专利名称：用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的杀虫晶体蛋白(又称Bt杀虫晶体蛋白或Bt蛋白)具有抗虫作用，因此其编码基因(Bt基因)在转基因棉花等作物上应用广泛。根据编码基因序列的同源性和编码蛋白的杀虫谱，Bt蛋白分为cry族和cryt族，每一族下又分为数量不等的亚类。目前在植物中表达的Bt基因有CrylAa基因、CrylAb基因、CrylAc基因、Cry2Aa基因、Cry3Bb基因和Cry9c等基因。中国市场上商业化的转Bt基因作物中主要转入了针对鳞翅目昆虫幼虫有毒性的CrylAc基因。用转基因棉花籽粒生产棉籽油后，可以得到副产物棉籽饼，棉籽饼通常用作家禽或家畜的饲料。棉籽饼中，常常残留有变性Bt蛋白，对家禽或家畜具有潜在的危害，从而可能对食用家禽或家畜的人类造成潜在的危害。应用目前国内外商业化的免疫检测试剂盒或试纸条，基本检测不到棉籽饼中的变性Bt蛋白，迫切需要能够识别变性Bt蛋白的抗体以及方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。本发明提供了用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:用蛋白变性剂处理含有Bt蛋白的溶液，得到含有变性Bt蛋白的溶液。所述变性剂可为β-巯基乙醇和/或SDS (十二烷基横酸纳)。所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:将含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液；所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的体积配比为1:(1-10);所述溶液丙由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度如下:体积比为0.1-2%的β -巯基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL的SDS。所述变性处理可为在40-100°C水中水浴。所述变性处理可为在100°C沸水中水浴3-5分钟。所述变性处理可为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。所述变性处理可为调pH至3以下或调pH至10以上。所述调PH至3以下具体是通过加入硫酸水溶液的形式实现的。所述硫酸水溶液具体可为IM硫酸水溶液。所述调pH至10以上具体是通过加入氢氧化钠水溶液的形式实现的。所述氢氧化钠水溶液具体可为IM氢氧化钠水溶液。
所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法可如下:将含有Bt蛋白的溶液进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液。所述变性处理可为在40-100°C沸水中水浴。所述变性处理可为在100°C沸水中水浴3-5分钟。所述变性处理可为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。所述变性处理可为调PH至3以下或调pH至10以上。所述调pH至3以下具体是通过加入硫酸水溶液的形式实现的。所述硫酸水溶液具体可为IM硫酸水溶液。所述调pH至10以上具体是通过加入氢氧化钠水溶液的形式实现的。所述氢氧化钠水溶液具体可为IM氢氧化钠水溶液。所述Bt蛋白可以为苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体、原核表达的Bt蛋白、转基因作物中提取纯化的Bt蛋白或者商购的Bt蛋白。以上任一所述含有Bt蛋白的溶液具体可为蛋白浓度为0.1-lmg/mL的Bt蛋白溶液。可用ρΗ7.5、0.lmol/L的PB缓冲液调整蛋白浓度。所述Bt蛋白具体可采用如下方法制备:(I)将抗虫棉种 子去壳后进行可溶性总蛋白的提取，得到溶液甲；(2)将所述溶液甲进行60%饱和度的硫酸铵沉淀，离心收集沉淀；(3)溶解步骤(2)得到的沉淀并进行透析，得到溶液乙；(4)将所述溶液乙进行免疫亲和层析，收集与抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体特异结合的蛋白组分，即为Bt毒蛋白；所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体为是由杂交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162分泌产生的单克隆抗体。杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.5162。所述步骤(I)中，可采用ρΗΙΟ.