专利名称：猪tgev抗体与猪pedv抗体胶体金试纸条的制作方法
猪TGEV抗体与猪PEDV抗体胶体金试纸条技术领域
本发明属于兽医生物技术领域，涉及一种快速检测抗体技术，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪流行性腹泻病毒(PEDV)两种抗体的胶体金检测试纸条，同时还涉及该试纸条的制备方法和应用方法。
背景技术：
猪传染性胃肠炎(Transmissible Gastroenteritis, TGE)和猪流行性腹湾 (Porcine Transmissible Gastroenteritis, PED)是由冠状病毒科、冠状病毒属的猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis virus TGEV)和猪流行性腹 写病毒 (Porcine Transmissible Gastroenteritis virus, PEDV)引起的猪的高度接触性肠道疾病，以秋始、冬春加剧和夏少为主要流行特点，各种年龄猪都可发病，哺乳仔猪病死率很高，10日龄以内仔猪病死率可达100%。
近年来，猪腹泻病给我国养猪业带来巨大损失。为了更好的控制这两种猪腹泻疾病，就必须及时了解并掌握猪场病毒的感染情况，因此，开发建立一 种可以对猪群同时进行 PEDV和TGEV血清抗体检测快速的有效方法是十分必要的。目前已有的检测血清抗体的方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA法)和中和试验法，在这些传统的检测方法中存在一些较难克服的缺点，比如中和试验步骤较为繁琐，检测所需时间较长，且结果判定需要一定的专业技术；ELISA检测法中需要配合酶标仪进行使用，检测的专业人员也需要经过专业培训，同时ELISA检测方法还存在特异性不高稳定性差等特点。因此迫切的需要建立一种省时省力又可以迅速普及的检测方法。
免疫胶体金技术目前已广泛应用于临床诊断，在发明“检测一种或多种猪病毒性腹泻疾病抗体的试纸条”中就结合免疫胶体金技术进行检测。其金标蛋白为SPA蛋白或待检抗体，检测线固定TGEV与PEDV全病毒，质控线为羊或兔抗SPA产生的IgG蛋白或者羊或兔抗TGEV和PEDV病毒的IgG蛋白。使用全病毒与SPA存在灵敏度不高、特异性不强的特点，如果使用病毒中强抗原性蛋白与其单克隆抗体那么久可以解决其灵敏度与特异性的问题。发明内容
本发明的一个目的在于提供一种快速检测PEDV和TGEV血清抗体的试纸条。
本发明的另一个目的在于提供该试纸条的制备方法。
本发明试纸条包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，其中，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的两种表达蛋白，分别是猪流行性腹泻病毒S1蛋白与含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段；所述检测层上设置有两条检测线和两条质控线，所述两条检测线依次固定所述的S1 蛋白及所述的S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段，所述两条质控线依次固定有针对两个蛋白片段的单克隆抗体。
其中，支撑层优选选用聚乙烯纤维板；加样垫优选选用中速定性滤纸；释放垫优选选用玻璃纤维；检测层优选选用硝酸纤维素膜；吸收层优选选用玻璃纤维。
本发明提供的所述检测试纸条的制备方法包括以下步骤
I)在检测层的不同位置上分别固定猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段及其对应的单克隆抗体，分别形成两条检测线和质控线；
2)制备含有两种金标蛋白的释放垫；
3)组装支撑层、加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。
I)在检测层的不同位置上依次固定猪流行性腹泻病毒
其中，制备金标蛋白释放垫包括如下步骤以1:100^3000的标记比例将待标记的猪流行性腹泻病毒S1蛋白或猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白片段加入到ρΗ7· (ΓΙΟ. O胶体金溶液中，按1:10^500的比例用含O.广5%BSA的O. 001 O. lmol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的S1蛋白或S蛋白AD位点的重组表达蛋白，将稀释后的胶体金标记蛋白液按60 μ L/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥。
