专利名称：一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法。
背景技术：
氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)是20世纪80年代之后研制并得到广泛应用的一类人工合成抗生素，它们是在第一代萘啶酸和第二代吡哌酸的基础上，在喹诺酮萘啶环的6号位引入氟原子，7号位上连接哌嗪环而开发出的第三代喹诺酮药物，具有良好的组织渗透性。氟喹诺酮类药物的作用机理是抑制细菌的DNA旋转酶，使酶不能在DNA双链上引入切口，破坏细菌的代谢和繁殖，达到迅速杀灭细菌的目的，其对革兰氏阳性和阴性杆菌、葡萄球菌和肺炎球菌均有很强的抗菌活性。最初这类药物用于治疗尿道感染，后来发展到治疗系统感染性疾病，主要用于泌尿系统感染、皮肤感染、呼吸道感染、消化道炎症、伤寒和败血症等疾病的治疗。由于它们具有吸收好、半衰期长、抗菌谱广、抗菌活性强、低毒高效、安全价廉，多数品种可以口服等许多优点，因此在临床中得到了广泛应用，并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用，有时还作为饲料添加剂促进动物生长，提高生长速度与产量。氟喹诺酮类药物在兽医临床上长期和大量使用，必然会导致其在动物性食品中的残留，从而给食品卫生及人类健康带来潜在的危害。研究表明:长期使用氟喹诺酮类抗生素易导致动物群体体内致病菌产生耐药性，并且这种耐药性可能由动物微生物向人类病原菌传播；而且该类药物在动物体内代谢缓慢，人体摄入后，会对中枢神经系统及关节部位造成不良反应，严重时，可引起食用者产生远期毒性及潜在的致癌、致畸、致突变效应。因此，氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的广泛关注。我国以及世界卫生组织、欧盟、美国、日本等国家和组织都将氟喹诺酮类药物列入限制使用的兽药药物清单中，并制订出相应的最高残留限量(maximum residue limit, MRL)和休药期,而且加大了其残留监管力度。欧盟规定:动物肌肉、肝脏和肾脏中二氟沙星、恩诺沙星(恩诺沙星+环丙沙星)、沙拉沙星等氟喹诺酮类兽药最高残留量为0.0Γ1.9 mg/kg ;美国和加拿大规定:氟喹诺酮为养蜂业禁用药物，蜂王浆中各种氟喹诺酮类药物MRL为5 μ g/kg ;日本2006年5月29日开始实施“肯定列表制度”后，除有暂定标准的药物如恩诺沙星、噁喹酸等外，其余FQs均按10 yg/kg的“一律标准”；我国规定FQs在牛奶中的MRL分别为:恩诺沙星(恩诺沙星+环丙沙星)为100 yg/L,达氟沙星为30 yg/L,氟甲喹为50 μ g/L。国内外用于FQs药物残留检测的方法较多，主要包括高效液相法(HPLC)以及与此相关的 HPLC-UV、HPLC-FD, HPLC-DVD, LC-MS/MS，LC-ES1-MS/MS，另外还有荧光光谱法、高效毛细管电泳法、薄层色谱法、ELISA、胶体金试纸、微生物学方法和电解分析法等。理化分析方法灵敏度高，但需要昂贵的仪器设备，繁琐复杂的操作程序，相对费时且检测费用较高，不适合批量样品的筛选。ELISA方法灵敏度高，特异性强，测定方法简单快速，可同时筛选大量样品。胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染、无需培训，非常适合于现场检测，与ELISA相比，具有样品前处理简单，显色时间短(3-5 min)，且所有试剂包含在一根试纸条上，无需仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。目前，市场上销售的试纸卡多用来检测某一具体的药物，尚末见到能够同时检测多种FQs兽药残留的试纸卡。因此，研制快速、灵敏、高效的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种操作简便、快速准确、灵敏度高、成本低廉、稳定性好且可进行批量检测的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，该试纸卡能够同时检测环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、依诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星等9种氟喹诺酮类药物残留。本发明解决的另一个技术问题是提供了一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法。本发明的技术方案是:一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体。本发明所述的支撑层为PVC板。本发明所述的吸收垫是以植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫是由玻璃纤维棉制作而成的。本发明所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2 _，吸收垫与硝酸纤维素膜的叠压宽度为2 mm。本发明所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。本发明所述的硝酸纤维素膜两端分界处有标记线。本发明所述的氟喹诺酮类药物为环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、依诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星中的至少一种。本发明所述的胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体是由环丙沙星一牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来的。