基于白光led的三色荧光检测仪的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于白光LED的三色荧光检测仪，采用白光LED作为激发光源，经光束杂散光滤除及整形组准直得到光亮度均匀的圆形平行光束，通过第一滤色镜组、分色滤色镜组、聚焦透镜组和第二滤色镜组所组成的分光光路，实现窄带激发光照射检测样本，光电倍增管探测面接受滤除杂光后的窄带荧光信号。本荧光检测装置以光二极管采样光源光强为检测样本信号参比，可以同时检测FITC，Cy3+，Cy5+三种荧光染料的荧光检测装置，整个装置结构紧凑，具有体积小、功耗低、灵敏度高和便携化的特点，实现对检测样本荧光强度的半定量分析，检测灵敏度可以达到2.5pg/ml荧光素钠标准。
【专利说明】基于白光LED的三色荧光检测仪
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种应用于生物医疗领域的荧光检测仪。
[0003]
【背景技术】
[0004]荧光检测主要用于生化分析，尤其分子生物学的荧光信号检测。当某些物质被可见光或者紫外光照射而激发时，会产生比激发光波长较长的发射光，通过测量荧光强度以及光谱范围可以定性和定量分析某种物质中的成分。
[0005]1852年，Stokes阐明了荧光发射机制:特定波长的光子碰撞到分子上，分子吸收光子，能量升高但不稳定，一般要通过释放吸收的能量回到基态，当激发态分子以光子形式向周围辐射能量而回到基态时，其所发出的光就称为荧光。
[0006]荧光产生的条件是分子必须在吸收一定频率范围的激发光后，通过振动驰豫回到第一激发态的最低能级，由此向下的辐射跃迁才可能产生荧光。因此，产生荧光的首要条件就是激发光的频率必须与分子的特征频率相一致，其次就是该分子必须具有一定程度的荧光效率。
[0007]荧光效率，也称荧光量子产率，它表示物质发射`荧光的本领，在相同强度的激发光下，荧光分子的量子效率越高，发射的荧光也就越强。其定义为物质吸光后发射的荧光光子数与吸收的激发光的光子数之比，即:
发射的光子数 吸收的光子数
荧光物质所发射的荧光强度与很多因素有关，包括环境因素(如温度、PH值、离子强度、与其它分子的共价耦合等)，特别是下面几个因素:
I)激发光的强度。一般情况下，激发光的强度越大，荧光的强度也越大，两者在一定范围内是线性关系。但在高强度激发光较长时间的照射下，会引起荧光物质发生一定程度的光漂白(Photo bleaching)现象或光损伤现象(Photo destruction),反而降低了突光的强度。
[0008]2)量子效率。在相同强度的激发光下,突光分子的量子效率越闻,发射的突光也就越强。
[0009]3)吸光系数。在相同强度的激发光下，荧光物质的吸光系数越大，发射的荧光越强。
[0010]4)荧光物质的染色浓度。当荧光物质的染色浓度较低时，荧光强度与染色浓度基本上是线性关系，当染色浓度较高时，突光物质会出现粹灭(Quenching)现象,反而降低了荧光的强度。
[0011]
【发明内容】
[0012]技术问题:本发明提供一种应用于生物分析的、结构紧凑、体积小、功耗低、灵敏度高和可便携化基于白光LED的三色荧光检测仪，，可在实验室环境或现场检测下，实现对检测样本荧光强度的半定量分析。
[0013]技术方案:本发明的一种基于白光LED的三色突光检测仪,包括沿入射光路依次设置的白光LED光源组、光束杂散光滤除及整形组、第一滤色镜组、分色镜组、聚焦透镜组、位于反射光路上的第二滤色镜组和光电倍增管组件，白光LED光源组和光束杂散光滤除及整形组置于遮光盖中，白光LED光源组、光束杂散光滤除及整形组、第一滤色镜组的光轴和分色镜组入射光轴重合，聚焦透镜组位于分色镜组一侧的出射光路上，第二滤色镜组和光电倍增管组件依次设置在分色镜组另一侧的出射光路上，聚焦透镜组和第二滤色镜组的光轴、光电倍增管组件的入射窗口中心均与分色镜组的发射光轴重合。
