专利名称：一种复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及复合纳米材料技术、纸芯片技术和肿瘤标志物检测技术领域，更具体地说是一种应用复合纳米材料借助于纸芯片来检测肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。
背景技术：
肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。肿瘤的发生是一个长期的、多阶段的、多基因改变累积过程，具有多因素调节和多基因控制的复杂性。肿瘤发病率和死亡率的上升趋势直接威胁着人类健康，它的早期诊断和治疗是肿瘤防治研究的重要前言领域之一。免疫分析法是利用抗体与抗原特异性结合而建立的高选择性生物化学方法。用免疫细胞化学方法来检测和定位肿瘤细胞所特有的肿瘤标记，已经越来越引起广大肿瘤病理学研究工作者的兴趣。现在有许多免疫组织化学方法可用于组织细胞的定性和定量分析以及成分检测。目前，主要的免疫分析方法有电化学免疫分析、化学发光免疫分析、流动注射化学发光免疫分析、高效液相色谱化学发光免疫分析、毛细管电泳化学发光免疫分析等，但是这些检测方法在某些方面还存在不足，因此急需一种新的灵敏的检测方法。为适应临床诊断和即时检测的要求，实验室芯片应运而生，实验室芯片的重要性和应用性已被广泛认知，现在的芯片研究主要集中于材料的易得、价廉、易于修饰、易于储存和运输，而纸芯片很好地体现了这些优势。有很多经济实用的构建纸芯片的方法已被应用，其中打印是最经济，并最容易进行大量生产的方式之一，而打印中最省时有效的构建纸传感器的则是蜡打印。纸芯片传感器可借助多种方法来检测，其中电化学发光免疫传感器之所以引起公众极大的兴趣是由于此法综合了电化学分析和化学发光的高选择性、高灵敏度、需样量少等优点。电化学发光涉及到的丝网印刷电极的生产及使用技术也已有报道。此夕卜，纸上电化学发光呈现出了较好的运行结果；纤维素纤维没有任何扩散阻碍，反而，黏贴在电极表面的浸透的芯片使检测更不易受震动和其它对流的影响。为了进一步提高纸上电化学发光方法的灵敏度，在这里我们采用了复合纳米材料来增大检测信号。我们熟知石墨烯导电性较好，经研究发现金属掺杂后的石墨烯导电性又得到了很大的提高，因此我们的设计是将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于工作电极上用来固定一抗可以更好的促进电子传递，从而增大电化学发光信号。另一方面，可以借助于多孔硅纳米材料的较大的比表面积和好的生物相容性，将CdTe量子点发光试剂接到多孔硅上得到量子点-多孔硅复合纳米材料，并将其标记在二抗上，这样可以实现发光信号的多倍放大效果。本文第一次在使用石墨烯-金属和量子点-多孔硅的基础上将纸芯片与电化学发光相结合。将蜡打印纸芯片与丝网印刷电极相结合，构建低成本、一次性使用的复合纳米材料电化学发光纸芯片传感器。此类传感器通过石墨烯-金属修饰的纸芯片来捕获抗体，量子点-多孔硅来标记二抗，石墨烯-金属用于加速电子转移速率，量子点-多孔硅用于放大信号，从而可以提高传感器的灵敏度。用几种抗原作为实例分析物，超灵敏免疫传感器展现了极好的分析性能。这种简单、经济、线性范围广、重现性好、灵敏度高的免疫传感器在临床检测不同的肿瘤标志物方面有很好的发展前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种应用复合纳米材料的诊断监测速度快、灵敏度高、特异性强、现场体外即时诊断监测的纸芯片免疫传感器的制备及检测方法，此方法可以在绝大多数实验室中轻易实现而不需要复杂繁琐的大型设备支持。本发明用石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料纸芯片免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤
(1)在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道；
(2)选择临床发病率较高的肿瘤标志物进行测定；
(3)利用纳米材料，制备出石墨烯-金属复合纳米材料；
(4)制备出量子点-多孔硅复合纳米材料，并用于标记二抗；
(5)将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高纸芯片的导电性，提高其灵敏度；
(6)在步骤(5)之后修饰用于捕捉抗体的硫堇；
