一种核酸碱基或其衍生物的自组装体系的表征方法
【专利摘要】本发明提供了一种核酸碱基或其衍生物的自组装体系的实时在线的表征方法。本发明提供的方法是利用本发明提供的进样及离子化装置，结合使用V-EASI为电离源，对溶液中的核酸碱基或其衍生物的自组装体系进行质谱表征的。本发明提供的方法可直接给出自组装分子结构信息，以及实时在线监测溶液中分子的自组装行为。
【专利说明】一种核酸碱基或其衍生物的自组装体系的表征方法
【技术领域】
[0001]本发明属于质谱分析领域，具体涉及一种自组装体系的表征方法。
【背景技术】
[0002]自组装过程是若干个体之间同时自发的发生关联并集合在一起形成一个紧密有序的整体，是一种整体的复杂的协同作用。小分子依靠各种分子间弱相互作用，通过“由下而上”的方式逐级组装构筑成我们丰富多彩的世界。
[0003]核酸作为遗传信息的承载者，在生物体的遗传变异以及蛋白质的合成中具有不可替代的重要作用。研究发现人体DNA末端存在着含有大量鸟嘌呤的碱基序列，它们会以Hoogsteen氢键的形式自组装形成G-四链体的结构,这种结构与在端粒形成中具有重要作用。
[0004]在碱基自组装体系的表征过程中，核磁共振技术(Nuclear MagneticResonance, NMR)是一种重要的表征方法。通过NMR方法可证明，2个具有手性性质的G-quartet堆积而形成的G8-M+的非对映异构体有6种；而对5’ -GMP与Na+形成的碱基簇的研究则发现，该结构只存在两种稳定的非对映异构体，这说明碱基在自组装的过程中有着高度的立体选择性。圆二色谱法(Circular Dichroism,⑶)能灵敏的反映G四链体结构中链的排列方向，从而区分平行与反平行的不同构象，而其特定吸收峰为确定四链体结构的拓扑结构提供了有用的信息。IR和UV-vis技术可以反映碱基在形成团簇离子前后是否发生了结构变化。理论计算为碱基团簇离子的结构的确定提供了重要的信息。上述方法在研究碱基簇的结构和稳定性方面都发挥了重要的作用。但上述方法在直接给出自主装分子结构信息，以及实时在线监测自组装过程中均存在一定缺陷，因而需要寻找新方法改善该自主装体系的表征。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种核酸碱基或其衍生物的自组装体系的表征方法。
[0006]本发明所述的方法是使用V-EASI为电离源，对核酸碱基自组装体系进行质谱表征的。
[0007]本发明的一个目的是提供一种进样及离子化装置，所述装置由下述部分组成:
[0008]喷雾毛细管⑵；
[0009]N2 入口 (3)；
[0010]样品传输管I⑷;
[0011]反应器(5)；
[0012]与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)，所述盖子顶端设有孔I (8)；
[0013]T形三通阀(11);
[0014]所述N2入口(3)与所述T形三通阀(11)的纵口相连接；所述样品传输管I (4)穿过所述T形三通阀(11)的横向的两个接口 ；所述样品传输管1(4)的一端管口与所述喷雾毛细管(2 )连接，另一端管口通过与所述反应器(5 )配套使用的盖子(7 )顶端上的孔1(8)插入所述反应器(5)。
[0015]所述装置还包括样品传输管2 (9)和注射器(6);所述注射器(6)的针头插入样品传输管2 (9)的一端管口 ；所述盖子顶端还设有孔2 (10);所述样品传输管I (9)的另一端管口通过与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)顶端上的孔2 (10)插入所述反应器(5)。
[0016]所述注射器(6)为液相进样针，规格:500 μ L。
[0017]所述装置还包括搅拌器和磁子；将所述反应器(5)置于搅拌器上；将磁子置于所述反应器(5)内。
[0018]所述N2入口(3)为不锈钢毛细管,所述不锈钢毛细管内径为400-700 μ m,外径为1200-1600 μ m，长度4-lOcm ;优选的，所述不锈钢毛细管内径为550 μ m，外径为1588 μ m，长度 5.5cm ；
[0019]所述喷雾毛细管(2)为不锈钢毛细管，所述不锈钢毛细管内径为500-550 μ m,外径为1300-1588 μ m，长度5.5cm;优选的，所述不锈钢毛细管内径为550 μ m，外径为1588 μ m ；
[0020]所述样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)为内径50-75 μ m、外径300-365 μ m的石英毛细管；优选的，所述样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)为内径75 μ m、外径365 μ m的石英毛细管；