[0014]本发明中，白光LED光源组包括半球形白光LED、准直平凸透镜、45°反射型分光镜、聚焦透镜和光电二极管，准直平凸透镜设置在半球形白光LED的发射光出射方向，45°反射型分光镜的入射光轴与准直平凸透镜的光轴重合，聚焦透镜和光电二极管依次设置在45°分光镜反射方向下方，并且聚焦透镜和光电二极管的光轴均与45°反射型分光镜的反射光轴重合。
[0015]本发明中，光束杂散光滤除及整形组包括数值孔径为0.4^0.5、共光轴的第一凸透镜和第二凸透镜、位 于第一凸透镜和第二凸透镜之间的小孔光阑，第一凸透镜和第二凸透镜的数值孔径相同且焦点重合，小孔光阑设置在第一凸透镜和第二凸透镜的光轴上，且小孔光阑的中心与第一凸透镜和第二凸透镜的焦点重合。
[0016]本发明中，第一滤色镜组包括支架、设置在支架上的第一滤色镜盘、第一步进电机和第一光电开关，第一滤色镜盘上距中心等距设置三片第一滤色镜，三片第一滤色镜分别对467~498nm，513~556nm，604~644nm波段的激发光滤除杂光，第一步进电机与第一滤色镜盘连接并用于驱动其转动，实现对不同波段第一滤色镜的选择，第一光电开关用于识别第一滤色镜盘的位置。
[0017]本发明中，分色镜组包括支架、设置在支架上的三孔分色镜盘、第二步进电机和第二光电开关，三孔分色镜盘上距中心等距设置三片分色镜，三片分色镜的透射光波截止波长分别为506nm，562nm，660nm，第二步进电机与三孔分色镜盘连接并用于驱动其转动，实现对不同分色镜的选择，第二光电开关用于识别三孔分色镜盘的位置。
[0018]本发明中，聚焦透镜组包括与入射光成45°设置的反光镜、位于反光镜下方焦距为l(T50mm的第三凸透镜和控制第三凸透镜上下位移的步进电机，第三凸透镜的光轴与反光镜的反射光方向重合，第三凸透镜在步进电机的控制下能够沿光轴方向移动，实现对焦。
[0019]本发明中，第二滤色镜组包括支架、设置在支架上的第二滤色镜盘、第三步进电机和第三光电开关，第二滤色镜盘上距中心等距设置三片第二滤色镜，三片第二滤色镜分别对513~556nm，57(T613nm，672~712nm波段的发射光滤除杂光，第三步进电机与第二滤色镜盘连接并用于驱动其转动，实现对不同波段第二滤色镜的选择，第三光电开关用于识别第二滤色镜盘的位置。
[0020]本发明荧光检测仪的一个具体实施例中，激发光源采用恒流电路供电，用96孔板作为荧光检测样本的载体，光电倍增管采集生物样本被激发产生的荧光信号转化为电压信号，同时光电二极管实时采集半球形白光LED光强信号转化为电压信号，上述电压信号经低通滤波器后作为差分放大器的输入，经差分放大器处理输出的信号输入模数转换器，微处理单元对转换后的数字信号进行一定滤波算法处理，得到用于实验分析的原始数据。根据检测信号判定方法进一步分析，以数据或图表的形式显示检测结果，完成对生物样品的检测。
[0021]有益效果:本发明与现有技术相比，具有以下优点:
1、本荧光检测仪采用LED作为激发光源，恒流源电路供电，确保激发光源实时光强的稳定，光强波动范围在0.5%以下。对比采用激光器或卤钨灯作为光源，LED具有体积小、功耗低、发光效率高、寿命长的优点，减小了光源产生的热量和配套装置的体积，从而设计出结构紧凑的光路，为整个的系统的微型化和便携化打下基础。相比较光源采样反馈电路的延迟效应，恒流源硬件电路自主反馈调节，其输出电流恒定，保证激发光源实时光强的稳定。
[0022]2、由于LED的光衰和上述光强波动，光电倍增管采集的样本荧光信号值也会随之波动，造成实验结果缺乏可行度和可比性。本荧光检测仪采用高灵敏度光电二极管对光源采样，其输出电压信号作为光电倍增管的输出电压信号的参比，通过后续硬件路和算法的处理，排除光强波动对检测结果的影响，确保实验样本的检测结果具有可量化和可比性。
[0023]3、本荧光检测仪采用步进电机控制第三凸透镜沿光轴方向移动，实现对样本进行自动聚焦，检测时采用软件算法控制电机运行进行自动聚焦，确保检测仪对于不同体积量的样本具有通用性。
[0024]4、本荧光检测仪采用96孔板作为检测样本的载体，可实现一次性对96孔样本扫描检测，确保其具有高通量的特点。