一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于:首先将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按照由左到右的顺序附着于支撑层上，所述的硝酸纤维素膜上有诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，然后用切割机制成试纸条，然后将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的塑料盒体内，这样就制得了氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡。本发明所述的样品垫的制备方法为:将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN3的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫。本发明所述的金标抗体结合垫的制备方法为:将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条，放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN3的PBS缓冲液中20 min, 37 1:恒温烘干，然后将金标抗体灌注于已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫。本发明所述的硝酸纤维素膜的制备方法为:将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30 min, 37 °C烘干后，加入干燥剂，4 °C密封保存。本发明所述的诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为:将36 mg诺氟沙星溶解于2 mL DMF和2 mL 二氧六环中，4 °C预冷30 min，加入20 μ L三丁胺，冰浴10 min后加入40 μ L氯甲酸异丁酯,反应60 min,即A液,将40 mg鸡卵清白蛋白溶解于5 mL pH为9.6的Na2CO3的缓冲溶液，即B液，将A液逐滴加入到B液中，避光振荡反应4 h，反应完成后先用蒸馏水透析3 d，再用PBS缓冲液透析3 d，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时分装于安瓿瓶中，一 20 °C冻干保存。本发明所述的吸收垫的制备方法为:将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用，即为吸收垫。本发明的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡具有如下优点:
(1)广谱特异性，能检测9种FQs兽药残留。氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡以胶体金标记高亲和力的抗FQs类特异性单克隆抗体制备而成,金标抗体中金颗粒与抗体分子通过异性电荷间范德华力相结合，胶体金对单克隆抗体的特异性和亲和力影响很小。因此，快速检测试纸卡能识别多种FQs兽药残留，其在PBS缓冲液中的灵敏度分别为:环丙沙星(5ng/mL)、诺氟沙星(5 ng/mL)、恩诺沙星(5 ng/mL)、培氟沙星(6 ng/mL)、依诺沙星(6 ng/mL)、沙拉沙星(8 ng/mL)、氧氟沙星(8 ng/mL)、洛美沙星(10 ng/mL)和麻保沙星(10 ng/mL)；
(2)操作简单、方便快捷。使用快速检测试纸卡时无需其它任何试剂，只要将处理后的样品溶液用滴管滴入试纸卡加样孔内3 4滴，3飞min即可观察结果；
(3)检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“I ”或“ Il ”作为检测线的阳性和阴性标记，即在硝酸纤维素膜上质控线(C线)显示一条红色“ I ”印迹时，表示被检测样品溶液呈阳性；若硝酸纤维素膜上质控线(C线)和检测线(T线)同时出现两条红色“ Il ”印迹时，表示样品溶液呈阴性。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判；
(4)胶膜的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与偶联垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合；
(5)成本低、投资少。使用本发明试纸卡，不需要另配复杂的仪器设备和昂贵的试剂，现场检测一步到位，成本低廉，见效快；
(6)易于大范围推广应用。本试纸卡操作简单，适合不同类别的人员使用，如实验室检测、海关检疫、卫生监督、规模养殖及个体生产等，具有广阔的市场前景和较大的经济效益和社会效益。
图1为本发明的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的结构示意图；图2为本发明的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡中试纸条的侧视图；图3为本发明的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡中试纸条的俯视图。图面说明:1、塑料盒体、2、试纸条、3、支撑层、4、样品垫、5、金标抗体结合垫、6、硝酸纤维素膜(NC膜)、7、吸收垫、8、加样孔、9、观察窗、10、质控线(C线)、11、检测线(T线)、12、胶膜、13、标记线。
