专利名称：一种利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定糜蛋白酶活性的方法，特别涉及一种利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的方法。
背景技术：
蛋白酶是水解蛋白质、肽键的一类酶的总称，参与了一系列生理和病理过程。许多疾病包括癌症、中风、感染、风湿性关节炎和炎症等都会影响到蛋白酶的正常活性。因此，通过蛋白酶活性的检测对疾病的诊断具有非常重要的意义。在目前采用的蛋白酶活性测量的方法中，荧光方法具有准确、快速、简单的优势。这些荧光方法的检测主要是采用荧光共振能量传递(FRET)技术，选用的荧光底物一般是标记有荧光染料的多肽，因此需要合成多肽和昂贵的荧光标记，检测成本较高。金纳米团簇是由几个到几十个金原子组成核心，有机单分子或者蛋白质等作为保护基团组合而成的分子级聚集体。金纳米团簇作为一类新型纳米材料具有独特的光学特性，在催化、生物传感和生物成像上具有广泛的应用。金纳米团簇与金纳米颗粒的性质明显不同，金纳米团簇尺寸与电子的费米波长(〈lnm)相当，由于其尺寸太小而不足以支撑其产生像金纳米颗粒一样的表面等离子体共振。金纳米团簇具有一些特殊的光学特性，如具有依赖与粒子粒径大小的荧光性质等。目前，金纳米团簇的制备方法主要是通过一些带有巯基的高分子、肽链、蛋白质和DNA来还原金前驱体。其中，采用蛋白质模板合成的金纳米团簇具有好的生物相容性和水溶性。采用牛血清白蛋白(BSA)合成金纳米团簇具有简单、绿色、“一锅煮”的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用金纳米团簇的新用途，具体为金纳米团簇在测定糜蛋白酶活性中应用。本发明还保护金纳米团簇在测定待测样品中糜蛋白酶含量中的应用。本发明的再一个目的是提供一种利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量的方法。本发明所提供的利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量的方法，具体可包括如下步骤:(al)将糜蛋白酶标准品或待测样品与金纳米团簇混合，形成实验反应体系；同时设置与所述实验反应体系相比缺少所述糜蛋白酶标准品或所述待测样品的空白反应体系；将所述实验反应体系和所述空白反应体系在同一条件下进行反应，反应结束后分别测定所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度，计算得到所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度差值；(a2)根据步骤(al)得到的所述糜蛋白酶标准品的所述荧光强度差值绘制标准曲线，将所述待测样品的所述荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中糜蛋白酶的含量。在上述方法中，步骤(a2)中，所述根据步骤(al)得到的所述糜蛋白酶标准品的荧光强度差值绘制标准曲线，是以所述糜蛋白酶标准品的所述荧光强度差值为纵坐标，以所述糜蛋白酶标准品在含有所述糜蛋白酶标准品的所述实验反应体系中的终浓度为横坐标，绘制的标准曲线。 在上述方法中，所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度差值为反应后所述空白反应体系的荧光强度减去反应后所述实验反应体系的荧光强度。在上述方法中，所述糜蛋白酶标准品可为系列浓度的糜蛋白酶标准品溶液，如浓度依次为 50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml、25000ng/ml、50000ng/ml、250000ng/ml(相当于 0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL、5U/mL、25U/mL、50U/mL、250U/mL)的糜蛋白酶标准品溶液；所述糜蛋白酶标准品溶液的溶剂可为pH7 8.5的缓冲体系，在本发明的一个实施例中，所述糜蛋白酶标准品溶液的溶剂具体为50mM NH4HCOyK溶液。在上述方法中，所述反应的温度可为35_40°C ;所述反应的pH可为7-8.5 ;所述反应的时间可为50min-70min。在本发明的一个实施例中，所述反应的温度具体为37°C，所述反应的pH具体为7.8,所述反应的时间具体为Ih。在本发明的一个实施例中，所述反应的液体环境可为50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，所述待测样品中含有糜蛋白酶，且同时不含有可降解所述金纳米团簇包裹蛋白(如BSA)的其他蛋白酶。在本发明的一个实施例中，所述待测样品为用糜蛋白酶标准品配制的溶液，具体为将糜蛋白酶标准品溶于50mM NH4HCO3水溶液中得到的溶液；该溶液中糜蛋白酶的浓度为750ng/ml (即0.75U/mL)。在上述方法中，各所述反应体系中，所述糜蛋白酶和所述金纳米团簇的反应配比为(0.003U-15U):24nmol，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。