其中，将包被浓度为O. r2mg/mL,优选为O. 2^0. 8mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1 蛋白按I μ L/cm的速度喷于检测层上作为检测线1，将包被浓度为O. f2mg/mL，优选为O.2^0. 8mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白按I μ L/cm的速度喷于检测层上作为检测线2，将包被浓度为O. f 5mg/mL，优选为O. 2^0. 8mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体按I μ L/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线1，将包被浓度为O. l 5mg/mL,优选为O. 2"O. 8mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白单克隆抗体按I μ L·/cm的速度喷于质控线I下方的检测层上作为质控线2，37°C 下干燥30min，从而制备检测层。
本发明中使用的金标蛋白和检测线蛋白均为猪流行性腹泻病毒S1蛋白与含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白AD位点的重组表达蛋白，质控线蛋白则为两种蛋白各自的单克隆抗体，解决了灵敏度与特异性问题，建立起省时省力又能迅速普及的检测方法。
与传统的PEDV与TGEV抗体检测方法相比，本发明具有明显的优越性
I)特异性强，使用原核表达的PEDV S1蛋白与TGEV S蛋白AD位点的重组表达蛋白和其相应的单克隆抗体，极大的降低了出现假阳性的概率，保证了试纸条特异性和灵敏度， 同时，两条质控线也保证了检测结果的准确性；
2)安全性高，避免检测过程中病毒的操作；
3)操作简便，本发明不需要专业的技术人员进行操作和专业仪器的辅助检测；
4)判定结果快捷，与传统的中和试验和ELISA试验所用时间相比，本检测结果直观易判定并且检测时间只需IOmin极为迅速。
图1所示为本发明试纸条侧面结构示意图。图中1为加样垫，2为释放垫，3为检测层，4为吸收层，5为支撑层，6为检测线_1，7为检测线_2，8为质控线_1，9为质控线-2。
图2所示是本发明金试纸条正面结构示意图。图中
A检测线_1、2与质控线_1、2均显现，为PEDV和TGEV抗体阳性样品检测结果；
B检测线-1与两条质控线均显色，其为PEDV抗体阳性样品检测结果；
C检测线-2与两条质控线均显色，其为TGEV抗体阳性样品检测结果；
D仅有一条质控线显色,为无效检测；
E质控线与检测线均不显现，为无效检测。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1PEDV S1蛋白的表达纯化及其单克隆抗体的制备
1、PEDV S1蛋白的表达纯化
①目的基因的提取与扩增
本胶体金试纸条选择的金标蛋白为PEDV S蛋白中反应原性较好的片段S1蛋白， 针对国内流行株，根据其对应的S1蛋白基因设计如下引物
上游引物5，-ACGGATCCGATGGCACCAGGTGATC-3’
下游引物5’ -CTGAATTCATGACTGTCCATGACTC-3 ’
使用试剂盒(R0CHE试剂盒)提取猪流行性腹泻病毒的RNA。具体操作步骤在1.5mL的EP管中加入200 μ L病毒液和400 μ L含有Poly A的Binding Buffer,混匀静置 Imin后转移入高效过滤管中，8000Xg离心15s弃去液体；加入过滤管中500 μ L Inhibitor Removal Buffer8000 X g 离心 lmin,弃去液体；加入过滤管中 450 μ L Wash Buffer8000 X g 离心lmin，弃去液体，重复两次后再离心15s至液体甩干；最后在过滤管中加入50 μ L Elution Buffer8000 X g 离心 lmin 就得到净化的 RNA。
反转录的具体操作步骤
使用全式金反转录试剂盒进行反转录，20μ L体系组成为已提取的RNA5yL， Random Primer(O.1 μ g/μ I)I μ L,2 X TS Reactiom MixlO μ L,TransScript RT/RI Enzyme Mixl μ L, Nase-free Water3 μ L。反转录反应条件为 25°C孵育 IOmin, 42°C孵育 30min。85°C 加热5min。
常规PCR的50 μ I反应体系组成为取PCR模板I μ 1，上下游引物各I μ 1(浓度均为 50mmol/L)，10 XPCRbuffer (含 Mg2+) 5 μ L，2. 5mMdNTPs4 μ L (浓度均为 2. 5mmol/L)、Taq DNA聚合酶I μ L，dd Η2038 μ L。PCR的反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，55°C退火40s，72°C延伸45s，35个循环，然后72°C延伸7min。
反应结束后取8 μ LPCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳检验产物的大小。结果显示PEDV 的S1基因大小约在1500bp附近，与实际的1445bp相符。
电泳结束后，切下目的条带，按DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)的操作步骤进行，将得到纯化的DNA置_20°C保存备用。
