10 g过氧化苯甲酰，再加入2. O mL对二甲苯和60 mL四氯化碳(CC14)。磁力搅拌器搅拌至所 有固体溶解。加热回流12 ho停止反应后，趁热过滤，洗漆沉淀，滤液冷却后进行重结晶，得 到白色针状结晶，即对二溴二甲苯。
(b)在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中加入4. 94 g (3)- (a)制得对二溴二甲 苯和9. O g三苯基磷，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛。过滤、洗涤沉淀，得到白 色粉末状对二溴二甲苯的季磷盐。
(C)在氮气环境中，将(3)- (b)所得对二溴二甲苯的季磷盐转移到250 mL的三颈烧瓶中，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛。向反应溶液中逐滴滴加20 mL 5% NaOH溶液，搅拌反应物12 h，停止反应。萃取洗涤沉淀，无水MgSO4干燥过夜。减压蒸除溶剂，得到白色针状对二乙烯基苯。
(4)聚芴衍生物(PF-NH2)的合成在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中依次加入O. 19g (I)制得1，4-二溴对苯二胺， O. 10 g (2)制得 2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)-芴，O. 10 g (3) 制得二乙烯基苯、25 mg的醋酸钯(Pd (OAc) 2)、0. 3 g的三苯基磷(PPh3)、60 mL DMF、50mL三乙胺，在150 °〇加热回流48 h。反应停止后，用三氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤， 减压蒸馏，得到棕黄色新型聚芴衍生物(pf-nh2)。
(5)将(4)制备的PF-NH2配制溶液(I nM，溶于DMF中)。在一个100 mL的单口瓶中加入I mL PF-NH2溶液，8 mL乙醇，搅拌分散均匀。然后加入O.1 mL氨水溶液(25%)， 10 μ L的正硅酸四乙酯溶液(TE0S，体积浓度1/20的TEOS乙醇溶液)搅拌30 min。继续加入10 μ L TEOS溶液并搅拌30 min直到加入的TEOS溶液总量为50 μ L。反应结束后， 在10000 r .HiirT1转速下离心分离，用乙醇洗涤沉淀，反复三次。在真空干燥箱中以50 V 干燥5 h得到二氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2X
(6)在一个10 mL的小烧杯中加入(5)制备的PF-NH2OSiO2 O. 02 g,将I mL新制备的N，N’ -羰基二咪唑溶液(⑶I，100 mg .mL-1,溶于DMS0)加入并搅拌4 h。反应完全后，加入过量的二次水是过量⑶I分解，在10000 r · miiT1转速下离心分离，用二次水洗涤沉淀，反复三次。将修饰的PF-NH2OSiO2溶于磷酸缓冲溶液中(PBS，pH 7. 4)，加入一定量的二抗(Ab2)原溶液并在4 °C下活化2 h。在10000 r .HiirT1转速下离心分离，加入I mL牛血清白蛋白(BSA，1%)在4 °C下活化2 h。在10000 r ^mirT1转速下离心分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab2浓度为20 Ug-mr1.
(7)利用传统方法制备金纳米粒子(AuNPs)和四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4X在一个100 mL的圆底烧瓶中加入O.1 g Fe3O4纳米粒子,加入10 mL乙醇,然后加入O. 5 mL APTES并磁力搅拌I h，用磁铁进行分离，用二次水冲洗。加入I mL AuNPs(l%)，加入10 mL 并磁力搅拌2 h。用磁铁进行分离，用二次水冲洗。在真空干燥箱中以50 °C干燥10 h即得金纳米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu )。
(8)将(7汴6304_11制备粒子0.01 g溶于PBS中，加入一定量的一抗(Ab1)原溶液并在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，加入I mL BSA溶液，在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab1浓度为20 μ g