具体的，在本发明中，含有所述糜蛋白酶标准品的所述实验反应体系的组成具体如下:终浓度为(0.01-50) U/mL的所述糜蛋白酶标准品，终浓度为80 μ M的所述金纳米团簇；所述糜蛋白酶标准品和所述金纳米团簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。含有所述待测样品的所述实验反应体系的组成具体如下:含有终浓度为150ng/mL总蛋白的所述待测样品，终浓度为80 μ M的所述金纳米团簇；所述待测样品和所述金纳米团簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。所述空白体系的组成具体如下:终浓度为80 μ M的所述金纳米团簇；所述金纳米团簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。在上述应用或方法中，所述金纳米团簇的保护基团为蛋白质(如BSA)。 本发明还保护金纳米团簇在监测糜蛋白酶水解底物蛋白中的应用。本发明的又一个目的是提供一种利用金纳米团簇检测不同反应体系中糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应速率快慢的方法。本发明所提供的利用金纳米团簇检测不同反应体系中糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应速率快慢的方法，具体可包括如下步骤:
(bl)将以底物蛋白作为保护基团的金纳米团簇与糜蛋白酶进行反应，形成不同的反应体系，反应过程中实时监测各反应体系的荧光强度；(b2)根据步骤(bl)中实时监测到的各反应体系的荧光强度，按照如下方法确定所述不同反应体系中糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应速率快慢:所述反应体系的荧光强度降低越快则相应反应体系中糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应速率越快；所述反应体系的荧光强度降低越慢则相应反应体系中糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应速率越慢。在上述方法中，所述反应的温度可为35-40°C;所述反应的pH可为7-8.5。在本发明的一个实施例中，所述反应的温度具体为37°C,所述反应的pH具体为7.8。在本发明的一个实施例中，所述反应的液体环境可为50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，各所述反应体系中，所述糜蛋白酶和所述金纳米团簇的反应配比为(0.6U-6U):24nmol，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。具体的，在本发明中，上述方法中所述不同的反应体系的组成具体如下:终浓度为
2、10或20U/mL的所述糜蛋白酶标准品，终浓度为80 μ M的所述金纳米团簇；所述糜蛋白酶标准品和所述金纳米团簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。本发明的还一个目的是提供一种利用金纳米团簇监测糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应是否结束的方法。本发明所提供的利用金纳米团簇检测糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应是否结束的方法，具体可包括如下步骤:(Cl)将以底物蛋白作为保护基团的金纳米团簇与糜蛋白酶进行反应，反应过程中实时监测反应体系的荧光强度；(c2)根据步骤(Cl)中实时监测到的所述反应体系的荧光强度，按照如下方法确定所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应是否结束:若所述反应体系的荧光强度随着反应的进行不再降低，则所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应结束；若所述反应体系的荧光强度随着反应的进行一直在降低，则所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应尚未结束。在上述方法中，所述反应的温度可为35-40°C;所述反应的pH可为7-8.5。在本发明的一个实施例中，所述反应的温度具体为37°C,所述反应的pH具体为7.8。在本发明的一个实施例中，所述反应的液体环境可为50mM NH4HCO3水溶液。在上述方法中，各所述反应体系中，所述糜蛋白酶和所述金纳米团簇的反应配比为(0.6U-6U):24nmol，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。具体的，在本发明中，上述方法中所述反应体系的组成具体如下:终浓度为2、10或20U/mL的所述糜蛋白酶标准品，终浓度为80 μ M的所述金纳米团簇；所述糜蛋白酶标准品和所述金纳米团簇均溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH7.8)中，其中所述金纳米团簇的含量以其保护基团BSA的含量计算。