具体实施例方式结合附图详细描述实施例。一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体I和封装于塑料盒体I内的试纸条2，所述的试纸条2的底层为支撑层3，该支撑层3上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫4、金标抗体结合垫5、硝酸纤维素膜6和吸收垫7，所述的塑料盒体I上开有加样孔8和观察窗9，该加样孔8的位置与试纸条2上的样品垫4位置相对应，观察窗9与试纸条2上的硝酸纤维素膜6位置相对应，所述的硝酸纤维素膜6上有诺氟沙星一鸡卵清白蛋白(NOR - 0VA)偶联物溶液印制的检测线(T线)11和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线(C线)10，两者间距5 mm，其中诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线(T线)11位于靠近样品垫4的一侧，所述的结合垫5上灌注有胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体。本发明所述的支撑层3是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。本发明所述的吸收垫7是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5是由玻璃纤维棉制作而成的。本发明所述的样品垫4和金标抗体结合垫5的叠压宽度为2 mm,吸收垫7与硝酸纤维素膜6的叠压宽度为2 _。本发明所述的样品垫4、金标抗体结合垫5和吸收垫7上方覆盖有胶膜保护层12。本发明所述的硝酸纤维素膜6两端分界处有标记线13。一、本发明氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法:
1、所述的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体由环丙沙星一牛血清白蛋白(CIP —BSA)偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来，由以下步骤实现:
(I)载体蛋白的活化:将200 mg BSA、11.2 mg EDC溶于4 mL PBS缓冲液中，搅拌条件下，缓慢加入6 mg乙二胺(溶于4 mL PBS), 37 1:振荡反应2 h。反应液用PBS透析3 d，活化的载体蛋白BSA冻干保存。(2)环丙沙星衍生化:称取环丙沙星38.6 mg (约0.1 mmoL), NHS 12 mg (约0.1mmoL)和EDC 19.2 mg (约0.1 mmoL)溶于2 mL的DMF，室温下避光搅拌12 h。反应产物于8000 r/min离心10 min,取上清称为A液。氨基丁酸10 mg (约0.1 mmoL)溶于2 mL PBS中，即B液。搅拌状态下将B液缓慢滴入A液中，反应4 h，然后8000 r/min离心10 min,取上清液用饱和NaHCO3调至偏碱性，弃沉淀。上清液再用稀盐酸(0.1 mol/L)调至偏酸性，收集沉淀，即为环丙沙星半抗原衍生物。(3)免疫原的合成:采用优化的EDC两步法合成CIP-BSA免疫原。将35 mg衍生化的CIP用3 mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解后，加入12 mg NHS和38 mg EDC, 37 V条件下避光反应24 h。离心后取上清液逐滴加入到4 mL含60 mg活化BSA的PBS缓冲液中，37 °C条件下避光振荡反应4 h。反应完成后先用蒸馏水透析3 d，再用PBS透析3 d，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时，将免疫原分装于安瓿瓶中，一 2 O °C保存。(4)小鼠免疫:用CIP-BSA免疫8 10周龄雌性Balb/C小鼠5只，剂量为60 U g/只，体积为0.2 mL。首免用PBS稀释的免疫原与等体积FCA完全乳化，以后每隔3 w加强免疫一次，换用FIA乳化。免疫5次后断尾采血分离血清，用间接ELISA和间接竞争ELISA筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合备用鼠。融合前3 d超免小鼠，尾静脉和腹腔各注射60 // g免疫原。(5)细胞融合:融合前Γ5 d用含有8-氮鸟嘌呤的完全培养基(含15%FBS的RPM1-1640)传代培养NSO细胞；前I d用HAT培养滋养细胞；融合时眶下窦采血，脱颈致死小鼠。无菌取脾脏制备脾细胞，在PEG-1500作用下与NSO细胞融合(细胞数量比约为10:1)，将融合后的细胞悬液加入到已铺有滋养细胞的96孔细胞板中，HAT培养。(6)类特异性单克隆细胞株的筛选:融合后1(T14 d用间接ELISA和ciELISA筛选强阳性、抑制率高、生长状态好的杂交瘤细胞株，用有限稀释法进行3次亚克隆。然后用FQs标准品溶液筛选灵敏度高、呈类特异性的单克隆源细胞株，共取得5株。其中，C1E6细胞株灵敏度最高，识别FQs标准品种类最多，其抗体特异性结果见表一。表一 C1E6细胞株 抗体特异性
权利要求
1.一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的塑料盒体上开有加样孔和观察窗，该加样孔的位置与试纸条上的样品垫位置相对应，观察窗与试纸条上的硝酸纤维素膜位置相对应，所述的硝酸纤维素膜上有诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。