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取所述可溶性总蛋白。所述步骤(I)中，所述溶液甲的制备方法具体如下:将所述抗虫棉种子去壳并研磨成粉，然后用PH10.5、0.0lM的CAPS缓冲液提取(提取温度具体可为4°C，提取时间具体可为4小时；提取过程中可用磁力搅拌器搅拌，以增加提取效率)，离心(离心条件具体可为:40C UOOOOrpm离心20分钟)后避开表层油脂取上部液体，即为所述溶液甲。所述步骤(2)中，所述“进行60%饱和度的硫酸铵沉淀”的实现方法如下:在所述溶液甲中加入硫酸铵并使其达到60%饱和度，然后冰浴放置。所述冰浴放置的时间具体可为40分钟。所述冰浴放置过程中可用磁力搅拌器搅拌。所述离心的参数具体可为:4°C、7000rpm离心20分钟。所述步骤(3)中，可用去离子水溶解所述沉淀并用Tris水溶液调pH至10.5。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。所述步骤(4)中，所述免疫亲和层析的步骤可如下:①将所述溶液乙上样于连接有所述抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体的免疫层析柱；②用清洗液清洗柱子，去除杂蛋白用洗脱液进行洗脱，收集过柱后洗脱液，即为含有目的蛋白的溶液。所述免疫亲和层析的填充料可为CNBr-activated Sepharose4B。所述清洗液具体可为pH2.5、0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述洗脱液具体可为含体积比为50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl缓冲液。所述免疫亲和层析过程中，具体可采用4转/分的上样流速、清洗流速和洗脱流速。所述步骤②中具体可用2倍上样体积的清洗液清洗柱子。所述步骤③中具体可用3倍体积的洗脱液进行洗脱。所述步骤③中具体可按Iml每管收集过柱后的洗脱液。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述方法中还可包括将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5然后进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。 所述方法中还可包括 将所述过柱后洗脱液用Tris水溶液调pH至7.5，然后检测其中是否含有Bt毒蛋白，最后将含有Bt毒蛋白的溶液进行透析的步骤。所述Tris水溶液具体可为IM Tris水溶液。所述透析具体在PBS缓冲液中进行。所述透析的条件具体可为:用PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下:( i )用抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆包被酶标板；(幻在步骤(i)的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗脱液，37°C温育30min ；(iii)在步骤(ii)的酶标板中加入辣根过氧化物酶标记的抗Bt CrylAc蛋白单克隆抗体，37°C温育30min ；(iv)向步骤(iii)的酶标板中加入底物缓冲液，室温反应15min后终止反应；(V)在 492nm 下测定 OD 值；(vi)将对照棉花品种的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4°C提取12小时，8000r/min4°C离心取上清，然后将上清进行上述步骤(i )至(V );(Vii)如果步骤(V )得到的OD值是步骤(vi)得到的OD值的三倍以上，结果为阳性。所述“检测其中是否含有Bt毒蛋白”的具体方法如下:( i )将lmg/mL抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗体用500倍体积的包被缓冲液进打稀释后加入到酶标板中，每孔100 μ L, 37 C温育3小时；(ii)在步骤(i )的酶标板中加入调pH至7.5后的过柱后洗脱液,每孔100 μ L,37°C 温育 30min ；(iii)将lmg/mL辣根过氧化物酶标记的抗Bt CrylAc蛋白单克隆抗体用1000倍体积的PBS缓冲液进行稀释后加入步骤(ii )的酶标板中，每孔100 μ L, 37°C温育30min ；(iv)向步骤(iii)的酶标板中加入底物缓冲液,每孔100 μ L,室温反应15min后每孔中加入50 μ L2.0M硫酸水溶液终止反应；(V )在 492nm 下测定 OD 值；(vi)将对照棉花品种的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4°C提取12小时，8000r/min4°C离心取上清，然后将上清进行上述步骤(i )至(V );(Vii)如果步骤(V )得到的OD值是步骤(vi)得到的OD值的三倍以上，结果为阳性。