在以上各应用和各方法中，所述蛋白质均可为牛血清白蛋白(BSA);所述底物蛋白均可为牛血清白蛋白(BSA)。具体的，所述金纳米团簇中金原子与牛血清白蛋白的配比为IOmmol:30g。每个所述金纳米团簇包含25个金原子。更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述金纳米团簇是按照包括如下步骤的方法制备得到:将等体积(如5mL)的IOmM HAuCl4水溶液与30mg/mL牛血清白蛋白水溶液于37°C反应5min ;再向反应体系中加入1/20体积(如0.5mL)的IM NaOH水溶液于37°C反应12h，从反应产物中获得所述金纳米团簇。在上述各方法中，所述荧光强度均是在激发波长365nm，检测波长640nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米的条件下检测得到的。本发明无需对糜蛋白酶作用底物进行荧光标记，能够实时检测糜蛋白酶对底物蛋白的水解过程，同时能够高灵敏的测定待测样品中糜蛋白酶的含量。
图1为金纳米团簇测定糜 蛋白酶活性的过程。图2为实施例1中制备的金纳米团簇的荧光吸收光谱和发射光谱。图3为37°C下BSA包裹的金纳米团簇被不同浓度糜蛋白酶水解后荧光强度随时间变化曲线。图4为利用BSA包裹的金纳米团簇检测糜蛋白酶的浓度与荧光强度变化值的关系(标准曲线)。
具体实施例方式本发明中，利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的过程如图1所示，其原理在于:在金纳米团簇的合成过程中，牛血清白蛋白(BSA)上的酪氨酸的酚羟基和半胱氨酸的巯基在碱性条件下具还原性，将Au3+还原成Au°，而BSA对金纳米团簇的包裹和稳定则是通过半胱氨酸残基与Au形成的Au-S键实现的，因此，当在糜蛋白酶作用下，BSA被水解，其结构受到破坏，则会影响金纳米团簇的荧光强度。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。牛血清白蛋白(BSA):购自Amresco公司，其产品目录号为0332。糜蛋白酶标准品:购自Amresco公司，其产品目录号为0164。该糜蛋白酶标准品的酶活为1000U/mg。其中，糜蛋白酶的酶活定义为:在测定条件(251:; !1值7.0)下，一分钟转化I μ mol底物所需要的酶量，即为一个活力单位(即1U)。实施例1、金纳米团簇的制备及表征一、BSA包裹的纳米金团簇的制备往5mL IOmM HAuCl4水溶液中在37 °C条件下边磁力搅拌边加入5mL 30mg/mL牛血清白蛋白(BSA)水溶液反应5分钟，后加入0.5mL IM NaOH水溶液，在37°C下反应12小时，得到的深棕色溶液。用二次蒸馏水透析48小时，去除杂质。最终得到的BSA包裹的金纳米团簇，保存在4度备用。二、BSA包裹的纳米金团簇的表征用荧光光谱仪(PerkinElmer Model LS-55)测定步骤一制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的激发光谱和发射光谱。测定结果如图2。由图可知，步骤一制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的发射峰在640nm，且荧光发射较强。这说明步骤一制备得到的是金团簇而不是尺寸较大荧光很弱的金颗粒；另外，发射峰位置与组成金纳米团簇的金原子数量有关，在640nm这个位置的发射峰说明每个金纳米团簇大约包含25个金原子(参考文献:Jianping Xie, YuangangZheng,Jackie Y.Ying.Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent GoldNanoclusters.J.AM.CHEM.SOC.，2009，131，888-889.)。实施例2、金纳米团簇监测糜蛋白酶水解过程本实施例将详述如何利用实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇检测糜蛋白酶的水解过程。1、将实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的浓度为0.1mM (以BSA含量计)。2、取 60 μ I 系列浓度(0.lmg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL ;将质量转换为酶活单位，依次为100U/mL、50U/mL、10U/mL )的糜蛋白酶标准品(溶于50mM NH4HCO3水溶液，pH=7.8)分别加入到预先制备的240 μ I溶液I中，立即混匀加入比色皿中，用荧光光谱仪(PerkinElmer Model LS-55)在37°C下实时监测反应混合物的荧光强度随时间的变化，激发波长为365nm，检测波长为640nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米。实验重复3次，结果取平均值。结果一方面显示，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇荧光强度随着水解时间的延长而减弱，同时糜蛋白酶初始浓度越高的反应体系的荧光信号下降越明显，详见图3。