(9)在I mL的离心管中加入10 μ L (7)制备的Ab1溶液，然后加入10 μ L—定浓度的抗原(Ag)溶液，并在4 °C下活化2 h。加入10 UL (6) 制备的Ab2溶液，并在4 °C 下活化2 h。用磁铁进行分离，用吸液枪小心的吸取上清液，并用PBS洗涤，反复三次。
(10)利用流动注射化学发光测定(9)中所得物质的荧光信号。
实施例1 (糖类标志物，如CA19-9)(I)首先合成三种单体1，4-二溴对苯二胺(化合物I)，2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)_荷(化合物2)的合成,对二乙烯基苯(化合物3)的合成。通过Heck 聚合成PF-NH2的合成。
(2)将(I)制备的PF-NH2配制溶液(I nM，溶于DMF中)。在一个100 mL的单口瓶中加入I mL PF-NH2溶液，8 mL乙醇，搅拌分散均匀。然后加入O.1 mL氨水溶液(25%)，10 μ L的TEOS溶液搅拌30 min。继续加入10 μ L TEOS溶液并搅拌30 min直到加入的TEOS 溶液总量为50 μ L0反应结束后，在10000 r ^mirT1转速下离心分离，用乙醇洗涤沉淀，反复三次。在真空干燥箱中以50 °C干燥5 h得到PF-NH2OSiO2。
(3)在一个 10 mL 的小烧杯中加入(2)制备的 PF-NH2OSiO2 O. 02 g,将 I mL CDI 溶液加入并搅拌4 h。反应完全后，加入过量的二次水是过量⑶I分解，在10000 r · HiirT1 转速下离心分离，用二次水洗涤沉淀，反复三次。将修饰的PF-NH2OSiO2溶于PBS，加入一定量的CA19-9 二抗(Ab2)原溶液并在4 °C下活化2 h。在10000 r · mirT1转速下离心分离， 加入I mL BSA溶液，在4 °C下活化2 h。在10000 r · mirT1转速下离心分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab2浓度为20 Ug-mr1.
(4)利用传统方法制备AuNPs和Fe304。在一个100 mL的圆底烧瓶中加入O.1 g Fe3O4纳米粒子，加入10 mL乙醇，然后加入O. 5 mL APTES并磁力搅拌I h，用磁铁进行分离，用二次水冲洗。加入I mL AuNPs (1%)，加入10 mL并磁力搅拌2 h。用磁铁进行分离， 用二次水冲洗。在真空干燥箱中以50 °C干燥10 h即得Fe304@Au。
(5)将(4) Fe3O4OAu制备粒子O. 01 g溶于PBS中，加入一定量的CA19-9—抗 (Ab1)原溶液并在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，加入I mL BSA溶液，在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次。最后在沉淀中加入PBS至Ab1浓度为20 μ g · mL 1 ο
(6)在I mL的离心管中加入10 μ L (5)制备的Ab1溶液，然后加入10 μ L—定浓度的CA19-9抗原(Ag)溶液，并在4 °C下活化2 h。加入10 μ L (4)制备的Ab2溶液，并在4 °C下活化2 h。用磁铁进行分离，用吸液枪小心的吸取上清液，并用PBS洗涤，反复三次。(7)利用流动注射化学发光测定(6)中所得物质的荧光信号。
CA 19-9流动注射荧光传感器对人体、动物血清样品中的CA19-9进行检测，结果见表I。利用现有的方法，制备CA19-9电化学免疫传感器，连接电化学工作站，对人体、动物血清样品提取液中的CA19-9进行实际检测，结果见表I。
表I本发明CA19-9流动注射荧光免疫传感器与CA19-9电化学免疫传感器检测效果对比
权利要求