所述对照棉花品种为不含有Bt CrylAc蛋白的编码基因的棉花品种,具体可为棉花品种石远321。所述抗虫棉可为转Bt CrylAc蛋白的编码基因的棉花,具体可为国欣棉6号。以上任一所述的Bt蛋白具体可为Bt CrylAc蛋白。以上任一所述的Bt CrylAc蛋白可为如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与就有杀虫晶体蛋白活性的由序列I衍生的蛋白质。以上任一所述Bt CrylAc蛋白的编码基因可为如下I)或2)或3)的DNA分子:I)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA序列杂交且编码杀虫晶体蛋白的DNA分子；3)与I)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码杀虫晶体蛋白的DNA分子。所述佐剂可为弗氏佐剂，具体可为弗氏完全佐剂或弗式不完全佐剂。所述佐剂可为水性佐剂。所述含有变性Bt蛋白的溶液和所述佐剂具体可等体积混合。以上任一所述免疫原免疫动物得到的多克隆抗体也属于本发明的保护范围。所述动物为哺乳动物，如兔子或小鼠。所述多克隆抗体可用作包被抗原和/或检测用一抗，从而用于检测待测样本中是否含有变性Bt蛋白。所述待测样本可为煮熟的转基因作物，转基因作物加工得到的食品或饲料等。本发明对转基因粮食作物的生物安全性评价具有实用价值，潜在社会效益巨大。
图1为实施例1的纯化过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图2为实施例5的步骤2的照片。图3为实施例5的步骤3和步骤4的照片。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。羊抗小鼠IgG-HRP:购自Jackson公司，商品目录号为79556)。弗氏完全佐剂:购自Sigma公司，商品目录号为F5881。弗氏不完全佐剂:购自Sigma公司，商品目录号为F5506。β-巯基乙醇:购自Sigma公司，商品目录号为Μ6250。十二烷基磺酸钠(SDS)和邻苯二胺(OPD)等其余常规试剂均购自北京化学试剂公司。
杂交瘤Bt2F9为稳定分泌抗转基因植物中Bt CrylAb/Ac蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株，已于2011年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为 CGMCC N0.5162。抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体的制备方法:将杂交瘤Bt2F9CGMCC N0.5162置于细胞培养基中，37°C培养2天，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体溶液，冻干_20°C保存。细胞培养基的制备方法:向DMEM培养基中添加小牛血清(购自GIBC0BRL，产品目录号为26170-043)和碳酸氢钠，小牛血清的终浓度为20% (质量百分含量)，碳酸氢钠的终浓度为0.2% (质量百分含量)，pH为7.4。商购的Bt CrylAc蛋白:上海佑隆生物科技有限公司，产品目录编号为C010301。棉花品种石远321:河北神农高科技股份有限公司。国欣棉6号(转Bt CrylAc蛋白的编码基因的抗虫品种)的种子，购自河北省河间市国欣农研会。如无特殊说明本实施例中所用的PBS缓冲均如下:PBS缓冲液的配方(pH7.5):溶剂为水，含有 0.02M Na2HP04、0.0015M KH2PO4 和 0.14M NaCl。实施例l、Bt CrylAc蛋白的制备1、可溶性总蛋白的提取将国欣棉6号的种子去壳并研磨成细粉，取IOg细粉，加入IOOml ρΗΙΟ.5、0.0IMCAPS缓冲液，使用磁力搅拌器4°C搅拌提取4小时，然后4°C、IOOOOrpm离心20分钟，避开表层油脂取上部液体，该液体即为可溶性总蛋白提取液。2、硫酸铵沉淀向步骤I得到的可溶性总蛋白提取液中加入硫酸铵粉末，使其在提取液中的饱和度达到60%，在冰浴中使用磁力搅拌器搅拌40分钟。3、沉淀的复溶和透析将完成步骤2的提取液4°C、7000rpm离心20分钟，收集沉淀；向沉淀中加入2ml去离子水，用IM Tris水溶液调pH至10.5，小心地溶解沉淀，然后转移至透析袋中，用2000mlPBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。