[0025]5、本荧光检测仪采用结构紧凑的光路和机械设计，整个装置长宽高分别为30cm、30cm、15cm，重量为4kg，克服了现有荧光检测类仪器大型笨重的特点，实现了整个仪器的微型化和便携化，不但适用于实验室的环境下检测，而且可用于现场检测。用于生物医学工程领域，具有高灵敏度、低成本的特点，推动了其微型化和便携化的发展，填补了生物医药相关领域的空白。
[0026]
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1为本发明白光LED的三色荧光检测仪俯视结构示意图。
[0028]图2为白光LED光源组的侧视结构示意图。
[0029]图3为光束杂散光滤除及整形组的侧视结构示意图。
[0030]图4为第一滤色镜组的结构示意图。
[0031]图5为分色镜组的结构示意图。
[0032]图6为聚焦透镜组侧视结构示意图。
[0033]图7为第二滤色镜组示意图。
[0034]图8为本发明装置的光源采样和电源电路示意图
图中有:白光LED光源组1、光束杂散光滤除及整形组2、第一滤色镜组3、分色镜组4、聚焦透镜组5、第二滤色镜组6、光电倍增管组件7、底板8、遮光盖9、上盖板10、半球形白光LED11、准直平凸透镜12、45°反射型分光镜13、光电二极管14、聚焦透镜15、第一凸透镜21、第二凸透镜22、小孔光阑23、第一滤色镜盘31、步进电机32、光电开关33、第一滤色镜34、支架35，分色镜盘41、第二步进电机42、第二光电开关43、分色镜44、反光镜51、第三凸透镜52、步进电机53、第二滤色镜盘61、第三步进电机62、第三光电开关63、第二滤色镜64。
[0035]
【具体实施方式】
[0036]下面结合说明书附图和实施例对本发明做进一步具体说明。
[0037]参阅图1，本发明的基于白光LED的三色荧光检测仪，包括沿入射光路依次设置的白光LED光源组1、光束杂散光滤除及整形组2、第一滤色镜组3、分色镜组4、聚焦透镜组5、位于反射光路上的第二滤色镜组6和光电倍增管组件7，，还包括底板8、遮光盖9和上盖板10。白光LED光源组I和光束杂散光滤除及整形组2置于遮光盖9中，白光LED光源组1、光束杂散光滤除及整形组2、第一滤色镜组3的光轴和分色镜组4入射光轴重合，聚焦透镜组5位于分色镜组一侧的出射光路上，第二滤色镜组6和光电倍增管组7件依次设置在分色镜组4另一侧的出射光路上，聚焦透镜组5和第二滤色镜组6的光轴、光电倍增管组件7的入射窗口中心均与分色镜组4的发射光轴重合。
[0038]本发明的基于白光LED的三色荧光检测仪中，由白光LED光源组I发射出准直的白光，白光光束经光束杂散光滤除及整形组2后，得到光亮度均匀的圆形平行光束；该光束经过第一滤色镜组3滤波后，透过相应波段的激发光；分色滤色镜组4镜面与入射光呈45°角放置，对入射角度为45°的激发光高反，荧光高透；上述激发光投射到分色滤色镜组4后，被反射到聚焦透镜组5，由聚焦透镜组5聚焦到待检测的含有荧光染料标记的生物样品池；样品受激发光照射后产生的荧光，经过聚焦透镜组5原路返回至分色镜组4处，荧光透过分色镜组4，混杂的激发光被反射至光源方向；透过的荧光经第二滤色镜组6，进一步对杂光进行滤除，得到有效的窄带荧光信号；该荧光信号照射到光电倍增管组件7的探测面上，由光电倍增管将荧光信号转换成电压信号。同时光电二极管14采集半球形白光LED 11被45°反射型分光镜13反射的光强，转化为电压信号。上述电压信号经低通滤波器后作为差分放大器的输入，经差分放大器处理输出的信号输入模数转换器，微处理单元对转换后的数字信号进行一定滤波算法处理，得到用于实验分析的原始数据。根据检测信号判定方法进一步分析，以数据或图表的形式显示检测结果，完成对生物样品的检测。【具体实施方式】如下:
第一步，将白光LED光源组1、光束杂散光滤除及整形组2、第一滤色镜组3、分色镜组
4、聚焦透镜组5、第二滤色镜组6、光电倍增管组件7均固定在底板8上，保证白光LED光源组I的光轴、光束杂散光滤除及整形组2的光轴、第一滤色镜组3光轴和分色镜组4入射光轴重合，保证聚焦透镜组5的光轴、分色镜组4反射光轴、第二滤色镜组6光轴和光电倍增管组件7光轴重合。