②PCR产物的连接、转化与鉴定
PEDV S1基因的鉴定将纯化的S1-DNA连接在pMD19_T载体，转化感受态大肠杆菌TGl，对转化菌进行蓝白斑筛选，挑选白斑，LB培养基培养并提取质粒，用PCR方法快速鉴定阳性克隆。将阳性克隆质粒送北京博迈德生物公司测序，测序结果显示阳性重组质粒正确。
质粒PETIZa-S1的制备连接PEDV S1基因取pET_32a载体质粒及回收的PEDVS1PCR 产物各 20 μ LJnTvBamH I 和 EcoR I 酶各 2. 5 μ L，10Xbuffer5 μ L，水 15μ L，在 37°C 水浴反应3h后回收酶切产物。加入BamH I和EcoR I酶切回收后的载体I μ L，PCR产物 4yL, IOXbufferlyL, T4DNA 连接酶 I μ L，水 3 μ L，16°C过夜连接。
按常规方法制备JM109感受态细胞取连接后产物质粒PETIZa-S1S μ L，加入感受态细胞，42°C热激，冰上放置2min，加入无抗性培养基，震荡培养50min，取100 μ L培养物涂布含卡那抗性的LB平板，37°C过夜培养。挑取过夜生长的菌落，利用碱裂解法提取质粒， 用BamH1、EcoR I双酶切鉴定重组质粒PEI^Za-S1。对阳性两个重组质粒进行进一步的 PCR鉴定。结果为阳性，确定转化成功。
③阳性重组菌的诱导表达
挑取鉴定为阳性的重组菌接种于LB培养基上，过夜后转入三角瓶进行37°C培养至OD6tltl O. 6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1. 5mmol/L进行诱导表达，转入25°C培养6h。
取出培养物，将重组菌超声裂解后的上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，阴性对照为只转化载体的JM109感受态细胞，考马斯亮蓝染色。电泳结果表明重组菌的裂解物沉淀和上清中均存在分子量约为SOku大小的条带，阴性对照中未见上述条带。
④目的蛋白的纯化
将诱导6h后的融合蛋白收获菌液，5000r/min离心lOmin，加入IOmL结合缓冲液， 弃去上清后用IOmL的结合缓冲液重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解5s、间隔5s、超声至液体透明。然后10000r/min离心15min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。取上清液利用pET-32a载体带有的His-tag选择性标签应用Nitrogen公司说明书纯化蛋白。
2、PEDV S1蛋白单克隆抗体的制备
①动物免疫程序
将纯化好的蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分混匀乳化，小鼠腹腔注射，接种剂量 75 μ g/只；2周后用同样纯化好的蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；四周后， 再次用同样的纯化蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；最后一次不加佐剂的纯化蛋白加强免疫。
②筛选方法的建立
采集免疫后的小鼠的第21d、35d以及取脾脏前断尾采血，离心后获得阳性血清。 以纯化的表达蛋白作为包被抗原，用包被液做1:200、1:400、1:600、1:800、1:1000倍稀释。 将稀释液按100μ L/孔加入酶标板，振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用塑料膜封好，4°C过夜。次日弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液IL :氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠 2. 7g，磷酸二氢钾0. 2g。pH 7. 4，500 μ L吐温-20) 250 μ L/孔，室温下洗 3min，用干净吸水纸在桌面上轻轻拍干，反复洗涤三次。用5%脱脂奶粉以PBST稀释作为封闭液，100 μ L/孔。将包被的酶标板用塑料膜封好，37°C放置2h。弃去ELISA板中液体， 加入洗涤液(PBST溶液250 μ L/孔)，室温下洗3次每次3min。阳性血清为一抗，分别作 1:50、1:80,1:100,1:150,1:200稀释，加入酶标板中，100 μ L/孔，同时设空白对照，37°C作用I h，洗涤三次，拍干。加入用5%脱脂奶粉1:8000稀释的HRP-兔抗鼠IgG，IOOuL/孔， 37°C作用lh，洗涤三次后拍干。加底物溶液(TMB. H2O2) ,IOOyL/孔，室温作用15min，加入终止液(2M H2SO4溶液)50 μ L/孔，在酶标仪上读取OD值。以阳性血清孔的OD值接近1.0，P/N>2. O的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度，其分别为1:600和 1:100。
