专利名称：超低温快速冷冻设备的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及电镜技术和超低温快速冷冻技术领域，该技术主要用于生物组织ー细胞超微结构形态学、功能学、神经生物学、生理学等基础医学研究領域，具体涉及ー种配合电镜样品制备的超低温快速冷冻设备。
背景技术：
在生物医学形态分析领域，需要在电镜下观察生物组织在外界刺激作用下的生理超微结构结构变化。这就需要使该生物组织在外界刺激的同时被毫秒级固定，目前能够以毫秒级固定生物组织的技术为超低温快速冷冻技木。生理功能变化所需的刺激及反应均为毫秒级单位，如神经冲动传导、肌组织兴奋收缩偶联等。因此，毫秒级水平的电刺激与冷冻固定同步技术是研究瞬时生理功能变化时，结构变化的所需条件。
目前电镜的生物样品固定多为化学固定，化学固定常使生物组织、细胞结构皱縮、肿胀或自溶，造成形态结构分析的误差。冷冻固定完全是个物理过程，能够显著地提高某些软生物组织的机械强度。是目前最接近活体状态下保存生物组织结构及内部元素的唯一方法。虽然冷冻固定能够瞬时(以毫秒计)冻结生态状态，包括组织形态结构及细胞内元素(特别是可溶性离子)，避免生物组织、细胞结构及内部化学成分及位点的改变，但目前的冷冻固定技术还不能与电刺激生物组织同步进行。目前尚无任何有关采用电刺激一超低温快速冷冻技术可以保持生物组织生理反应时的各种状态和生理特征的文献报道。虽然光学显微镜己能做到实时获取生物组织功能变化时的形态结构像，但由于光镜的分辨率及放大倍率的限制，使光镜的研究水平难以满足探索超微结构领域的需要。而电镜虽能以超微结构的水平研究生物组织的形态，但不能获得生物组织瞬时生理功能变化时的超微结构形态像，限制了电镜技术在生物医学领域的发展。因此，如何与生物组织瞬时生理功能变化同步，获取生理功能变化时的(即实吋)生物组织超微结构形态像，使生理功能与形态学研究能在毫秒级的水平上同步进行，将对电子显微镜学、细胞超微结构形态学、生理学及病理学等学科的发展有重要意义。而解决了生物组织在毫秒级功能变化时，实时获得其超微结构形态像及离子浓度、位点变化的问题，将能获得生物组织生理功能变化吋，更真实、更多的超微结构信息，从而为基础医学研究、临床科研及诊断提供一个崭新的技术方法。
实用新型内容本实用新型的目的在于提供一种为了使生物组织在受到刺激的瞬间即被超低温快速冷冻固定，便于研究该生物组织各种特定状态下生理功能变化时的超微结构形态变化的专用设备。本实用新型提供了ー种超低温快速冷冻设备，可以使生物组织在受到刺激后的毫秒级时间内被快速冷冻。[0008]本实用新型提供ー种超低温快速冷冻设备，包括样品台、垂直滑板、超低温冷冻室、红外传感器A、红外传感器B、计时器、程控刺激器和计算机，其中垂直滑板安装于超低温冷冻室上，垂直滑板上安装有样品台、样品台上安装有刺激电极；垂直滑板上下两端各装有ー个红外传感器，其中红外传感器A安装于样品台上端,红外传感器B安装于垂直滑板下端与超低温冷冻仪冷冻室入口处等高，红外传感器A、B分别与计时器连接，计时器与计算机连接，计算机控制程控刺激器，程控刺激器与刺激电极相连。所述的垂直滑板上安装有样品台，样品台在弹射按钮的控制下可以沿垂直方向往下迅速滑动，样品台用于放置样品，特别是生物组织样品如心肌肌丝、骨骼肌肌丝、神经、心肌细胞、骨骼肌细胞等，样品台选用铜质材料制成。所述的样品台沿垂直滑板向下迅速滑动，是受安装在垂直滑板上的弹射按钮控制。样品台可在弹射按钮的弹力作用下迅速向下弹射，使样品台上的样品快速进入超低温冷冻室。超低温冷冻室最上端有一冷冻室入口，供样品台上的样品进入。 所述的程控刺激器通过刺激输出导线至刺激电极，可以在样品台下滑的过程中对样品进行电刺激。所述的红外传感器A和B输出的信号控制计时器确定整个样品台运行的时程。原理如下样品台后部有起遮光作用的遮光片，样品台未向下弹射时遮光片挡住传感器A，使其输出高电平。开始弹射时，遮光片离开传感器A,因光电管受到光照,输出ー低电平信号，打开门控电路，标准时钟信号(O. ImS脉冲)进入计时器，开始计算时间。当遮光片运行至传感器B时，遮光片使传感器B的光电管得不到光照而输出高电平，关闭门控电路，切断时钟信号，而终止计时。同时，所述的红外传感器A，输出的信号同步程控刺激器，使其在样品台下降的适当时间对生物组织进行刺激。所述的超低温冷冻室购自澳大利亚Rechart公司KF80型。所述的计时器用于计算样品台从红外传感器A到红外传感器B所需要的时间。所述的程控刺激器，通过键盘可以提前设定程控刺激器的延时、方波个数、波宽、间隔和幅度等參数。当收到红外传感器A的触发信号后，立即启动刺激其对生物体进行刺激。