4、免疫亲和层析填料:CNBr-activatedSepharose4B (购自 GE 公司，商品型号为 I7-(M3C)-OlX用于免疫亲和层析的抗体:抗Bt CrylAb/Ac蛋白的单克隆抗体。平衡缓冲液:PBS缓冲液。清洗液:ρΗ2.5、0.0lM 的 Gly-HCl 缓冲液。洗脱液:含体积比为50%的乙二醇的pH2.5,0.0lM的Gly-HCl缓冲液。流速:平衡流速为20转/分，上样流速、清洗流速和洗脱流速均为4转/分。免疫亲和层析过程:(I)将填料和用于免疫亲和层析的抗体按照填料附带的使用说明书制备好免疫亲和层析柱，柱床体积为3.5ml ; (2)用5倍柱床体积的平衡缓冲液平衡柱子；(3)上样步骤3得到的溶液；(4)用2倍上样体积的清洗液洗涤柱子，以去除杂蛋白；
(5)用3倍上样体积的洗脱液进行洗脱，按Iml每管收集过柱后的洗脱液。5、将每管过柱后洗脱液立即用IM Tris水溶液调pH至7.5。
6、采用申请号为“201210012498.4”的专利申请的实施例2的步骤一制备的试剂盒检测每管步骤5得到的溶液，方法如下:(I)多克隆抗体的包被:将lmg/mL抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗体用包被缓冲液进行稀释，按照抗Bt CrylAc蛋白的兔多克隆抗体与包被缓冲液的体积比为1:500的比例稀释后加入到酶标板中，每孔ΙΟΟμ L，37°C温育3小时；倒去酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。(2)在步骤(I)的酶标板中加入步骤5得到的溶液，每孔100 μ L，对照孔加入100 μ L PBS缓冲液；37°C温育30min ;倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。(3)将lmg/mL辣根过氧化物酶标记的抗Bt CrylAc蛋白单克隆抗体(即酶标记抗体)用PBS缓冲液进行稀释，按照酶标记抗体与PBS缓冲液的体积比为1:1000稀释后，分别向上述步骤(2)的酶标板中加入ΙΟΟμ L稀释后的酶标记抗体；37°C温育30min ;倒掉酶标板中的溶液，用PBS缓冲液洗板4次，甩干。(4)向步骤(3)的酶标板中分别加入100 μ L底物缓冲液，室温反应15min后，再向每孔中加入50 μ L2.0M的硫酸水溶液终止反应。(5)在 492nm 下测定 OD 值。(6)将棉花品种石远321的叶片于研钵中研磨，用PBS缓冲液于4°C提取12小时，8000r/min4°C离心取上清,然后将上清进行上述步骤(I)至(5)。(7)如果步骤(5)得到的OD值是步骤(6)得到的OD值的三倍以上，结果为阳性。7、将步骤6中检测为阳性的管中的溶液合并，转移至透析袋中，用2000ml PBS缓冲液4°C透析6小时(每两个小时更换新的PBS缓冲液)。纯化过程中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图见图1。图1中，泳道I对应的样本为溶液甲，泳道2对应的样本为步骤3中溶解沉淀得到的溶液，泳道3对应的样本为步骤7得到溶液，泳道4对应的样本为蛋白质marker,泳道5对应的为原核表达的Bt CrylAc蛋白。商购的Bt CrylAc蛋白与泳道3的结果一致。
回收泳道3中的目的条带并进行N端15个氨基酸残基的测序，结果表明，该目的条带确实为Bt CrylAb/Ac蛋白。实施例2、免疫原的制备一、免疫原的制备1、用pH7.5,0.lmol/L的PB缓冲液将实施例1制备的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液A。ρΗ7.5、0.lmol/L 的 PB 缓冲液的制备方法:将 0.2g KH2PO4 和 2.96g Na2HPO4.12H20溶于蒸馏水中，用蒸馏水定容到1L。2、将溶液A和溶液B等体积混合，得到溶液C。溶液B的由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为:2% (体积比)β -巯基乙醇和 10g/100mLSDS。3、将溶液C在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原I。4、将溶液C在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原I。二、免疫原的制备1、用pH7.5,0.lmol/L的PB缓冲液将实施例1制备的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为0.lmg/mL的溶液D。2、将溶液D和溶液B等体积混合，得到溶液E。3、将溶液E在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原II。