③细胞融合
分离脾细胞取加强免疫后三天的BALB/C小鼠，眼球摘除放血，分离血清供阳性抗体用；将小鼠颈椎脱白处死，用75%酒精擦拭消毒后，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入己盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有IOmL基础培养液的带铜网的平皿内，后用研磨器轻轻研磨，将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，1000r/min离心 lOmin，细胞沉淀用基础培养液同法离心洗涤一次，然后用培养液将细胞重悬至10 20mL， 混匀，台盼蓝染色活细胞计数后备用。
制备骨髓瘤细胞融合前两周复苏骨髓瘤SP2/0细胞，并将骨髓瘤SP2/0细胞经 8-AG选择培养。细胞复苏后，加入8-AG(20ug/mL)的DMEM完全培养液选择培养三代以上， 以保持HGPRT缺陷型。融合当天，取生长状态良好的SP2/0细胞，用PBS缓冲液洗涤三次， 将刚好处于对数生长期的细胞收集至离心管中，900r/min离心IOmin,弃去营养液,用基础培养液洗涤一次后将细胞重新悬浮，台盼兰染色细胞计数，把细胞稀释为IO6个/mL，放置离心管中备用。
细胞融合按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量 5:1 10:1之间混合,加入5OmL白勺一次性无菌离心管内，1000r/min离心IOmin,弃上清,用无菌吸纸充分吸干残余液体，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；将离心管置于37°C水的烧杯中，吸取37°C预热的50%聚乙二醇(PEG)溶液I mL在Imin内缓慢滴入，用在水浴上轻轻摇动离心管I min，在Imin内缓缓滴入37°C预热的基础培养液I mL，边滴边转动离心管，随后在Imin内缓慢滴入37°C预热的基础培养液4mL，在随后的4min内加入补加基础培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。1000r/min离心lOmin，弃上清，将细胞沉淀轻悬于含20%胎牛血清的预温HAT选择培养液40mL中，混合均匀，加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100 μ L，将培养板移至37°C，5% CO2培养箱中培养。
④阳性孔克隆化并扩大培养
阳性杂交瘤细胞用间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，采用有限稀释法对已鉴定的阳性杂交瘤细胞进行克隆化。
融合后的细胞3d后观察，并每隔7d更换培养液一次，采用半换液方式。待杂交瘤细胞长满孔底1/3 1/2时，于换液I 2d后即可取细胞培养上清液IOOuL,不作稀释，用融合蛋白包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性 对照，阳性鼠血清为阳性对照。
将已检测为分泌阳性的特定孔中杂交瘤细胞集落吹起混匀，细胞用台盼蓝染色计数，取上述细胞悬液，用含20%胎牛血清的完全培养液稀释到I mL含10个细胞，将稀释好的细胞悬液100 μ I加入到预先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。适时换液、筛选与克隆化，同时每次将克隆化剩余细胞进行扩大培养冻存。经过2-3次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
⑤动物接种及单抗腹水的粗提
在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前I周，先给8 12周龄雌性BALB/C小鼠每只腹腔注射0. 5mL液体石蜡。将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000r/min 离心5min，再用PBS缓冲液(pH7. 2)悬浮离心洗涤2次，台盼蓝染色做活细胞计数后将细胞密度数调至1-2X 106个/mL，每只小鼠腹腔注射0. 5mL细胞悬液，约含5 10X 105个细胞。 接种后注意观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大，行动不便时，用碘酒棉球消毒下腹部皮肤后，可用20mL注射器针头刺入腹腔，可见有淡黄色的腹水滴出，用无菌离心管收集，4°C放置过夜，3000r/min离心5min,去除油脂沉淀,上清即为腹水,分装标记后，-80°C保存；间隔 3d，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠抽取2 3次。