所述的计算机，还可连接显示器，用于屏幕作图，显示实验结果；所述的计算机还可存储实验结果以备日后查用；所述的计算机还可接输出设备打印实验結果。本实用新型的使用方法，包括以下步骤A.将需要超低温快速冷冻的样品固定于样品台上，样品台上安装有刺激电极经刺激输出线与程控刺激器相连接；B.按动弹射按钮，使样品台快速射向冷冻室入ロ，并进入冷冻室；在按动弹射按钮同时，样品台离开红外传感器A，红外传感器A输出的信号作为整个下降时间的起始点，触发计时器进行计时；当样品进入超低温冷冻室吋，红外传感器B输出的信号使计时器終止计时。样品台在红外传感器A、红外传感器B之间运行的时间(即计时器所计时)为总弹射时间T ；C.在按动弹射按钮的同时，红外传感器A也产生开始信号同步触发计算机使程控刺激器开始工作，经适当的延时时间t后，输出给定波宽、频率和幅度的电刺激信号，刺激样品(刺激參数可在计算机上进行预设置)。该过程完全在样品台弹射的动态过程中进行。D.电刺激信号产生后的时程为S，它与弹射时间T、延时时间t的关系为S = T-t。S也是生物组织被电刺激后至被固定的时间(生物组织被固定，生理功能即停止)，代表了生物组织被电刺激后，其生理功能变化的时间，设置不同的延时时间t，就可以得到电刺激后不同时间内的生理功能变化。程控电刺激器输出的各刺激參数如延时、单/复、频率、波宽以及幅度均可通过计算机进行预置。本实用新型的有益效果在于解决与生物组织瞬时生理功能变化同歩，实时获得其超微结构形态像及离子浓度、位点变化的问题，将能获得生物组织生理功能变化时，更真实、更多的超微结构信息，使生理功能与形态学研究能在毫秒级的水平上同步进行，将对电子显微镜学、细胞超微结构形态学、生理学及病理学等学科的发展有重要意义。并为基础医 学研究、临床科研及诊断提供一个崭新的研究方法，将在生物医学的基础研究、临床病变的机理研究等许多领域带来突破性进展。本实用新型解决了对生物样品毫秒级电刺激与冷冻固定同步的技术，是目前世界上唯一的同类技术与仪器。本实用新型取得的有益效果可參见本发明人等前期发表的文献I.杨勇骥，邢萱，汤莹，邵晓良，江键，叶煦亭，沈亚峰“肌兴奋收缩偶联时肌浆网的超微结构研究·”《电子显微学报》2006，Vol. 25，p217-218。2.杨勇骥，宋田斌，汤莹，吴越，叶煦亭，沙继宏等“骨骼肌收缩潜伏期内肌浆网结构的毫秒级变化变化研究· ”《电子显微学报》2002，Vol.21，No.5，p485-486。3.杨勇骥，孔令山，汤莹，宋田斌，苏金莲，吴越等“骨骼肌兴奋收缩偶联时肌浆网内Ca2 +释放的形态一功能变化研究.”《电子显微学报》2001，Vol. 20，No. 3，pl92_198)。
图I为本实用新型装置的结构示意图；图2为本实用新型工作原理图；图3为样品台弹射时程与刺激时间关系；其中I.样品台固定杆；2.样品台固定螺丝；3.样品台；4.样品；5垂直滑板；6.冷冻室入口 ；7.超低温冷冻室；8.弹射按钮；9.红外传感器A ；10.红外传感器B ；11.计时器；12.显示器；13.刺激输出导线；14.程控刺激器；15.计算机。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本实用新型作进ー步描述，但本实用新型的实施并不仅限于此。实施例I :ー种超低温快速冷冻设备，參看图1，包括样品台3、垂直滑板5、超低温冷冻室7、红外传感器A9、红外传感器B10、计时器11、程控刺激器14和计算机15，其中垂直滑板安装于超低温冷冻室上，垂直滑板上安装有样品台，样品台用样品台固定杆I和样品台固定螺丝2固定，样品台上安装有刺激电极；垂直滑板上下两端各装有ー个红外传感器，其中红外传感器A安装于垂直滑板上端，红外传感器B安装于垂直滑板下端(即与冷冻室入ロ 6等高)，红外传感器A、B分别与计时器连接，计时器与计算机连接，计算机控制程控刺激器，程控刺激器14通过刺激输出导线13至刺激电极。如图2所示，红外门控电路的输入端接标准时钟信号，输出端与计数器相连接，该门控电路受传感器A和B的控制，当标本台离开传感器A时此门打开，允许计数器计数，当标本台下滑至传感器B时关闭此门，计数结束。计数结果(时间)被送给计算机15作图，图可在显示器12上显示。实施例2 小鼠心肌的电刺激-超低温快速冷冻。小鼠心脏取出后，采用玻璃分针将其分离成肌丝，然后A.将小鼠心肌肌丝固定于样品台3上，并用刺激电极插入小鼠心肌肌丝两端，刺 激电极经刺激输出导线13与程控刺激器14相连接；B.