而理论上反应体系中糜蛋白酶的初始浓度越高，水解反应速率应越快。所以根据以上结果，可得出如下结论:荧光信号下降越明显(荧光强度降低越快)，相应反应体系中的糜蛋白酶水解反应速率越快。结果另一方面显示，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的荧光强度随着水解时间的延长而减弱，且随着反应时间的推移荧光强度基本趋于稳定，不再降低，这说明相应时间点已没有肽段继续离开金纳米团簇表面，即水解反应结束。综合以上结果，可见荧光强度随反应时间的变化在一定程度上直接反应了糜蛋白酶对底物蛋白BSA的水解反应进程。实施例3、金纳米团簇检测待测样本中糜蛋白酶的含量一、标准曲线的绘制1、将实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的浓度为0.1mM (以BSA含量计)。2、将 60 μ I 不同浓度(50ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、2500ng/ml、5000ng/ml、25000ng/ml、50000ng/ml、250000ng/ml ;将质量转换为酶活单位，依次为 0.05U/mL、0.25U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL、5U/mL、25U/mL、50U/mL、250U/mL)的糜蛋白酶标准品(溶于 50mMNH4HCO3水溶液，pH=7.8)分别加入到预先制备的240 μ I溶液I中，37°C反应I小时后，用荧光光谱仪(PerkinElmer Model LS-55)测定反应混合物荧光强度，同时测定不加入糜蛋白酶标准品的空白反应体系(60 μ I 50mMNH4HC03水溶液(pH=7.8)加入到预先制备的240 μ I溶液I)在37°C孵育I小时后的荧光强度，激发波长为365nm，检测波长为640nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米。实验重复3次，结果取平均值。3、以反应混合物荧光强度的变化值(空白反应体系的荧光强度减去反应后反应混合物荧光强度)为纵坐标，以糜蛋白酶标准品在300μ I反应体系中的终浓度(依次为IOng/mL、50ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、5000ng/ml、10000ng/ml、50000ng/ml)的对数为横坐标，绘制标准曲线。结果图4所示，金纳米团簇荧光强度在与不同浓度糜蛋白酶反应I小时后，荧光信号的变化值与糜蛋白酶浓度的对数成正比，两者具有良好的线性关系，其线性方程为:y=-2.33877X+21.40956 (R2=0.99136)。二、待测样品中糜蛋白酶含量的测定待测样品:将糜蛋白酶标准品溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，使糜蛋白酶的浓度为 750ng/ml (即 0.75U/mL)。1、将实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的浓度为0.1mM (以BSA含量计)。2、将60 μ I待测样品(溶于50mM NH4HCO3水溶液，pH=7.8 )加入到预先制备的240 μ I溶液I中，37 °C反应I小时后，用荧光光谱仪(PerkinElmer Model LS-55)测定反应混合物荧光强度，同时测定不加入待测样品的空白反应体系的荧光强度，激发波长为365nm,检测波长为640nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米。实验重复3次，结果取平均值。3、将步骤2所得反应混合物的荧光强度变化值(空白反应体系的荧光强度减去反应后反应混合物荧光强度)代入步骤一得到的标准曲线方程中，通过计算得到待测样品中糜蛋白酶的含量为753.04ng/ml。由于已知糜蛋白酶标准品的酶活为1000U/mg,所以待测样品中的糜蛋白酶的含量为0.75304U/mL。三、检测限的测定噪音的确定:在实验条件下测定空白样品，得到的数据的标准偏差为噪音。噪音数值乘以3，带入标准曲线得到检测限，噪音数值乘以10，带入标准曲线得到定量限。具体如下:1、将实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇溶于50mM NH4HCO3水溶液(pH=7.8)中，得到溶液I。溶液I中，实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇的浓度为0.1mM (以BSA含量计)。2、将60 μ I浓度为50mM的NH4HCO3水溶液(pH=7.8)加入到预先制备的240 μ I溶液I中，37°C孵育I小时后，用荧光光谱仪(PerkinElmer Model LS-55)测定混合溶液的荧光强度，激发波长为365nm，检测波长为640nm，入射狭缝10纳米，出射狭缝10纳米。实验