采用硫酸铵沉淀法进行单抗的粗提。取5mL小鼠腹水，4°C 10000r/min,离心 15min,除去细胞碎片及其他杂质；将上清液移入小烧杯中，压泵缓慢滴加饱和硫酸铵 (pH7. 8) 2. 5mL,边加边搅拌；搅拌30min后，10000r/min离心15min,弃上清；沉淀物用1/3 饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min,同法离心。沉淀物溶于ImL的PBS中，装入透析带内， 4°C透析过夜，其间换液4次，直至检测不到NH4+和SO广。移出蛋白质溶液，10000r/min离心15min，收集上清即为粗提的单抗。紫外分光光度计测蛋白含量，分装标记为S1蛋白，一 80°C保存备用。
实施例2TGEV S重组蛋白片段的表达纯化及其单克隆抗体的制备
1、S蛋白AD位点的重组表达蛋白的表达纯化
①目的基因的提取与扩增
选择TGEV S蛋白中反应原性较好的A、D位点进行表达,针对国内流行株，通过 GenBank比对设计S蛋白AD位点的重组表达蛋白基因设计如下引物
TGEV S蛋白AD位点的重组表达蛋白
上游引物ACGTCGACTGCTACGATGATTTCA
下游引物GTAAGCTTATAGCCCCAACTATGG
提取RNA为ROCHE试剂盒的常规操作。使用试剂盒(R0CHE试剂盒)提取猪传染性胃肠炎病毒的RNA :在1. 5mL的EP管中加入200 μ L病毒液和400 μ L含有Poly A的 Binding Buffer,混勻静置Imin后转移入高效过滤管中，8000 X g离心15s弃去液体；加入过滤管中500μ Inhibitor Removal Buffer8000 X g离心lmin,弃去液体；加入过滤管中 450 μ Lffash BufTer8000 X g离心lmin,弃去液体,重复两次后再离心15s至液体甩干；最后在过滤管中加入50μ Elution Buffer8000 X g离心lmin就得到净化的RNA。
反转录的具体操作步骤
使用全式金反转录试剂盒进行反转录，20 yL体系组成为RNA5 μ L, Random Primer(0.1 μ g/μL)I μ L,2XTS Reactiom MixlO μ L, TransScript RT/RI Enzyme MixIμ L, Nase-free Water3 μ L0 反转录反应条件为 25°C孵育 lOmin, 42°C孵育 30min, 85°C加热 5min。
常规PCR的50 μ I反应体系组成为取PCR模板I μ 1，上下游引物各I μ I (浓度均为 50mmol/L)，10XPCR buffer (含 Mg2+)5 μ L，2. 5mM dNTPs4 μ L (浓度均为 2. 5mmol/L)、 Taq DNA聚合酶I μ L，dd H2038 yL。PCR的反应条件为常规反应条件94°C预变性5min， 94°C变性40s，55。。退火40s，72。。延伸45s，35个循环，然后72°C延伸7min。
反应结束后取8 μ L PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳检验产物的大小。结果显示检测基因大小约为1200bp与实际的1202bp相符。
电泳结束后，切下目的条带，按DNA凝胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)的操作步骤进行，将得到纯化的DNA标记为St-DNA,置-20°C保存备用。
②PCR产物的连接、转化与鉴定
St-DNA的鉴定将纯化的St-DNA连接在pMD19_T载体，转化感受态大肠杆菌，对转化菌进行蓝白斑筛选，挑选白斑，LB培养基培养并提取质粒，用PCR方法快速鉴定阳性克隆。将阳性克隆质粒送北京博迈德生物公司测序，测序结果显示阳性重组质粒正确。
质粒pET-32a_ST的制备连接TGEV St基因取pET_32a载体质粒及回收的TGEV StPCR 产物各 20 μ L，加入 BamH I 和 Hind III 酶各 2. 5 μ L，10Xbuffer5 μ L，水 15 μ L，在 37°C水浴反应3h后回收酶切产物。加入BamH I和Hind III酶切回收后的载体I μ L，PCR 产物 4 μ L，10 Xbufferl μ L，T4DNA 连接酶 I μ L，水 3 μ L，16°C过夜连接。
按常规方法制备JM109感受态细胞取连接后产物质粒pET-32a_ST5 μ L，加入感受态细胞，42°C热激，冰上放置2min，加入无抗性培养基，震荡培养50min，取100 μ L培养物涂布含卡那抗性的LB平板，37 °C过夜培养。
挑取过夜生长的菌落，利用碱裂解法提取质粒，用BamH1.Hind III双酶切鉴定重组质粒pET-32a-ST。对阳性重组质粒进行进一步的PCR鉴定。结果为阳性，确定转化成功。
③阳性重组菌的诱导表达
挑取鉴定为阳性的重组菌接种于LB培养基上，过夜后转入三角瓶进行37°C培养至OD6tltl O. 5时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度为1. 6mmol/L进行诱导表达，转入25°C培养6h。