[0021]所述样品传输管I (4)的一端管口与所述喷雾毛细管(2)连接，具体指样品传输管I (4)的一端管口缩进所述喷雾毛细管(2)的0.2-0.5mm;优选的，样品传输管I (4)的一端管口缩进所述喷雾毛细管(2)的0.2mm ；
[0022]使用医用穿刺针作为样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)的保护套管，具体指将样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)插入医用穿刺针的针筒内；
[0023]或，使用聚四氟乙烯管作为样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)的保护套管，具体指将样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)从聚四氟乙烯管的一端管口插入，并使得样品样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)完全置于聚四氟乙烯管内。
[0024]所述聚四氟乙烯管规格Φ3πιπι ;所述医用穿刺针型号14-20号；优选的，所述医用穿刺针型号为16号。
[0025]本发明的另一个目的是提供任一所述装置在质谱进样和/或质谱检测中的应用。
[0026]本发明的还一个目的是提供任一所述装置在质谱进样和/或质谱检测溶液中可发生自组装行为的分子样品中的应用。
[0027]所述应用中，所述溶液中可发生自组装行为的分子具体为核酸碱基或其衍生物
[0028]所述应用中，所述核酸碱基或其衍生物具体为6-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶。
[0029]本发明的再一个目的是提供一种核酸碱基或其衍生物自组装体系的表征方法，是使用V-EASI为电离源，对核酸碱基自组装体系进行质谱表征的。
[0030]所述方法中，所述质谱表征时，采用权利要求1-5任一所述的装置进行进样及离子化。
[0031 ] 所述方法包括下述步骤:
[0032]I)采用权利要求1-5任一所述的装置进行进样及离子化:具体为将待测核酸碱基或其衍生物溶液置于制样装置的反应器(5)中，将氮气开启，在文丘里作用下，反应器(5)中的溶液样品被抽提出溶液体系，到达喷雾毛细管(2)出口处即喷雾口，实现喷雾，形成气溶胶；
[0033]所述氮气压力为0.5-1.0MPa，样品流速为10-20 μ L/min ;优选的，所述氮气压力为0.5MPa，样品流速为10 μ L/min ；
[0034]所述待测核酸碱基或其衍生物溶液的配制方法为:配置前，先分别以甲醇为溶剂配制成待测核酸碱基或其衍生物浓度为5X10 —3M的储备液以备使用，实验中用甲醇和水(甲醇与水的体积比为1:1)做溶剂，将储备液稀释至3X10 —4M ;所述待测核酸碱基或其衍生物具体为6-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶和/或尿嘧啶；
[0035]2)采用可使用V-EASI为电离源的质谱仪进行检测，具体检测过程为:步骤I)产生的气溶胶进入质谱采样口，进行质谱检测；所述质谱检测的条件为:质谱毛细管温度150-250°C，离子入射时间20-50ms，微扫描次数1_2次；优选的，所述毛细管温度250°C，离子入射时间50ms,微扫描次数2次；
[0036]所述喷雾口与质谱采样口持平，喷雾口与质谱进样口之间的距离为5_15mm ;优选的，喷雾口与质谱进样口之间的距离为10mm。
[0037]3)根据所得的质谱图判断待测核酸碱基或其衍生物的自组装体情况。
[0038]当检测其它离子对待测核酸碱基或其衍生物自组装行为的影响时，所述步骤I)中还包括下述步骤:
[0039]将含其它离子的溶液置于权利要求1-5任一所述的装置的注射器(6)中，将注射器(6)中溶液注入反应器(5)中的待测核酸碱基或其衍生物溶液中，同时对反应器(5)中的溶液进行搅拌，以保证所述离子能迅速均匀地在溶液中扩散，使体系各部分的组分均一。
[0040]为了避免加入的其它离子溶液的体积对体系内的碱基浓度造成影响，对离子溶液可采取“小体积，大浓度”的进样方式。
[0041]所述注入速度具体为10 μ L/min。
[0042]所述含其它离子的溶液的配制方法具体为:以水为溶剂，配制成所述其它离子浓度为0.5M的溶液。
[0043]所述含其它离子的溶液具体可为NaCl、KCl和/或NH4Cl溶液。