4、将溶液E在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原II。三、免疫原的制备1、将I体积份步骤一的I制备的溶液A和10体积份溶液F混合，得到溶液G。溶液F的由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度为:0.1% (体积比)β -巯基乙醇和 0.1g/1OOmL SDSo2、将溶液G在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原III。3、将溶液G在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原III。四、免疫原的制备
1、将I体积份步骤二的I制备的溶液D和10体积份溶液F混合，得到溶液H。2、将溶液H在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原IV。3、将溶液H在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原IV。五、免疫原的制备1、用pH7.5、0.lmol/L的PB缓冲液将商购的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液。2、将步骤I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原V。3、将步骤I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原V。六、免疫原的制备1、用pH7.5、0.lmol/L的PB缓冲液将商购的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为
0.lmg/mL的溶液。2、将步骤I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原VI。3、将步骤I得到的溶液在100°C沸水中水浴3-5分钟(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原VI。七、免疫原的制备1、将步骤五的I得到的溶液在-20°C冰箱中反复冻融3次(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原VII。2、将步骤五的I得到的溶液在_20°C冰箱中反复冻融3次(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原VII。八、免疫原的制备1、将步骤六的I得到的溶液在_20°C冰箱中反复冻融3次(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原珊。2、将步骤六的I得到的溶液在_20°C冰箱中反复冻融3次(使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原珊。九、免疫原的制备1、将步骤五的I得到的溶液用IM硫酸水溶液调pH值至3 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原IX。2、将步骤五的I得到的溶液用IM硫酸水溶液调pH值至3 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原IX。十、免疫原的制备1、将步骤六的I得到的溶液用IM硫酸水溶液调pH值至3 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原X。2、将步骤六的I得到的溶液用IM硫酸水溶液调pH值至3 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原X。i^一、免疫原的制备1、将步骤五的I得到的溶液用IM氢氧化钠水溶液调pH值至10 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制 备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原XI。2、将步骤五的I得到的溶液用IM氢氧化钠水溶液调pH值至10 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原XI。十二、免疫原的制备1、将步骤六的I得到的溶液用IM氢氧化钠水溶液调pH值至10 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的基础免疫原，简称基础免疫原ΧΠ。2、将步骤六的I得到的溶液用IM氢氧化钠水溶液调pH值至10 (使蛋白充分变性)，冷却至室温后和弗氏不完全佐剂等体积混合并用磁力搅拌器充分搅拌乳化(直到滴入水中不扩散)，得到用于制备变性Bt CrylAc蛋白的抗体的加强免疫原，简称加强免疫原ΧΠ。