取出培养物，将重组菌超声裂解后的上清与沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析，阴性对照为只转化载体的JM109感受态细胞，考马斯亮蓝染色。电泳结果表明重组菌的裂解物沉淀和上清中均存在分子量约为65ku大小的条带，与理论66ku相符合，阴性对照中未见上述条带。
④目的蛋白的纯化
将诱导6h后的融合蛋白收获菌液，5000r/min离心lOmin，加入IOmL结合缓冲液， 弃去上清后用IOmL的结合缓冲液重悬菌液，将样品置于冰浴中超声波裂解5s、间隔5s、超声至液体透明。然后10000r/min离心15min，去除细胞碎片，将上清液移入新管中。取上清液利用pET-32a载体带有的His-tag选择性标签应用Nitrogen公司说明书纯化蛋白。
2、单克隆抗体的制备
①动物免疫程序
将纯化好的蛋白与弗氏完全佐剂等体积充分混匀乳化，小鼠腹腔注射，接种剂量 50 μ g/只；2周后用同样纯化好的蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；四周后， 再次用同样的纯化蛋白与弗氏不完全佐剂的乳化物注入小鼠腹腔；最后一次不加佐剂的纯化蛋白加强免疫。
②筛选方法的建立
采集免疫后的小鼠的第21d、35d以及取脾脏前断尾采血，离心后获得阳性血清。 以纯化的表达蛋白作为包被抗原，用包被液做1:200、1:400、1:600、1:800、1:1000倍稀释。 将稀释液按100μ L/孔加入酶标板，振动平板以使抗原分布均匀。将包被的酶标板用塑料膜封好，4°C过夜。次日弃去ELISA板中液体，加入洗涤液(PBST溶液)250 μ L/孔，室温下洗3min，用干净吸水纸在桌面上轻轻拍干，反复洗涤三次。用5%脱脂奶粉以PBST稀释作为封闭液，100 μ L/孔。将包被的酶标板用塑料膜封好，37°C放置2h。弃去ELISA板中液体， 加入洗涤液(PBST溶液)250 μ L每孔，室温下洗3次每次3min。阳性血清为一抗，分别作 1:50、1:80,1:100,1:150,1:200稀释，加入酶标板中，100 μ L/孔，同时设空白对照，37°C作用I h，洗涤三次，拍干。加入用5%脱脂奶粉1:8000稀释的HRP-兔抗鼠IgG，IOOuL每孔， 37°C作用lh，洗涤三次，拍干。加底物溶液(TMB. H2O2) ,IOOyL/孔，室温作用15min，加入终止液(2M H2SO4溶液)50 μ L/孔，在酶标仪上读取OD值。以阳性血清孔的OD值接近1.0， Ρ/Ν>2. O的抗原血清最大稀释度作为抗原及对照血清的最适工作浓度，其分别为1:600和 1:150。
③细胞融合
分离脾细胞取加强免疫后三天的BALB/C小鼠，眼球摘除放血，分离血清供阳性抗体用；将小鼠颈椎脱白处死，用75%酒精擦拭消毒后，移入超净工作台内，固定于解剖板上，用灭菌剪刀、镊子分别剪开皮肤和腹膜，无菌取出脾脏，放入己盛有基础培养液的无菌平皿中清冼，剥离被膜上的结缔组织。将脾脏移入另一盛有IOmL基础培养液的带铜网的平皿内，后用研磨器轻轻研磨，将平皿中脾细胞悬液转移到50mL离心管中，1000r/min离心 lOmin，细胞沉淀用基础培养液同法离心洗涤一次，然后用培养液将细胞重悬至10 20mL， 混匀，台盼蓝染色活细胞计数后备用。
制备骨髓瘤细胞融合前两周复苏骨髓瘤SP2/0细胞，并将骨髓瘤SP2/0细胞经 8-AG选择培养。细胞复苏后，加入8-AG(20ug/mL)的DMEM完全培养液选择培养三代以上， 以保持HGPRT缺陷型。融合当天，取生长状态良好的SP2/0细胞，用PBS缓冲液洗涤三次， 将刚好处于对数生长期的细胞收集至离心管中，900r/min离心IOmin,弃去营养液,用基础培养液洗涤一次后将细胞重新悬浮，台盼兰染色细胞计数，把细胞稀释为IO6个/mL，放置离心管中备用。
细胞融合按常规方法融合，取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按细胞数量 5:1 10:1之间混合,加入5OmL白勺一次性无菌离心管内，1000r/min离心IOmin,弃上清,用无菌吸纸充分吸干残余液体，用手指弹击管底，使两种细胞充分混匀，直至成糊状；将离心管置于37°C水的烧杯中，吸取37°C预热的50%聚乙二醇(PEG)溶液I mL在Imin内缓慢滴入，用在水浴上轻轻摇动离心管I min，在I min内缓缓滴入37°C预热的基础培养液I mL， 边滴边转动离心管，随后在Imin内缓慢滴入37°C预热的基础培养液4mL，在随后的4min内加入补加基础培养液至30mL轻轻搅动离心管使PEG彻底稀释而失去融合作用。1000r/min 离心lOmin，弃上清，将细胞沉淀轻悬于含20%胎牛血清的预温HAT选择培养液40mL中，混合均匀，加入到已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100 μ L，将培养板移至37°C， 5% CO2培养箱中培养。
④阳性孔克隆化并扩大培养
阳性杂交瘤 细胞用间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，采用有限稀释法对已鉴定的阳性杂交瘤细胞进行克隆化。