[0044]本发明提供的方法是利用本发明提供的进样及离子化装置，结合使用V-EASI电离源，对溶液中的核酸碱基或其衍生物的自组装体系进行质谱表征的，该方法操作简单，装置成本低，不需要样品处理和提取，直接实时取样分析，从而实时给出反应体系的分子构成变化信息，为自组装反应的实时在线监测提供了一个新途径。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]图1为V-EASI实时在线分析装置的制样装置的结构简图(a)和检测实景图(b)。
[0046]图2为普通ES1-MS检测结果。
[0047]图3为V-EASI实时在线分析结果图；其中图(a)-(c)分别依次为正离子模式下6MU、T、U的质谱图，其中(c)的内插图为m/z 100-600的放大图；图(d)-(f)分别依次为负离子模式下6MU、T、U的质谱图。
[0048]图4为碱基四聚体结构示意图(a)和碱基五聚体结构示意图(b)。[0049]图5为将K+加入6MU碱基溶液过程中，14种团簇离子的选择离子流图。
[0050]图6为将K+加入6MU碱基溶液过程中，不同时间段6MU团簇离子的质谱图；图
(a)- (d)依次分别为 0.7min、2.5min、4.3min、7.8min 时的质谱图。
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]6-甲基尿 U密 P定(6_me thy lurac i I，6MU, 9 7% ),胸腺 U密 P定(thymine, T, 97%, Mw=126.11)和尿嘧啶(uracil, U, 99+%, Mw=I 12.09)均购于阿尔法埃莎化学有限公司(天津)。
[0054]NaCl (分析纯)，KCl (分析纯)和NH4C1 (分析纯)购于北京化工厂(北京)。
[0055]甲醇(HPLC级)购于光谱化学有限公司(不伦瑞克，德国)。
[0056]实验过程所用水均为超纯水,经Mill1-Q超纯水净化系统处理而成。所用高纯氮气购于北京千禧京城气体销售中心。
[0057]所有样品在使用前均未进行纯化。
[0058]下述实施例中所用的仪器有LTQ线性离子讲质谱仪(Thermo Fisher Scientific,美国)，三维移动平台(北京智控达自动化设备有限公司，北京)，79-1型磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司，金坛)。
[0059]下述实施例中所述的V-EAS1-MS具体指文丘里常压超声喷雾电离源质谱(Venturi Easy Ambient Sonic-Spray 1nization Mass Spectrometry)
[0060]实施例1、用V-EAS1-MS在正、负离子模式下分别表征结构相似的三种碱基形成的自组装体系
[0061](一)待测样品溶液的配制
[0062]分别配制6-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶3种核酸碱基溶液:3种核酸碱基溶液配置前，先分别以甲醇为溶剂配制成碱基浓度均为5 X 10 — 3M的储备液以备使用，实验中用甲醇和水(甲醇与水的体积比为1:1)做溶剂，将储备液分别稀释至3 X 10 一 4M。
[0063](二)V-EAS1-MS 检测过程
[0064]V-EASI实时在线分析装置的制样装置原理图和检测实景图分别见图1 (a)-(b)，其中进样及离子化装置包括:喷雾毛细管⑵；N2入口⑵；样品传输管1(4);反应器(5)；注射器(6);与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)，所述盖子顶端设有孔I (8)和孔2(10)；样品传输管2 (9)汀形三通阀(11)。
[0065]所述喷雾毛细管(2)为不锈钢管,所述不锈钢管的内径550μηι,外径1588μηι,长度5.5cm ;所述N2入口 3为不锈钢毛细管,不锈钢毛细管内径为550 μ m,外径为1588 μ m,长度5.5cm ;所述样品传输管4和9为内径75 μ m、外径365 μ m的石英毛细管。注射器6为液相进样针(规格:500 μ L)。
[0066]所述N2入口(3)与所述T形三通阀(11)的纵口相连接；所述样品传输管I (4)穿过所述T形三通阀(11)的横向的两个接口 ；所述样品传输管I (4)的一端管口与所述喷雾毛细管(2)连接，另一端管口通过与所述反应器(5)配套使用的盖子顶端上的孔I (8)插入所述反应器(5)。所述注射器(6)的针头插入样品传输管2 (9)的一端管口；所述样品传输管2 (9)的另一端管口通过与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)顶端上的孔2 (10)插入所述反应器(5)。所述反应器(5)置于搅拌器上；将磁子置于所述反应器(5)内。