按动弹射按钮8，使样品台快速射向冷冻室入口 6，并进入超低温冷冻室；在按动弹射按钮同时，样品台离开红外传感器A9，红外传感器A输出的信号作为整个下降时间的起始点，触发计时器进行计时；当样品进入超低温冷冻室时，红外传感器BlO输出的信号使计时器終止计时，样品台在红外传感器A、红外传感器B之间运行的时间(即计时器所计时)为总弹射时间T ；C.在按动弹射按钮的同时，红外传感器A也产生开始信号同步触发计算机使程控刺激器开始工作，经适当的延时时间(可用计算机程序设置)后，输出给定波宽、频率和幅度的电刺激信号，刺激样品。该过程完全在样品台弹射的动态过程中进行。电刺激信号后的时程为S，它与弹射时间T、延时时间t的关系为S = T-t (如图3所示)。本实施例中弹射时间T=12mS。程控电刺激器输出的各刺激參数刺激延时t=5mS、单/复=复、频率=30Hz、波宽=0. 3mS、幅度=1. 8V，均通过计算机在实验前预置。D.电刺激信号后的时程为S=T-t=12mS-5mS=7mS，也就是说生物组织被电刺激7mS以后即被冷冻固定，生物组织的生理功能变化停止。实施例3:蛙骨骼肌的电刺激-超低温快速冷冻。从蛙大腿处分离得到骨骼肌肌束，然后A.将蛙骨骼肌肌束固定于样品台上，并用刺激电极插入蛙骨骼肌肌束两端，刺激电极经刺激输出线与程控刺激器相连接；B.同实施例2的步骤B ；C.同实施例2的步骤C本实施例中弹射时间T=12mS。程控电刺激器输出的各刺激參数延时=10mS、单/复=复、频率=50Hz、波宽=0. 2mS、幅度=3. 5V，均通过计算机在实验前预置。D.电刺激信号后的时程为S=T-t=12mS-10mS=2mS，也就是说生物组织被电刺激2mS以后即被冷冻固定，生物组织的生理功能变化停止。以上显示和描述了本实用新型的基本原理、主要特征和本实用新型的优点。本行业的技术人员应该了解，本实用新型不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本实用新型的原理，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下本实用新型还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本实用新型范围内。本实用新型要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
权利要求1.一种超低温快速冷冻设备，其特征在于，该装置包括样品台(3)、垂直滑板(5)、超低温冷冻室(7)、红外传感器A (9)、红外传感器B (10)、计时器(11)、程控刺激器(14)和计算机(15)，其中的垂直滑板安装于超低温冷冻室上，垂直滑板上安装有样品台、样品台上安装有刺激电极；垂直滑板上下两端各装有一个红外传感器，其中红外传感器A安装于样品台上端，红外传感器B安装于垂直滑板下端与超低温冷冻室的冷冻室入口(6)等高，红外传感器A、红外传感器B分别与计时器连接；计时器与计算机连接；计算机控制程控刺激器，程控刺激器与刺激电极相连。
2.根据权利要求I所述的超低温快速冷冻设备，其特征在于，其中的样品台(3)，在安装在垂直滑板(5)上的弹射按钮(8)的控制下，沿垂直滑板往下迅速滑动。
3.根据权利要求I或2所述的超低温快速冷冻设备，其特征在于，程控刺激器(14)通过刺激输出导线(13)至刺激电极。
4.根据权利要求I或2所述的超低温快速冷冻设备，其特征在于，所述的红外传感器A(9)和红外传感器B (10)输出的信号控制计时器(11)。
5.根据权利要求4所述的超低温快速冷冻设备，其特征在于，所述的红外传感器A(9)输出的信号同步程控刺激器(14 )。
6.根据权利要求I或2所述的超低温快速冷冻设备，其特征在于，所述的计算机(15)，还连接显示器(12)。
专利摘要本实用新型涉及超低温快速冷冻技术领域，目的在于使生物组织在受到刺激的瞬间即被超低温快速冷冻固定，便于研究该生物组织各种特定状态下生理功能变化时的超微结构形态变化。本实用新型提供了一种超低温快速冷冻设备，包括样品台(3)、垂直滑板(5)、超低温冷冻室(7)、红外传感器A(9)、红外传感器B(10)、计时器(11)、程控刺激器(14)和计算机(15)等。本实用新型解决与生物组织瞬时生理功能变化同步，实时获得其超微结构形态像及离子浓度、位点变化的问题，将能获得生物组织生理功能变化时，更真实、更多的超微结构信息，使生理功能与形态学研究能在毫秒级的水平上同步进行。
文档编号G01N1/28GK202614579SQ20122023010
公开日2012年12月19日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者杨勇骥, 夏金辉, 汤莹, 雷长海 申请人:中国人民解放军第二军医大学