融合后的细胞3d后观察，并每隔7d更换培养液一次，采用半换液方式。待杂交瘤细胞长满孔底1/3 1/2时，于换液I 2d后即可取细胞培养上清液IOOuL,不作稀释，用融合蛋白包被的间接ELISA方法进行特异性抗体的检测，同时用SP2/0细胞培养上清液作阴性对照，阳性鼠血清为阳性对照。
将已检测为分泌阳性的特定孔中杂交瘤细胞集落吹起混匀，细胞用台盼蓝染色计数，取上述细胞悬液，用含20%胎牛血清的完全培养液稀释到I mL含10个细胞，将稀释好的细胞悬液100 μ I加入到预先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。适时换液、筛选与克隆化，同时每次将克隆化剩余细胞进行扩大培养冻存。经过2-3次克隆化操作，直至所有克隆化细胞孔检测阳性率为100%时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
⑤动物接种及单抗腹水的粗提
在接种分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞前I周，先给8 12周龄雌性BALB/C小鼠每只腹腔注射O. 5mL液体石蜡。将培养的杂交瘤细胞从细胞培养瓶中冲洗下来，1000r/min 离心5min，再用PBS缓冲液(pH7. 2)悬浮离心洗涤2次，台盼蓝染色做活细胞计数后将细胞密度数调至f 2X IO6个/mL，每只小鼠腹腔注射O. 5mL细胞悬液，约含5 10X IO5个细胞。 接种后注意观察小鼠状态，待小鼠腹部明显膨大，行动不便时，用碘酒棉球消毒下腹部皮肤后，可用20mL注射器针头刺入腹腔，可见有淡黄色的腹水滴出，用无菌离心管收集，4°C放置过夜，3000r/min离心5min,去除油脂沉淀,上清即为腹水,分装标记后，_80°C保存；间隔 3d，待腹水再生积聚后，同法再取，一只小鼠可抽取2 3次。
采用硫酸铵沉淀法进行单抗的粗提。取5mL小鼠腹水，4°C 10000r/min,离心 15min，除去细胞碎片及其他杂质；将上清液移入小烧杯中，压泵缓慢滴加饱和硫酸铵 (pH7. 8) 2. 5mL,边加边搅拌；搅拌30min后，10000r/min离心15min,弃上清；沉淀物用1/3 饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30min,同法离心。沉淀物溶于ImL的PBS中，装入透析带内， 4°C透析过夜，其间换液4次，直至检测不到NH4+和SO广。移出蛋白质溶液，10000r/min离心15min，收集上清即为粗提的单抗。紫外分光光度计测蛋白含量，分装，一 80°C保存备用。
实施例3胶体金试纸条的组装
1、胶体金标记抗原蛋白
以柠檬酸钠还原法制备金溶液在50ml沸腾的O. 02%氯金酸水溶液中加入4ml的1.2%柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热直至溶液呈稳定而透亮的红色。在透射电镜下观察胶体金溶液，发现胶体金颗粒其大小均一，无椭圆形或者其他不规则形状，说明已获得了稳定胶体金。
以O. lmol/L的K2CO3调节胶体金pH值7.5，以1:1000的标记比例将待标记蛋白 (S1或St)加入到调节好pH值的胶体金溶液中，静置IOmin后，加入20%聚乙二醇(PEG) 10000至最终浓度为O. 05%，4°C下2000r/min离心20min，除去未结合的胶体金颗粒，4°C下 15000r/min离心40min后弃去上清获得胶体金标记好的蛋白，用丙烯葡聚糖S-400层析柱分离纯化后4°C下短期保存。
2、试纸条各层材料准备
发明设计的试纸条基本结构为支撑层、加样层、检测层与吸收层。将各层按以下顺序粘贴将检测层粘贴在支撑层上；将过滤垫粘在释放垫上组成加样层，由释放垫连接在靠近检测层的检测线一端，边缘附在检测层上，定义为始端；把吸收层粘贴在检测层上靠近质控线的一侧，定义为末端。本发明中加样垫选择为中速定性滤纸(上海楚柏实验室设备有限公司)，NC膜为FF85 (美国Whatman)，Rapid27 (美国Whatman)作为释放垫的材料，吸收层选择吸附垫玻璃纤维CF4 (美国Whatman)材料。
3、表达蛋白与单克隆抗体浓度的选择
检测蛋白与质控蛋白的浓度选择将O. 01mol/L PB (含1%BSA)稀释1:200倍的金标蛋白进行检测蛋白与质控蛋白的包被浓度。选定S1蛋白三个包被浓度分别为O. 5、1. O和1.5mg/mL,选定单克隆抗体的三个包被浓度为O. 5、I和2mg/mL,通过交叉试验,结果显示 S1蛋白的包被浓度为lmg/ml、其单克隆抗体的包被浓度为lmg/ml时，在NC膜FF85上红色印记最明显；选定S蛋白AD位点的重组表达蛋白三个包被浓度分别为O. 5、1. O和1. 5mg/ mL,选定单克隆抗体的三个包被浓度为O. 5、I和2mg/mL,通过交叉试验,结果显示S蛋白 AD位点的重组表达蛋白的包被浓度为O. 5mg/ml、其单克隆抗体的包被浓度为lmg/ml时，在 NC膜FF85上红色印记最明显。