[0067]所述样品传输管I (4)的一端管口与所述喷雾毛细管2连接，具体指样品传输管I (4)的一端管口缩进所述喷雾毛细管2的0.2mm ；
[0068]使用医用穿刺针作为样品传输管I (4)的保护套管，具体指将样品传输管I (4)插入医用穿刺针的针筒内；所述医用穿刺针型号16号。
[0069]使用聚四氟乙烯管作为样品传输管2 (9)的保护套管，具体指将样品传输管2 (9)从聚四氟乙烯管的一端管口插入，并使得样品传输管2 (9)完全置于聚四氟乙烯管内。所述聚四氟乙烯管规格Φ3πιπι。
[0070]根据LTQ线性离子阱质谱仪的使用说明书进行下述操作。
[0071]1、正离子模式下的检测:
[0072]I) 6-甲基尿嘧啶的自组装行为
[0073]采用上述的制样装置，将上述配制好的浓度为3 X 10_4Μ的6-甲基尿嘧啶碱基溶液IOOml置于反应器(5)中，将氮气开启，氮气压力为0.5MPa，则在文丘里作用下，反应器(5)中的核酸碱基溶液样品被抽提出溶液体系，到达喷雾毛细管(2)出口处即喷雾口，实现喷雾，形成气溶胶。产生的气溶胶进入质谱采样口(I)进行检测。其中，喷雾口与质谱采样口(I)持平，喷雾口与质谱进样口( I)之间的距离为10mm。
[0074]V-EASI质谱检测条件如下:毛细管温度250°C，离子入射时间50ms，微扫描次数2次。
[0075]2)采用与上述I)同样的方法分别检测胸腺嘧啶、尿嘧啶的自组装行为。
[0076]3)对比试验:为了和V-EASI结果对比，还利用商品化的ESI源(LTQ线性离子阱质谱仪自带)对三种碱基在正离子模式下进行了检测，采用常规的制样方法进行常规的ESI质谱检测，主要的实验参数如下:检测模式:正离子模式；毛细管温度250°C，喷雾电压4.0kV,载气气压0.5MPa，样品流速5 μ L/min，离子入射时间50ms，微扫描次数2次；结果见图2。
[0077]如图2所示，在ESI电离条件下，三种碱基均能在气相中形成团簇离子。与V-EASI结果类似，三种样品中6MU最容易形成碱基团簇离子，而U形成团簇离子的趋势最小。ES1-MS谱图中，三种碱基的单体和二聚体的准分子离子峰的信号比较强，如[6MU+H] + (m/zl27), [6MU2+H] + (m/z253), [T+H].(m/zl27)，[T2+H] + (m/z253)，[U+H].(m/zll3)，[U2+H].(m/z225)，而团簇离子的信号相对较弱，尤其在6MU和T的质谱图中，聚集数目高于五的碱基簇离子没有被检测到，而对溶解度较差的U的检测结果中，[U4+Na]+和[U5+NH4]+的信号强度较弱。
[0078]整个实验中，所有质谱数据的采集和处理使用Xcalibur 2.0软件。
[0079]2、负离子模式下的检测:
[0080]采用与上述正离子模式下的检测同样的方法，在负离子模式下，分别检测6-甲基尿嘧啶在、胸腺嘧啶、尿嘧啶的自组装行为。
[0081]整个实验中，所有质谱数据的采集和处理使用Xcalibur 2.0软件。
[0082](三)V-EAS1-MS的表征结果
[0083]图3是V-EAS1-MS检测所得的质谱图，其中图3a_3c分别是正离子模式下6_甲基尿嘧啶(6MU)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)溶液的检测结果；图3d-3f分别是负离子模式下6-甲基尿嘧啶(6MU)，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)溶液的检测结果。
[0084]表1列出了图3a_3f所对应的离子信号峰。表1中，6MU、T、U的下角标数字表不其聚合度。
[0085]表1正负离子模式下碱基离子簇形成情况
【权利要求】
1.一种进样及离子化装置，所述装置由下述部分组成: 喷雾毛细管(2); Ν2ΛΠ (3)； 样品传输管I⑷； 反应器(5)； 与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)，所述盖子顶端设有孔I (8)； T形三通阀(11)； 所述N2入口(3)与所述T形三通阀(11)的纵口相连接；所述样品传输管I (4)穿过所述T形三通阀(11)的横向的两个接口 ；所述样品传输管1(4)的一端管口与所述喷雾毛细管(2 )连接，另一端管口通过与所述反应器(5 )配套使用的盖子(7 )顶端上的孔I (8 )插入所述反应器(5)。