[0039]第二步，白光LED光源组I发射准直的白光，白光经过光束杂散光滤除及整形组2后，得到光强分布均匀的圆形光束，遮光盖9与底板8配合，将白光LED光源组I和杂散光滤除及整形组2罩住，圆形光束由遮光盖9的圆孔射出。
[0040]第三步，出射光束经过第一滤色镜组3后，经过滤波得到相应波段的激发光，投射到分色镜组4后，分色镜组4中三片分色镜44的镜面与入射光呈45°角放置，三片分色镜44的透射光波截止波长分别为506nm, 562nm, 660nm,小于该截止波长的就全反射,等于大于截止波长的就透射。分色镜组4对入射角度为45°的激发光高反，荧光高透，激发光透射到聚焦透镜组5，由聚焦透镜组5将激发光聚焦到待检测的含有荧光染料标记的生物样本表面。
[0041]第四步，样本受激发光照射后，产生荧光，再经过聚焦透镜组5原路返回至分色镜组4处，初步滤除激发光，荧光透过分色镜组4，再经第二滤色镜组6，进一步对荧光中杂光滤除，得到有效的荧光信号，有效的荧光信号照射到光电倍增管组7的探测面上。
[0042]第五步，计算机软件通过串口通信的方式发送指令至微控制器，一方面经硬件电路控制第一滤色镜组3、第二滤色镜组6和分色镜组4的步进电机转动选择实验所需的镜片组合；另一方经硬件电路控制白光LED光源组1、光电倍增管组7的开启，白光LED光源组I光强，可编程放大器的放大倍数以及生物样本的读取次数等实验参数。根据实验的实际需要，控制电机转动和配置相关参数，实现对特定生物样本，特定检测条件的荧光检测。
[0043]第六步，由恒流源电路为白光LED光源组I提供电源，保证激发光源实时光强的稳定。光电倍增管采集生物样本被激发产生的荧光信号转化为电压信号，同时光电二极管实时采集半球形白光LED光强信号转化为电压信号，上述电压信号经低通滤波器后作为差分放大器的输入，经差分放大器处理输出的信号输入模数转换器，微处理单元对转换后的数字信号进行一定滤波算法处理，得到用于实验分析的原始数据。根据检测信号判定方法进一步分析，以数据或图表的形式显示检测结果，完成对生物样品的检测。
[0044]下面通过具体实施例进一步介绍本发明装置:
白光LED光源组I中的LED为半球形白光LED，发光功率为3W，其准直透镜的焦距为12.7mm，直径为12.7mm,反射镜的反射率为4%，光电二极管的光敏面积为3.6mmX 3.6mm ；光束杂散光滤除及整形组2中的两个凸透镜的焦距均为为20mm，直径为12.7mm，小孔光阑的小孔直径为Imm;第一滤色镜组3的三个滤波片直径均为12mm，滤波范围分别为467?498nm，513?556nm，604?644nm ;分射镜组4的三个分色片直径均为15臟，分光截止光波长分别为506nm, 562nm, 660nm ;第二滤色镜组6的三个滤波片直径均为12mm,滤波范围分别为513?556nm，57(T613nm，672?712nm ;聚焦透镜组5的反射镜直径为14mm的金属银反射镜，聚焦透镜的直径为12.7mm，焦距为12.7mm ;光电倍增管组7中的PMT型号为CR194。参照上述实施方式，检测灵敏度可以达到2.5pg/ml荧光素钠(标准)。
【权利要求】
1.一种基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，该检测仪包括沿入射光路依次设置的白光LED光源组(I)、光束杂散光滤除及整形组(2)、第一滤色镜组(3)、分色镜组(4)、聚焦透镜组(5)、位于反射光路上的第二滤色镜组(6)和光电倍增管组件(7)，所述白光LED光源组(I)和光束杂散光滤除及整形组(2)置于遮光盖(9)中，白光LED光源组(I)、光束杂散光滤除及整形组(2)、第一滤色镜组(3)的光轴和分色镜组(4)入射光轴重合，所述聚焦透镜组(5)位于分色镜组(4) 一侧的出射光路上，第二滤色镜组(6)和光电倍增管组件(7)依次设置在分色镜组(4)另一侧的出射光路上，聚焦透镜组(5)和第二滤色镜组(6)的光轴、光电倍增管组件(7)的入射窗口中心均与分色镜组(4)的发射光轴重合。