(7)利用抗原-抗体特异性识别和组装表面修饰技术等，将量子点-多孔硅复合材料标记的二抗修饰到步骤(6)之后的纸芯片表面上，制作电化学发光传感器。(8)处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号；
(9 )丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用。本发明所述使用石墨烯-金属复合纳米材料可以为石墨烯-Cu、石墨烯-Co，石墨烯-Pt。本发明所述使用量子点-多孔硅纳米材料可以为CdTe量子点-多孔硅纳米材料。本发明所述肿瘤标志物为甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚铁蛋白、胰癌胚抗原、细胞角蛋白、鳞癌相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA 19-9, SCC、CA 15-3, CA 12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人绒毛膜促性腺激素(hCG )、」L茶酚胺类物质。
图1. a—微流控纸芯片免疫修饰过程的区域； b—对应a的一个工作电极；
c一银/氯化银参比电极； d—石墨对电极； e—聚酰胺纤维胶片；
图2.⑴一图1中的纸芯片的a区域；(2)—在a区域中先修饰石墨烯-金属后的示意 (3)—在步骤(2)后再修饰硫堇和戊二醛；
(4)一在步骤(3)后，捕获与抗原相应的抗体；
(5)—用牛血清白蛋白封闭可能结合抗原的位点；
(6)—抗体捕获相应的抗原；
(7)—用量子点-多孔硅标记的抗体与抗原结合。本发明所述肿瘤标志物为甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原、癌胚铁蛋白、胰癌胚抗原、细胞角蛋白、鳞癌相关抗原、前列腺特异性抗原(PSA)、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、 神经元特异性烯醇化酶(NSE)、CEA、CA 19-9, SCC、CA 15-3, CA 12-5, HCG、F-PSA, PAP、TMA、人绒毛膜促性腺激素(hCG )、」L茶酚胺类物质。一种快速检测肿瘤标志物的方法，其特征是包括如下步骤将按上述方法制得的应用复合纳米材料的纸芯片电化学发光免疫传感器配合电化学发光仪，对肿瘤标志物进行检测。实施例1 (胚胎抗原类，如甲胎蛋白，AFP)
一种应用复合纳米材料检测AFP的纸芯片电化学发光免疫传感器制备方法，包括以下步骤
(1)选择临床发病较高的AFP进行测定；
(2)制备电极检测装置设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域，
(3)石墨烯-Cu复合纳米材料制备'2mL氧化石墨烯溶解在100 mL水中超声Ih得到氧化石墨烯的水溶液，向溶液中加入溶解有2. 5 g CuSO4 ·5Η20和O. 8 g EDTA · 2Na -H2O的20 mL水溶液，超声10分钟。然后，2. 24 g KOH和O. 27 g KBH4的20 mL水溶液缓慢加入以上得到的溶液，该溶液搅拌30min反应后，再加入l.Og KBH4,然后，该混合液转移到圆底烧瓶中在红外灯照射下回流反应I h ；
(4)CdTe量子点溶液制备在N2保护下，将现制得NaHTe为Te前驱体，与CdCl2反应，巯基乙酸作为稳定剂的条件下，制得水溶性CdTe量子点溶液；
(5)氨基功能化的多孔硅纳米材料制备将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、NaOH和水的混合溶液加热到80°C，然后加入正硅酸乙酯(TE0S)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)搅拌反应得到多孔硅粗品，后热过滤，洗涤、干燥。然后产物加入到HCl-甲醇溶液反应来除去CTAB，后过滤、洗涤、干燥得到最终的多孔硅材料。(6)CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料制备在步骤(4)制备的CdTe量子点溶液中加入步骤(5)制备的氨基化多孔硅，和偶联活化剂乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应后离心洗涤得到最终产物。(7)将150微升石墨烯-Cu复合纳米材料滴加到工作电极对应的工作区域进行修饰，并进一步分别滴加50微升的硫堇和戊二醛对纸芯片进行修饰，为接抗原抗体做好准备。