金标蛋白浓度的选择用O. 01mol/L PB (含1%BSA)稀释1:100、1:200、1:300和 I 400倍的两种金标蛋白分别按60 μ L/cm2的体积均匀喷于金标垫上，37°C下烘干Ih后，粘贴在各自标记好检测线和质控线的NC膜上，滴加100 μ L生理盐水在释放垫上比较各自质控线的显色深浅，结果显示
权利要求
1.ー种猪流行性腹泻病毒抗体与猪传染性胃肠炎病毒抗体胶体金快速检测试纸条，包括支撑层，以及在所述支撑层上依次设置的加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层，其特征在于，所述金标蛋白释放垫包埋有胶体金标记的两种表达蛋白，分别是猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白；所述检测层上设置有两条检测线和两条质控线，所述两条检测线依次固定所述的S1蛋白及所述的S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段，所述两条质控线依次固定有针对两个蛋白片段的单克隆抗体。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，支撑层选用聚こ烯纤维板；加样垫选用中速定性滤纸；释放垫选用玻璃纤维；检测层选用硝酸纤维素膜；吸收层选用玻璃纤维。
3.权利要求1或2所述的试纸条的制备方法，其包括如下步骤 1)在检测层的不同位置上分別固定猪流行性腹泻病毒S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段及其对应的单克隆抗体，分别形成两条检测线和质控线； 2)制备含有两种金标蛋白的释放垫； 3)组装支撑层、加样垫、金标蛋白释放垫、检测层和吸收层。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在干，制备金标蛋白释放垫包括如下步骤以1:100^3000的标记比例将待标记的猪流行性腹泻病毒S1蛋白或猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白片段加入到pH7. (TlO. 0胶体金溶液中，按1:10^500的比例用含0.r5%BSA的0. 00r0. lmol/L磷酸盐缓冲液稀释胶体金标记的S1蛋白或S蛋白的AD位点重组表达蛋白，将稀释后的胶体金标记蛋白液按60y L/cm2的速度喷于玻璃纤维素膜中，4°C低温真空干燥。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将包被浓度为0.r2mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白按I ii L/cm的速度喷于检测层上作为检测线I，将包被浓度为0. r2mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白按I U L/cm的速度喷于检测层上作为检测线2，将包被浓度为0. r5mg/mL的猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体按I U L/cm的速度喷于检测线下方的检测层上作为质控线1，将包被浓度为0. r5mg/mL的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白单克隆抗体按I U L/cm的速度喷于质控线I下方的检测层上作为质控线2，37°C下干燥30min，从而制备检测层。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在干，猪流行性腹泻病毒S1蛋白的包被浓度为0. 2^0. 8mg/mL,猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的AD位点重组表达蛋白的包被浓度为,0.2^0. 8mg/mL，两者单克隆抗体的包被浓度均为0. 5 2mg/mL。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测PEDV和TGEV血清抗体的试纸条及其制备方法。本发明试纸条的基本结构为支撑层、加样层、金标蛋白释放垫、检测层与吸收层；该试纸条的金标蛋白与检测线蛋白为通过原核高效表达系统获得的猪流行性腹泻病毒的S1蛋白与猪传染性胃肠炎病毒的包含S蛋白AD位点的重组蛋白，其两条质控线蛋白分别为针对两种蛋白的单克隆抗体。与传统的PEDV与TGEV抗体检测试纸条相比，本发明的试纸条特异性强，安全性高，操作简单，判定结果快捷。
文档编号G01N33/577GK103033626SQ201210577099
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者于倩倩, 王贵华, 于萍萍, 侯艳红, 陈翠云, 赵亚荣 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心, 北京大北农科技集团股份有限公司, 北京科牧丰生物制药有限公司, 福州大北农生物技术有限公司