实施例3、变性Bt CrylAc蛋白的抗体的制备一、兔多克隆抗体的制备实验动物为3月兔龄的新西兰大耳白兔(购自军事医学科学院实验动物中心)，体重2kg以上。1、基础免疫将基础免疫原I采用后脚趾间隙注射实验动物，以Bt CrylAc蛋白计，注射剂量为Img/ 只。2、加强免疫基础免疫4周后，将加强免疫原I采用后腿股淋巴结、背部、颈部皮下多点注射实验动物，以Bt CrylAc蛋白计，注射剂量为Img/只；之后每隔20天按照相同的方法进行加强免疫一次；第五次加强免疫后第7天，颈动脉采全血，分离血清，采用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到兔多克隆抗体，-20°C保存。二、鼠多克隆抗体的制备实验动物为8-10周龄的Bal b/C小白鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)。1、基础免疫将基础免疫原II采用腹腔、背部皮下多点注射实验动物，以Bt CrylAc蛋白计，注射剂量为0.1mg/只。2、加强免疫基础免疫2周后，将加强免疫原II采用腹腔、背部皮下多点注射实验动物，以BtCrylAc蛋白计，注射剂量为0.1mg/只；之后每隔10天按照相同的方法进行加强免疫一次；从第三次加强免疫开始，免疫后的第7天眼眶采血，测定抗体效价，效价的定义为OD45tol值为I时的血清稀释倍数，待效价大于1:8000后，摘取眼球取血，分离血清，采用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，得到鼠多克隆抗体，-20°C保存。实施例4、应用多克隆抗体检测变性Bt蛋白一、蛋白样本的制备1、称量Ig国欣6号棉花品种制备的棉籽饼，用研钵磨碎，加入蛋白提取液2mL，4°C、300rpm室温振荡提取I小时，然后4°C静置I小时，取上清液，即为样本-1。蛋白提取液由NaCl、KH2PO4, Na2HPO4.12H20、Tween-20 和水组成，NaCl 的浓度为8.0g/L, KH2PO4 的浓 度为 0.2g/L，Na2HPO4.12Η20 的浓度为 2.96g/L, Tween-20 的浓度为 0.1%(体积比)。2、用pH7.5,0.lmol/L的PB缓冲液、将实施例1制备的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液，即为样本-1I (阳性对照)。3、将样本-1I在100°C沸水中水浴3-5分钟，即为样本-1IK阳性对照)。4、用pH7.5,0.lmol/L的PBS缓冲液将牛血清蛋白(购置于Merck-Calbiochem，货号12659)配制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液，即为样本_ IV (阴性对照)。5、pH7.5、0.lmol/L的PBS缓冲液，即为样本_ V (空白对照)。二、各种缓冲液的配方包被缓冲液:ρΗ9.6、0.05Μ的碳酸盐缓冲液。封闭液:将2mg市售脱脂奶粉溶于IOOmL pH7.5,0.1M的PBS缓冲液，得到封闭液。样品稀释液:将0.5ml吐温20、0.5g明胶和500ml pH9.6、0.1M的PBS缓冲液混
合，得到样品稀释液。柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH5.5):由柠檬酸三钠、Na2HPO4和水组成，柠檬酸三钠的浓度为0.01M, Na2HPO4的浓度为0.03M。底物显色液:商购Sigma TMB显色液，货号T0440-1L。终止液:1.0M的盐酸水溶液。洗涤液:由NaCl、KH2P04、Na2HP04.WH2OJweenjO 和水组成，NaCl 的浓度为 8.0g/L，KH2PO4 的浓度为 0.2g/L， Na2HPO4.Iffi2O 的浓度为 2.96g/L，Tween-20 的浓度为 0.1% (体积比)。三、应用多克隆抗体检测变性Bt蛋白1、包被在96孔酶标板中每孔加入100 μ L兔多克隆抗体(取实施例2制备的兔多克隆抗体，用包被缓冲液调整蛋白浓度为100ng/mL)，37°C孵育3小时，然后用洗涤液洗涤4次。2、封闭每孔加入150 μ L封闭液，在37°C湿盒中封闭lh，弃封闭液，然后用洗涤液洗涤4次。3、加样每孔加入ΙΟΟμ L待测样品(样本-V、样本-1V、样本-1I1、样本-1I或样本-1),置湿盒中37°C条件下温育30min，然后用洗涤液洗涤4次。4、加鼠多抗每孔加入100μ L鼠多克隆抗体(取实施例3制备的鼠多克隆抗体，用样品稀释液调整蛋白浓度为1000ng/mL)，置湿盒中37°C条件下温育30min，然后用洗涤液洗涤4次。5、加酶标二抗每孔加100μ L酶标二抗(取羊抗小鼠IgG-HRP，用样品稀释液稀释1000倍)，置湿盒中37 °C条件下温育30min，然后用洗涤液洗涤4次。