2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于:所述装置还包括样品传输管2(9)和注射器(6);所述注射器(6)的针头插入样品传输管2 (9)的一端管口 ；所述盖子顶端还设有孔2 (10);所述样品传输管I (9)的另一端管口通过与所述反应器(5)配套使用的盖子(7)顶端上的孔2 (10)插入所述反应器(5)。
3.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于:所述装置还包括搅拌器和磁子；将所述反应器(5)置于搅拌器上；将磁子置于所述反应器(5)内。
4.根据权利要求1-3任一所述的装置，其特征在于: 所述N2入口(3)为不锈钢毛细管，所述不锈钢毛细管内径为400-700 μ m,外径为1200-1600 μ m，长度4-lOcm ;优选的，所述不锈钢毛细管内径为550 μ m，外径为1588 μ m，长度 5.5cm ； 所述喷雾毛细管(2)为不锈钢毛细管,所述不锈钢毛细管内径为500-550μηι,外径为1300-1588 μ m，长度5.5cm ;优选的，所述不锈钢毛细管内径为550 μ m，外径为1588ym ； 所述样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)为内径50-75 μ m、外径300-365 μ m的石英毛细管；优选的，所述样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)为内径75μπκ外径365μπι的石英毛细管； 所述样品传输管I (4)的一端管口与所述喷雾毛细管(2)连接，具体指样品传输管I(4)的一端管口缩进所述喷雾毛细管(2)的0.2-0.5mm ;优选的，样品传输管I (4)的一端管口缩进所述喷雾毛细管(2)的0.2mm ； 使用医用穿刺针作为样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)的保护套管，具体指将样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)插入医用穿刺针的针筒内； 或，使用聚四氟乙烯管作为样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)的保护套管，具体指将样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)从聚四氟乙烯管的一端管口插入，并使得样品样品传输管I (4)或样品传输管2 (9)完全置于聚四氟乙烯管内。
5.权利要求1-4任一所述的装置在质谱进样和/或质谱检测中的应用。
6.权利要求1-4任一所述的装置在质谱进样和/或质谱检测溶液中可发生自组装行为的分子样品中的应用。
7.—种核酸碱基或其衍生物自组装体系的表征方法，是使用V-EASI为电离源，对核酸碱基自组装体系进行质谱表征的。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述质谱表征时，采用权利要求1-5任一所述的装置进行进样及离子化。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:包括下述步骤: O采用权利要求1-5任一所述的装置进行进样及离子化:具体为将待测核酸碱基或其衍生物溶液置于制样装置的反应器(5)中，将氮气开启，在文丘里作用下，反应器(5)中的溶液样品被抽提出溶液体系，到达喷雾毛细管(2)出口处即喷雾口，实现喷雾，形成气溶胶； 2)采用可使用V-EASI为电离源的质谱仪进行检测，具体检测过程为:步骤I)产生的气溶胶进入质谱采样口，进行质谱检测；所述质谱检测的条件为:质谱毛细管温度150-250°C，离子入射时间20-50ms，微扫描次数1_2次；优选的，所述毛细管温度250°C，离子入射时间50ms,微扫描次数2次； 3)根据所得的质谱图判断待测核酸碱基或其衍生物的自组装体情况。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:当检测其它离子对待测核酸碱基或其衍生物自组装行为的影响时，所述步骤I)中还包括下述步骤: 将含其它离子的溶液置于权利要求1-5任一所述的装置的注射器(6)中，将注射器(6)中溶液注入反应器(5)中的待测核酸碱基或 其衍生物溶液中，同时对反应器(5)中的溶液进行搅拌，以保证所述离子能迅速均匀地在溶液中扩散，使体系各部分的组分均一。
【文档编号】G01N27/64GK103558285SQ201310491665
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】欧阳津, 那娜, 石蕊霞 申请人:北京师范大学