3.根据权利要求1所述的一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的胶体金标记的 抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体是由环丙沙星一牛血清白蛋白偶联物免疫Balb/C小鼠制备而来的。
4.根据权利要求1所述的一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，其特征在于:所述的氟喹诺酮类药物为环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、培氟沙星、依诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、洛美沙星和麻保沙星中的至少一种。
5.一种权利要求1所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于:首先将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫按照由左到右的顺序附着于支撑层上，所述的硝酸纤维素膜上有诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，然后用切割机制成试纸条，然后将试纸条封装于带有加样孔和观察窗的塑料盒体内，制得氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡。
6.根据权利要求5所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述样品垫的制备方法为:将玻璃纤维棉用含有质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的NaN3的PBS缓冲液处理后，干燥备用，即为样品垫。
7.根据权利要求5所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述金标抗体结合垫的制备方法为:将玻璃纤维棉裁成4 mm宽的细条,放入含有质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl和质量浓度为0.05%的NaN3的PBS缓冲液中20 min，37 1:恒温烘干，然后将金标抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4 h，即为金标抗体结合垫。
8.根据权利要求5所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述硝酸纤维素膜的制备方法为:将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，检测抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，室温自然干燥后，将其浸入BSA质量浓度为1%的PBS缓冲液，pH值为7.4的封闭液中30 min，37 °C烘干后，加入干燥剂，4 °C密封保存。
9.根据权利要求5所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述诺氟沙星一鸡卵清白蛋白偶联物的制备方法为:将36 mg诺氟沙星溶解于2 mL DMF和2 mL 二氧六环中，4 °C预冷30 min，加入20 μ L三丁胺，冰浴10 min后加入40 μ L氯甲酸异丁酯，反应60 min，即A液，将40 mg鸡卵清白蛋白溶解于5 mL pH值为9.6的Na2CO3的缓冲溶液中，即B液，将A液逐滴加入到B液中，避光振荡反应4 h，反应完成后先用蒸馏水透析3 d，再用PBS缓冲液透析3 d，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时分装于安瓿瓶中，— 20 °C冻干保存。
10.根据权利要求5所述的氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法，其特征在于所述吸收垫的制备方法为:将以植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4mm宽的细条，并用胶膜 进行一侧封闭，干燥备用，即为吸收垫。
全文摘要
本发明公开了一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡及其制备方法。本发明的技术方案要点为一种氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡，包括塑料盒体和封装于塑料盒体内的试纸条，所述试纸条的底层为支撑层，该支撑层上由左到右依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述的硝酸纤维素膜上有诺氟沙星－鸡卵清白蛋白偶联物溶液印制的检测线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线，所述的结合垫上灌注有胶体金标记的抗氟喹诺酮类药物类特异性单克隆抗体。本发明还公开了该氟喹诺酮类药物残留快速检测试纸卡的制备方法。本发明操作简单、快速准确、灵敏度高、成本低、稳定性好，可进行批量检测。
文档编号G01N33/531GK103091495SQ201310014748
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月16日 优先权日2013年1月16日
发明者姜金庆, 陈俊杰, 张晓建, 李桂平, 杨志, 孟晓梅, 原小燕, 栗克文, 周丽霞, 杜同亮 申请人:河南知微生物工程有限公司, 河南科技学院