(8)将步骤(I)中选择的相应的5微升的一抗修饰到步骤(7)中处理好的纸芯片上，随后用30微升牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点，随后接相应的5微升的抗原，反应完全后，接CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料标记的10微升的二抗，每一步接抗原抗体的后面都用PH 7. 4的PBS缓冲溶液进行洗涤，以洗涤掉吸附性不稳固的抗原或者抗体，使检测更加灵敏、准确。(9)如图所示，将修饰有AFP的纸芯片免疫传感器置于底端的胶片电极上，将电极与电致化学发光仪相连接，检测时滴加一定的PH为7. 4的PBS缓冲溶液，此时用仪器记录下显示的发光信号，根据发光强度的大小准确诊断检测物质的量。实施例2 (糖类标志物，如CA19-9)
一种应用复合纳米材料检测CA19-9的纸芯片电化学发光免疫传感器制备方法，包括以下步骤
(1)选择临床发病较高的CA19-9进行测定；
(2)制备电极检测装置设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域，
(3)石墨烯-Co复合纳米材料制备0.2 g Co (NO3)2 · 6H20搅拌溶解在7mL水中，加入
O.005g石墨烯超声溶解，缓慢加入28mL 28-30%的氨水，超声10分钟后转移到高压釜中100°C下反应8h，冷却到室温后，沉积物离心洗涤后真空干燥，然后在623K，Ar气流条件下淬火Ih得到石墨烯-Co复合物；
(4)氨基功能化的多孔硅纳米材料制备将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、NaOH和水的混合溶液加热到80°C，然后加入正硅酸乙酯(TE0S)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)搅拌反应得到多孔硅粗品，后热过滤，洗涤、干燥。然后产物加入到HCl-甲醇溶液反应来除去CTAB，后过滤、洗涤、干燥得到最终的多孔硅材料。(5) CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料制备在CdTe量子点溶液中加入步骤(4)制备的氨基化多孔硅，和偶联活化剂乙基_( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应后离心洗涤得到最终产物。(6)将150微升石墨烯-Co复合纳米材料滴加到工作电极对应的工作区域进行修饰，并进一步分别滴加50微升的硫堇和戊二醛对纸芯片进行修饰，为接抗原抗体做好准备。(7)将步骤(I)中选择的相应的5微升的一抗修饰到步骤(6)中处理好的纸芯片上，随后用30微升牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点，随后接相应的5微升的抗原，反应完全后，接CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料标记的10微升的二抗，每一步接抗原抗体的后面都用PH 7. 4的PBS缓冲溶液进行洗涤，以洗涤掉吸附性不稳固的抗原或者抗体，使检测更加灵敏、准确。(8)如图所示，将修饰有AFP的纸芯片免疫传感器置于底端的胶片电极上，将电极与致化学发光仪相连接，检测时滴加一定的pH为7. 4的PBS缓冲溶液，此时用仪器记录下显示的发光信号，根据发光强度的大小准确诊断检测物质的量。实施例3 (激素类，如人绒毛膜促性腺激素，HCG)
一种应用复合纳米材料检测细胞角蛋白的纸芯片电化学发光免疫传感器制备方法，包括以下步骤
(I)选择临床发病较高的HCG进行测定； (2)制备电极检测装置设计双电极丝网印刷模板，用丝网印刷机或手工印刷石墨电极和银氯化银电极，并打磨光滑备用。设计与胶片电极模型对应的纸芯片，用蜡印机打印出设计的图案，并烘烤至蜡渗透纸芯片，制备吸水的工作区域，
(3)石墨烯-Pt复合纳米材料制备0.4g氧化石墨烯超声溶解在50mL水中，然后加入氯钼酸搅拌反应2小时，产物在60°C下干燥，取O. 2g产物分散在玻璃培养皿中，置于太阳光下，并用一个凸面镜来聚焦太阳光照射产物促进其还原反应；