1.ー种检测检测免疫标记物的流动注射荧光传感器的制备方法，其包括以下步骤 (1)聚芴衍生物的合成(PF-NH2)； (2)合成ニ氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2)； (3)将ニ抗修饰在PF-NH2OSiO2 ； (4)按照现有方法制备金纳米粒子(AuNPs)，四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4)金納米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu)； (5)将一抗修饰在Fe3O4OAu表面； (6)利用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)制备流动注射荧光流通池； (7)将制作好的化学发光传感器结合流动注射化学发光仪对免疫标记物进行检测； 本发明所述ニ氧化硅包覆的聚芴衍生物及ニ氧化硅包覆的四氧化三铁的制备包括以下步骤 (1)1,4- ニ溴对苯ニ胺(化合物I) (a)在氮气环境中，加入250mL无水四氢呋喃(THF)，然后再加入4. 2 g氢化钠(NaH)，加入5. 17 g对ニ苯胺后加热回流I h ;冷却至室温后加入25 g碳酸ニ叔丁基酷,搅拌30min后加入4. 2 g NaH,回流12 h ;加入大量水使过多的反应物水解，然后用大量こ酸こ酯萃取，有机层用无水硫酸镁(MgSO4)干燥，过滤，减压蒸馏，在こ酸こ酯中结晶得到白色的N，N' -2 (叔丁氧擬基)-1，4-ニ氨基苯； (b)在氮气环境中，加入9mL无水こ醚和9 mL无水THF，加入(I)-(a)所得N，N' -2(叔丁氧羰基)-1，4-ニ氨基苯，冷却至-45で，逐滴加入25 mL 1.3 M的叔丁基锂的戊烷溶液，在-45で搅拌3 h，然后在-55で逐滴加入2 mL —氯三甲基硅烷，反应室温搅拌反应·12 h;向反应液中加入10 mL 10%的盐酸溶液，用こ酸こ酯萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，减压蒸馏，过柱可得白色的N，N' _2 (叔丁氧羰基)-1，4-ニ氨基-2，5-2 (三甲基硅烷基)苯; (c)在氮气环境中，加入无水ニ氯甲烷，加入(I)-(b)所得N，N' -2 (叔丁氧羰基)-1，4-ニ氨基-2，5-2(三甲基硅烷基)苯，再加入1.53 g NBS，反应在室温搅拌3 h，加入·5mL水，用ニ氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，减压蒸馏，重结晶可得白色N，N' -2(叔丁氧擬基)_1, 4- ニ氨基-2，5-2溴苯； (d)在氮气环境中，加入10mL三氟こ酸和10 mL无水ニ氯甲烷于装置中，加入(I)-(C)所得N，N' -2 (叔丁氧羰基)-1，4-ニ氨基-2，5-2溴苯，室温搅拌12 h，然后减压蒸馏，蒸干；向其中加入5 mL无水ニ氯甲烷，再加入无空气饱和碳酸氢钠溶液，控制pH 8 9，搅拌·3 h，用除空气的ニ氯甲烷萃取，合并有机层，用MgSO4干燥，减压蒸馏，重结晶得到1，4_ ニ溴对苯ニ胺； (2)2，7-ニ溴-9，9-ニ(3'- (N，N/ - ニ甲氨基)丙基)-芴(化合物2)的合成 在氮气环境中，加入4 g 2，7-ニ溴荷和80 mg四丁基溴化铵,加入60 mL ニ亚甲基亚砜(DMS0)，直接加入8 ml 50%氢氧化钠(NaOH)溶液；将溶有5 g 3-ニ甲基氨基丙基氯的盐酸盐((CH3)2N(CH2)3Cl .HCl)的溶液加入到20 mL (DMSO)并滴加到混合物中，搅拌12 h ；向反应液中加入50 mL的水，溶解剰余盐类；将得到的产品萃取、洗涤；洗涤后的溶液用无水MgSO4干燥，减压过滤，旋蒸蒸除溶剂，得到黄色2，7-ニ溴-9，9-ニ(3' - (N，N/ - ニ甲氨基)丙基)-芴；(3)对二乙烯基苯(化合物3)的合成 (a)在氮气环境中，向100mL三颈烧瓶中加入5.8 g N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)，O. 10g过氧化苯甲酰，再加入2. O mL对二甲苯和60 mL四氯化碳(CCl4);磁力搅拌器搅拌至所有固体溶解；加热回流12 h ;停止反应后,趁热过滤,洗漆沉淀,滤液冷却后进行重结晶,得到白色针状结晶，即对二溴二甲苯； (b)在氮气环境中，向100mL三颈烧瓶中加入4. 94 g (3)- (a)制得对二溴二甲苯和9.0 g三苯基磷，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛；过滤、洗涤沉淀，得到白色粉末状对二溴二甲苯的季磷盐； (c)在氮气环境中，将(3)-(b)所得对二溴二甲苯的季磷盐转移到250 mL的三颈烧瓶中，再加入30 mL无水二氯甲烷和30 mL甲醛；向反应溶液中逐滴滴加20 mL 5% NaOH溶液，搅拌反应物12 h，停止反应；萃取洗涤沉淀，无水MgSO4干燥过夜；减压蒸除溶剂，得到白色针状对二乙烯基苯； (4)聚芴衍生物(PF-NH2)的合成 在氮气环境中，向100 mL三颈烧瓶中依次加入O. 