重复3次。3、统计步骤2所得的3次重复实验，测得的混合溶液的荧光强度值的标准偏差，该标准偏差即为噪音。噪音数值乘以3，带入步骤一得到的标准曲线得到检测限，噪音数值乘以10，带入步骤一得到的标准曲线得到定量限。结果显示，在信噪比为3的情况下，检测限为1.4ng/ml (相当于1.4X10_3U/ml)，在信噪比为10的情况下，定量限为5.7ng/ml (相当于5.7X 10_3U/ml)。可见，利用实施例1制备得到的BSA包裹的金纳米团簇检测糜蛋白酶的含量具有较高的灵敏度。
权利要求
1.金纳米团簇在测定糜蛋白酶活性中应用。
2.金纳米团簇在测定待测样品中糜蛋白酶含量中的应用。
3.一种利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量的方法，包括如下步骤: (al)将糜蛋白酶标准品或待测样品与金纳米团簇混合，形成实验反应体系；同时设置与所述实验反应体系相比缺少所述糜蛋白酶标准品或所述待测样品的空白反应体系；将所述实验反应体系和所述空白反应体系在同一条件下进行反应，反应结束后分别测定所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度，计算得到所述实验反应体系和所述空白反应体系的荧光强度差值； (a2)根据步骤(al)得到的所述糜蛋白酶标准品的所述荧光强度差值绘制标准曲线，将所述待测样品的所述荧光强度差值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中糜蛋白酶的含量。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于:所述反应的温度为35°C-40°C;所述反应的PH为7-8.5 ;所述反应的时间为50min-70min。
5.金纳米团簇在监测糜蛋白酶水解底物蛋白中的应用。
6.一种利用金纳米团簇检测不同反应体系中糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应速率快慢的方法，包括如下步骤: (bl)将以底物蛋白作为保护基团的金纳米团簇与糜蛋白酶进行反应，形成不同的反应体系，反应过程中实时监测各反应体系的荧光强度； (b2)根据步骤(bl)中实时监测到的各反应体系的荧光强度，按照如下方法确定所述不同反应体系中糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应速率快慢:所述反应体系的荧光强度降低越快则相应反应体系中糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应速率越快；所述反应体系的荧光强度降低越慢则相应反应体系中糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应速率越慢。
7.一种利用金纳米团簇检测糜蛋白酶对底物蛋白进行水解的反应是否结束的方法，包括如下步骤: (Cl)将以底物蛋白作为保护基团的金纳米团簇与糜蛋白酶进行反应，反应过程中实时监测反应体系的荧光强度； (c2)根据步骤(Cl)中实时监测到的所述反应体系的荧光强度，按照如下方法确定所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应是否结束:若所述反应体系的荧光强度随着反应的进行不再降低，则所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应结束；若所述反应体系的荧光强度随着反应的进行一直在降低，则所述糜蛋白酶对所述底物蛋白进行水解的反应尚未结束。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述反应的温度为35°C-40°C;所述反应的pH为7-8.5。
9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述金纳米团簇的保护基团为蛋白质；所述蛋白质具体为牛血清白蛋白；所述底物蛋白为牛血清白蛋白。
10.根据权利要求4-9中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述金纳米团簇中金原子与牛血清白蛋白的配比为IOmmol:30g。
全文摘要
本发明公开了一种利用金纳米团簇测定糜蛋白酶活性的方法。该方法主要体现在利用金纳米团簇测定待测样品中糜蛋白酶含量，具体包括如下步骤(a1)将糜蛋白酶标准品和待测样品分别与金纳米团簇进行反应，分别测定反应体系在反应前后的荧光强度，得到反应前后荧光强度的变化值；(a2)根据所述糜蛋白酶标准品的反应体系的反应前后荧光强度的变化值绘制标准曲线，将所述待测样品的反应体系的反应前后荧光强度的变化值代入所述标准曲线，从而得到所述待测样品中糜蛋白酶的含量。实验证明，本发明无需对糜蛋白酶作用底物进行荧光标记，能够实时检测糜蛋白酶对底物蛋白的水解过程，同时能够高灵敏的测定待测样品中糜蛋白酶的含量。
文档编号G01N21/64GK103196883SQ20131013687
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月19日 优先权日2013年4月19日
发明者方晓红, 张佳婧, 张振, 陈春英 申请人:中国科学院化学研究所