(4)氨基功能化的多孔硅纳米材料制备将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、NaOH和水的混合溶液加热到80°C，然后加入正硅酸乙酯(TE0S)、氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)搅拌反应得到多孔硅粗品，后热过滤，洗涤、干燥。然后产物加入到HCl-甲醇溶液反应来除去CTAB，后过滤、洗涤、干燥得到最终的多孔硅材料。(5) CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料制备在CdTe量子点溶液中加入步骤(4)制备的氨基化多孔硅，和偶联活化剂乙基_( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，搅拌反应后离心洗涤得到最终产物。(6)将150微升石墨烯-Co复合纳米材料滴加到工作电极对应的工作区域进行修饰，并进一步分别滴加50微升的硫堇和戊二醛对纸芯片进行修饰，为接抗原抗体做好准备。(7)将步骤(I)中选择的相应的5微升的一抗修饰到步骤(6)中处理好的纸芯片上，随后用30微升牛血清白蛋白封闭可能存在的活性位点，随后接相应的5微升的抗原，反应完全后，接CdTe量子点-多孔硅复合纳米材料标记的10微升的二抗，每一步接抗原抗体的后面都用PH 7. 4的PBS缓冲溶液进行洗涤，以洗涤掉吸附性不稳固的抗原或者抗体，使检测更加灵敏、准确。(8)如图所示，将修饰有HCG的纸芯片免疫传感器置于底端的胶片电极上，将电极与电化学发光仪相连接，检测时滴加一定的pH为7. 4的PBS缓冲溶液，此时用仪器记录下显示的发光信号，根据发光强度的大小准确诊断检测物质的量。
具体实施例方式(I)手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用；
(2)使用蜡打印机打印如图1-A所示图案，并使用电子控温仪器对印蜡的色谱纸进行加热，使蜡均匀的渗透到色谱纸内部，未印蜡的区域形成纸芯片通道；
(3)制备出石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料；
(4)将100-200微升石墨烯-金属溶液滴到图1所示的a区域即通道区域；
(5)待石墨烯-金属溶液在纸上完全干燥后，在a区域滴加10-100微升的硫堇溶液；
(6)待硫堇溶液在纸上与碳纳米管结合完全，并稳定吸附于纸上后，a区域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥；
(7)用超纯水冲洗三次，冲洗方法为正面滴加缓冲溶液,在反面用吸水纸引水；
(8)水干透后，在a区域滴加1-10微升的一抗；
(9)重复步骤(7)，洗去未吸附或吸附不牢固的抗体 (10)待一抗溶液在a区域吸附稳固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液，以封闭可能得活性位点；
(11)重复步骤(7)；
(12)在a区域滴加与步骤(8)中分别相对应的1-10微升的抗原，使其反应完全；
(13)在反应完全后，立即重复步骤(7)；
(14)缓冲溶液洗脱后即可在a区域滴加相对应的5-20微升的量子点-多孔硅标记的二抗，使其充分反应；
(15)之后立即重复步骤(7)；
(16)在完成最后一步洗涤后，将纸芯片通道放置于制备好的胶片电极上，并滴加pH
7.4的缓冲溶液，再结合电致化学发光仪进行测定。至此即可准确测定样品中抗原的浓度。本发明简便、经济、是用，有很好的发展前景。本发明所述使用墨烯-金属复合纳米材料可以为石墨烯-Cu、石墨烯-Co，石墨烯-Pt。本发明所述使用量子点-多孔硅纳米材料为CdTe量子点-多孔硅纳米材料。本发明的有益效果1.本发明底端的胶片电极可以设计为2-8电极体系，这样对应的纸芯片亦需要设计为对应电极数的工作区域，利用不同界面的抗原抗体的特异性结合，识别肿瘤细胞，即可进行同时检测；这样修饰的样品可以同时对血液样品进行识别，相应的抗原抗体结合，使诊断检测步骤更加简单，更易于非专业人士操作；该传感器底端的胶片电极可以多次反复使用，大大降低了诊断监测成本。1.本发明借助于纸芯片技术可以实现样本中多种疾病抗原的高特异性、高灵敏度、同时快速诊断监测。2.将金属接到石墨烯上后可以更有利于电子传递，从而增强电化学发光信号，将石墨烯-金属复合纳米材料修饰到纸芯片上制备电化学发光免疫传感器，使得所制备的夹心式肿瘤标志物电化学发光免疫传感器具有更高的灵敏性和和检测范围。3.将很多量子点接到多孔硅上后可以有效增大发光信号，量子点-多孔硅复合纳米材料作为发光材料标记在信号抗体上，提高了电化学发光免疫传感器的灵敏度和选择性。4.本发明的现场快速体外即时诊断监测纸芯片电致化学发光免疫传感器检测肿瘤标志物的方法，灵敏度高、重现性好、电极寿命长、抗干扰能力强，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性，便于现场检测。5.本发明应用复合纳米材料的纸芯片电化学发光免疫传感器的特异性强，由于将抗原识别抗体修饰到电极上，并对抗原进行特异性识别，然后，发光材料标记的信号抗体对抗原特异性识别，样品中其它非特异性分子对检测结果无影响；灵敏度高，可以达到ng级；试剂用量少，检测一个样品只需要几十微升试剂；成本低。并且，诊断监测速度快，完成一个基本诊断监测过程仅需1-2分钟的时间，可在短时间内实现大量样本的高通量筛选，成本低。