19g (I)制得1，4-二溴对苯二胺，O.10 g (2)制得 2，7-二溴-9，9-二(3' - (N, N' -二甲氨基)丙基)-芴，O. 10 g (3)制得二乙烯基苯、25 mg的醋酸钯(Pd (OAc) 2)、0. 3 g的三苯基磷(PPh3)、60 mL DMF、50mL三乙胺，在150 1加热回流48 h;反应停止后，用三氯甲烷萃取，有机层用MgSO4干燥，过滤，减压蒸馏，得到棕黄色新型聚芴衍生物(PF-NH2)； (5)将(4)制备的PF-NH2配制溶液(InM，溶于DMF中)；在一个100 mL的单口瓶中加入I mL PF-NH2溶液，8 mL乙醇，搅拌分散均匀；然后加入O.1 mL氨水溶液(25%)，10 μ L的正硅酸四乙酯溶液(TE0S，体积浓度1/20的TEOS乙醇溶液)搅拌30 min ;继续加入10μ L TEOS溶液并搅拌30 min直到加入的TEOS溶液总量为50 μ L ;反应结束后，在10000r -min-1转速下离心分离，用乙醇洗涤沉淀，反复三次；在真空干燥箱中以50 °C干燥5 h得到二氧化硅包覆的聚芴衍生物(PF-NH2OSiO2)； (6)在一个10mL的小烧杯中加入(5)制备的PF-NH2OSiO2 O. 02 g,将I mL新制备的N，N’-羰基二咪唑溶液(⑶I，100 mg.mL—1，溶于DMS0)加入并搅拌4 h;反应完全后，加入过量的二次水是过量⑶I分解，在10000 r · HiirT1转速下离心分离，用二次水洗涤沉淀，反复三次；将修饰的PF-NH2OSiO2溶于磷酸缓冲溶液中(PBS，pH 7. 4)，加入一定量的二抗(Ab2)原溶液并在4 °C下活化2 h;在10000 r IirT1转速下离心分离，加入I mL牛血清白蛋白(BSA，1%)在4 °C下活化2 h ;在10000 r -min^1转速下离心分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次；最后在沉淀中加入PBS至Ab2浓度为20 μ g · mL—1 ； (7)利用传统方法制备金纳米粒子(AuNPs)和四氧化三铁磁性粒子(Fe3O4);在一个100mL的圆底烧瓶中加入O.1 g Fe3O4纳米粒子，加入10 mL乙醇，然后加入O. 5 mL APTES并磁力搅拌I h，用磁铁进行分离，用二次水冲洗；加入I mL AuNPs (1%)，加入10 mL并磁力搅拌2 h ;用磁铁进行分离，用二次水冲洗；在真空干燥箱中以50 °C干燥10 h即得金纳米粒子包覆的四氧化三铁(Fe3O4OAu)； (8)将(7)Fe3O4OAu制备粒子0.01g溶于PBS中，加入一定量的一抗(Ab1)原溶液并在4 °C下活化2 h;用磁铁进行分离，加入I mL BSA溶液，在4 °C下活化2 h ;用磁铁进行分离，用PBS洗涤沉淀，反复三次；最后在沉淀中加入PBS至Ab1浓度为20 μ g · mL—1 ；(9)在ImL的离心管中加入10 UL (7)制备的Ab1溶液，然后加入10 U L—定浓度的抗原(Ag)溶液，并在4で下活化2 h;加入10 UL (6)制备的Ab2溶液，并在4で下活化2 h ;用磁铁进行分离，用吸液枪小心的吸取上清液，并用PBS洗涤，反复三次； (10)利用流动注射化学发光測定(9)中所得物质的荧光信号。
全文摘要
本发明公开了一种新型聚芴衍生物的合成及在肿瘤标志物流动注射荧光传感器中的应用。该聚芴衍生物的合成包括以下步骤1,4-二溴对苯二胺(化合物1)的合成；2,7-二溴-9,9-二(3′-(N,N′-二甲氨基)丙基)-芴(化合物2)的合成；对二乙烯基苯(化合物3)的合成；将三种单体通过Heck反应聚合成聚芴衍生物。该传感器的制备，包括以下步骤利用聚甲基丙烯酸甲酯制备流动注射荧光流通池；制备四氧化三铁磁性粒子，金纳米粒子，并组装成金包覆的四氧化三铁；将一抗修饰在金包覆的四氧化三铁上；对聚芴衍生物进行包硅处理；将二抗修饰在硅包覆的聚芴衍生物表面；进行免疫反应，并对其进行流动注射荧光检测。本发明的传感器特异性强，灵敏度高，操作简单，检测线低。
文档编号G01N21/64GK103033618SQ20121057715
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者颜梅, 楚成超, 葛慎光, 葛磊, 于京华, 黄家栋, 李蒙, 李龙, 刘芳, 刘伟艳, 王衍虎, 张彦, 王盼盼, 李伟平 申请人:济南大学