2.根据权利要求1所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述白光LED光源组(I)包括半球形白光LED (11)、准直平凸透镜(12)、45°反射型分光镜(13)、光电二极管(14)和聚焦透镜(15)，所述准直平凸透镜(12)设置在半球形白光LED (11)的发射光出射方向，45°反射型分光镜(13)的入射光轴与准直平凸透镜(12)的光轴重合，聚焦透镜(15)和光电二极管(14)依次设置在45°分光镜(13)反射方向下方,并且聚焦透镜(15)和光电二极管(14)的光轴均与45°反射型分光镜(13)的反射光轴重合。
3.根据权利要求1所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述光束杂散光滤除及整形组(2)包括数值孔径为0.4^0.5、共光轴的第一凸透镜(21)和第二凸透镜(22)、位于所述第一凸透镜(21)和第二凸透镜(22)之间的小孔光阑(23)，所述第一凸透镜(21)和第二凸透镜(22)的数值孔径相同且焦点重合，小孔光阑(23)设置在第一凸透镜(21)和第二凸透镜(22)的光轴上，且小孔光阑(23)的中心与第一凸透镜(21)和第二凸透镜(22)的焦点重合。
4.根据权利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述第一滤色镜组(3)包括支架、设置在所述支架上的第一滤色镜盘(31)、第一步进电机(32)和第一光电开关(33)，所述第一滤色镜盘(31)上距中心等距设置三片第一滤色镜(34)，所述三片第一滤色镜(34)分别对467~498nm，513~556nm，604~644nm波段的激发光滤除杂光，所述第一步进电机(32)与第一滤色镜盘(31)连接并用于驱动其转动，实现对不同波段第一滤色镜(34)的选择，所述第一光电开关(33)用于识别第一滤色镜盘(31)的位置。
5.根据权利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述分色镜组(4)包括支架、设置在所述支架上的三孔分色镜盘(41)、第二步进电机(42)和第二光电开关(43)，所述三孔分色镜盘(41)上距中心等距设置三片分色镜(44)，所述三片分色镜(44 )的透射光波截止波长分别为506nm，562nm, 660nm,所述第二步进电机(32 )与三孔分色镜盘(41)连接并用于驱动其转动，实现对不同分色镜(44)的选择，所述第二光电开关(33)用于识别三孔分色镜盘(41)的位置。
6.根据权利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述聚焦透镜组(5)包括与入射光成45°设置的反光镜(51)、位于反光镜(51)下方焦距为l(T50mm的第三凸透镜(52)和控制第三凸透镜上下位移的步进电机(53)，所述第三凸透镜(52)的光轴与反光镜(51)的反射光方向重合，第三凸透镜(52)在步进电机(53)的控制下能够沿光轴方向移动，实现对焦。
7.根据权利要求1、2或3所述的基于白光LED的三色荧光检测仪，其特征在于，所述第二滤色镜组(6)包括支架、设置在所述支架上的第二滤色镜盘(61)、第三步进电机(62)和第三光电开关(63)，所述第二滤色镜盘(61)上距中心等距设置三片第二滤色镜(64)，所述三片第二滤色镜(64)分别对513~556nm，57(T613nm，672~712nm波段的发射光滤除杂光，所述第三步进电机(62)与第二滤色镜盘(61)连接并用于驱动其转动，实现对不同波段第二滤色镜(64)的选择， 所述第三光电开关(63)用于识别第二滤色镜盘(61)的位置。
【文档编号】G01N21/64GK103487375SQ201310436904
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】何农跃, 夏云, 王炜, 李智洋, 马嫚, 谷鹏阳 申请人:东南大学