权利要求
1.本发明用石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料纸芯片电化学发光免疫传感器的制造方法，其特征包括以下步骤 (1)在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热，目的是将蜡烤化并使其均匀的渗透到色谱纸的内部，从而在未印蜡的部位形成亲水通道； (2)选择临床发病率较高的肿瘤标志物进行测定； (3)利用纳米材料，制备出石墨烯-金属复合纳米材料； (4)制备出量子点-多孔硅复合纳米材料，并用于标记二抗； (5)将石墨烯-金属复合纳米材料修饰于处理后的纸芯片通道上，用以提高纸芯片的导电性，提高其灵敏度； (6)在步骤(5)之后修饰用于捕捉抗体的硫堇； (7)利用抗原-抗体特异性识别和组装表面修饰技术等，将量子点-多孔硅复合材料标记的二抗修饰到步骤(6)之后的纸芯片表面上，制作电化学发光传感器； (8)处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号； (9 )丝网印刷电极在使用前需要用抛光粉打磨光滑，备用； 本发明所述使用石墨烯-金属复合纳米材料可以为石墨烯-Cu、石墨烯-Co，石墨烯-Pt，本发明所述使用量子点-多孔硅纳米材料可以为CdTe量子点-多孔硅纳米材料，具体实施步骤包括 (1)手动印刷本实验所用胶片电极，并用三氧化二铝抛光粉将电极打磨光滑，备用； (2)使用蜡打印机打印如图1-A所示图案，并使用电子控温仪器对印蜡的色谱纸进行加热，使蜡均匀的渗透到色谱纸内部，未印蜡的区域形成纸芯片通道； (3)制备出石墨烯-金属和量子点-多孔硅复合纳米材料； (4)将100-200微升石墨烯-金属溶液滴到图1所示的a区域即通道区域； (5)待石墨烯-金属溶液在纸上完全干燥后，在a区域滴加10-100微升的硫堇溶液； (6)待硫堇溶液在纸上与碳纳米管结合完全，并稳定吸附于纸上后，a区域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥； (7)用超纯水冲洗三次，冲洗方法为正面滴加缓冲溶液,在反面用吸水纸引水； (8)水干透后，在a区域滴加1-10微升的一抗； (9)重复步骤(7)，洗去未吸附或吸附不牢固的抗体 (10)待一抗溶液在a区域吸附稳固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液，以封闭可能得活性位点； (11)重复步骤(7)； (12)在a区域滴加与步骤(8)中分别相对应的1-10微升的抗原，使其反应完全； (13)在反应完全后，立即重复步骤(7)； (14)缓冲溶液洗脱后即可在a区域滴加相对应的5-20微升的量子点-多孔硅标记的二抗，使其充分反应； (15)之后立即重复步骤(7)； (16)在完成最后一步洗涤后，将纸芯片通道放置于制备好的胶片电极上，并滴加pH·7.4的缓冲溶液，再结合电化学发光仪进行测定，至此即可准确测定样品中抗原的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种复合纳米材料检测肿瘤标志物的纸芯片电化学发光免疫传感器的研究及应用的方法。纸芯片和传感器制备方法(示意图见附图),主要包括以下步骤在色谱纸上用蜡打印机打印设计的通道图案，用电子控温仪器对蜡印的色谱纸进行加热；制备出石墨烯-金属复合纳米材料和量子点-多孔硅纳米材料；将纳米材料修饰到纸芯片，将抗体接到纳米材料修饰的纸芯片上；与抗原特异识别后，发光材料标记的抗体与抗原特异识别，制作电化学发光免疫传感器；处理好的纸芯片需要与丝网印刷电极相结合检测电化学发光信号。本发明检测特异性强，灵敏度高，可以达到ng级；诊断监测速度快，完成一个基本检测过程所需时间较短；该传感器底端的胶片电极可以多次反复使用，成本低。
文档编号G01N33/574GK103018231SQ20121057709
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者于京华, 刘芳, 葛慎光, 颜梅, 葛磊, 黄家栋, 楚成超, 李蒙, 李龙, 刘伟艳, 王衍虎, 张彦, 王盼盼, 李伟平 申请人:济南大学