6、显色每孔加入100μ L底物显色液，避光放置15min。7、终止每孔加入100 μ L终止液，用酶标仪450nm处测定OD值。每个待测样本设置三个复孔，取平均OD值。样本-V (空白对照)的平均OD值为0.084。样本-1V (阴性对照)的平均OD值为0.169。样本-1II (阳性对照)的平均OD值为2.178。样本-1I (阳性对照)的平均OD值为3.036。样本-1的平均OD值为1.876。如果待测样本的平均OD值高于阴性对照的平均OD值0.2以上，则说明待测样品中含有变性的Bt CrylAc蛋白。四、应用现有试剂盒检测米用ENVIR0L0GIX 公司的 QualiPlate Kit for CrylAc/CrylAc 试剂盒(目录号:AP003CRBS,Kit Lot:043230)并按说明书对待测样品(样本-V、样本-1V、样本-1I1、样本-1I或样本-1)进行检测。每个待测样本设置三个复孔，取平均OD值。样本-V (空白对照)的平均OD值为0.059。样本-1V (阴性对照)的平均OD值为
0.060。样本-1II的平均OD值为0.070。样本-1I (阳性对照)的平均OD值为3.274。样本-1的平均OD值为0.178。
实施例5、应用多克隆抗体检测变性Bt蛋白1、用pH7.5,0.lmol/L的PB缓冲液、将商购的Bt CrylAc蛋白配制成蛋白浓度为lmg/mL的溶液，在100°C沸水中水浴3-5分钟，即为样本液VI。2、将样本液用用pH7.5,0.lmol/L的PB缓冲液梯度稀释，得到各个样本稀释液。采用实施例4的步骤三的方法检测各个样本稀释液中的变性Bt蛋白，照片见图2。3、将实施例4中的样本-1V (阴性对照)、样本-V (空白对照)、样本液VK变性抗体)，分别采用实施例4的步骤三的方法检测变性Bt蛋白，照片见图3。4、用国外市售抗体(国外抗体)代替实施例4的步骤三的方法中的鼠多克隆抗体，对样本液VI进行检测，照片见图3。
权利要求
1.用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。
2.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于:所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法如下:将含有Bt蛋白的溶液和溶液丙混合后进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液；所述含有Bt蛋白的溶液和所述溶液丙的体积配比为1:(1-10);所述溶液丙由溶质和溶剂组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度如下:体积比为0.1-2%的β-巯基乙醇和0.1-10.0mg/1OOmL 的 SDS。
3.如权利要求2所述的免疫原，其特征在于:所述变性处理为在100°C沸水中水浴3-5分钟。
4.如权利要求2所述的免疫原，其特征在于:所述变性处理为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。
5.如权利要求2所述的免疫原，其特征在于:所述变性处理为调pH至3以下或调pH至10以上。
6.如权利要求1所述的免疫原，其特征在于:所述含有变性Bt蛋白的溶液的制备方法如下:将含有Bt蛋白的溶液进行变性处理，得到含有变性Bt蛋白的溶液。
7.如权利要求6所述的免疫原，其特征在于:所述变性处理为在100°C沸水中水浴3-5分钟。
8.如权利要求6所述的免疫原，其特征在于:所述变性处理为在-20°C冰箱反复冻融3次以上。
9.如权利要求1至8中任一所 述的方法，其特征在于:所述佐剂为弗氏佐剂，具体可为弗氏完全佐剂或弗式不完全佐剂。
10.将权利要求1至8中任一所述的免疫原免疫动物得到的多克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原及其制备的抗体和应用。本发明提供了用于制备识别变性Bt蛋白的抗体的免疫原，是将含有变性Bt蛋白的溶液和佐剂混合并乳化得到的产物。所述免疫原免疫动物得到的多克隆抗体也属于本发明的保护范围。所述多克隆抗体可用作包被抗原和/或检测用一抗，从而用于检测待测样本中是否含有变性Bt蛋白。所述待测样本可为煮熟的转基因作物，转基因作物加工得到的食品或饲料等。本发明对转基因粮食作物的生物安全性评价具有实用价值，潜在社会效益巨大。
文档编号G01N33/68GK103193873SQ20131007051
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月6日 优先权日2013年3月6日
发明者王保民, 曹振, 张亮, 张威, 张瑞, 谭桂玉, 南铁贵, 崔永亮, 郭素琴 申请人:中国农业大学