用于农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法和检测装置制造方法
【专利摘要】本发明提供一种准确度好，灵敏度高的用于液体中农药残留检测的免疫阻抗生物传感器的检测方法和装置，该方法是把抗体交联在工作电极上；测定固定抗体与不同浓度标准农药作用后阻抗值，制定标准曲线，再测量待测农药与固定抗体作用后阻抗值，与标准曲线比较而得出待测农药中的农药含量。该装置包括注射泵、转盘、电解槽、排出泵、工作电极、对电极和参比电极；转盘内有电解液通道、磷酸盐缓冲液通道、待测样本通道、电极清洗通道、电极预处理通道、抗体注入通道；各通道入口和出口分别位于转盘同一圆周上；转盘绕中心转动时，一通道入口和出口同时分别与注射泵出口、电解槽入口相通；电解槽出口与排出泵入口相通。该装置可反复使用，重复性好，能保证检测的一致性。
【专利说明】用于农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法和检测装置
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种对农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法和检测装置。
【背景技术】
[0002]各国政府不断加强农药残留量的监测工作，制定的标准越来越严格。农药残留检测和定量分析的常规方法是色谱、色谱-质谱联用等。这些方法的测定结果准确可靠，是当前农残分析的主流技术。但这些方法也存在仪器较昂贵，前处理时间长、过程烦琐等不足，只适合于在专业实验室中使用。目前，国内市场上的农药速测方法以酶抑制法应用较多，它是利用农药对某些特定酶，特别是胆碱酯酶的抑制作用，通过对比检测水解后的底物或水解产物，以比色或分光光度分析的方法判定酶是否被抑制，从而测定农药残留。这种方法快速、简单、方便，但也存在如下不足:
1、只能检测农药的总残留量，不能够区分具体农药的种类；
2、显色不稳定，容易受周围环境、温度等影响，给判断带来误差；
3、检测精密度不高，易出现假阳性、假阴性结果；
4、酶反应条件苛刻,对操作要求高；
中国专利ZL 01253887.6公开了探测农药残留用的量热式生物传感器，它是通过测量流经固定化酶柱的待测液体的温度变化来检测待测液体中的农药含量。其不足之处在于:结构复杂，所用的固定化酶柱要求高。国际上研究快速检测农药的生物传感器论文在也有发表，主要还是基于酶生物传感器，未见有用于检测农药的免疫阻抗生物传感器。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种用于液体中农药残留检测的免疫阻抗生物传感器的检测方法，它可以快速测定目标农药在样品中的残留量，准确度好，灵敏度高。
[0004]本发明的用于农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法，使用免疫阻抗生物传感器检测装置，免疫阻抗生物传感器检测装置包括与阻抗分析仪电连接的工作电极、对电极和参比电极伸入到电解槽内；阻抗分析仪与计算机相连；该检测方法包括下述步骤:
a.电极清洗
以清洗物质对工作电极、对电极和参比电极进行清洗；
b.电极预处理
以硅烷溶液对电极处理；再以甲醇和水清洗电极去除非特异性吸附；
c.抗体固定
把农药抗体溶液注入电解槽内，使抗体通过交联固定在工作电极上；以磷酸盐缓冲液和去离子水，对电极进行清洗；
d.阻抗测试
把待测液体样本注入电解槽，使得待测液体样本与电极上的固定抗体发生特异性反应；然后以磷酸盐缓冲液通清洗电极，再把含有[Fe (CN) 6] 3_或者[Fe (CN) 6] 4_的电解液注入电解槽内，然后以阻抗分析仪和计算机检测并计算出电解液的法拉第阻抗；
e.数据分析
对不同浓度的农药标准溶液，分别按照上述a-d步骤，得到与各浓度的农药相应的法拉第阻抗，制定农药浓度与拉第阻抗的标准曲线；将待测液体样本按照上述a-d步骤得到的法拉第阻抗，根据标准曲线判断待测液体样本中的农药浓度。
[0005]上述的检测方法，步骤a中，对电极清洗时，分别以丙酮、乙醇和去离子水进行清洗，再以1:1:5 (ν/ν) Η202/ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分钟后，再以去离子水冲洗，后通入氮气干燥；
步骤b中，硅烷溶液为3-氨丙基三乙氧基硅烷；
步骤c中，含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中含有体积比为1%的牛血清白蛋白，磷酸盐缓冲液的PH值为7.4;
步骤d中，电解液中，[Fe(CN)6] 3_与[?6(0的6] 4_的浓度比1:1;法拉第阻抗测试频率IHz -1OOkHz，振幅为 ±5mV0
[0006]本发明的有益效果:本发明的检测方法是以流动注射的方式，将农药抗体固定在工作电极上，作为生物传感器的敏感元件。固定抗体与溶液中的农药抗原发生特异性结合后，在电极表面形成“抗原一抗体”的复合物，改变双电层的电荷转移和表面层的电阻。通过测定固定抗体与不同浓度标准农药作用后系统的阻抗值的变化，制定标准曲线，再测量待测农药与固定抗体作用后的阻抗值，并与标准曲线比较，从而得出待测农药中的目标农药的含量。本发明的检测方法快速、简单、方便，同时准确度高，灵敏度高，重复性好。
[0007]本发明同时提供一种为在上述检测方法中使用的免疫阻抗生物传感器检测装置，它结构简单、制作方便、成本低廉，可以反复使用，重复性好，能够保证检测的一致性。
[0008]本发明的在上述检测方法中使用的免疫阻抗生物传感器检测装置，包括注射泵、转盘、电解槽、排出泵；与阻抗分析仪电连接的工作电极、对电极和参比电极伸入到电解槽内；阻抗分析仪与计算机相连；转盘内具有沿着径向延伸的6条通道:电解液通道、磷酸盐缓冲液通道、待测样本通道、电极清洗通道、电极预处理通道、抗体注入通道；6条通道的入口和出口分别位于转盘的同一圆周上；当转盘绕中心转动时，一通道的入口和出口同时分别与注射泵的出口、电解槽的入口相通；电解槽的出口与排出泵的入口相通。
[0009]所述的免疫阻抗生物传感器检测装置，还包括与排出泵的出口相通的废液池。
[0010]所述的免疫阻抗生物传感器检测装置，工作电极为盘阵微电极或叉指式带列微电极。
[0011]本免疫阻抗生物传感器检测装置的有益效果:使用时，均使用注射泵泵入各种物质；而且通过转盘的转动，能够使得不同的通道分别与注射泵和电解槽相通，以通过不同的通道注入不同的物质，保证检测步骤的一致性和重复性，使用检测的结果准确性高。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是免疫阻抗生物传感器检测装置的示意图；
图2是免疫阻抗生物传感器检测装置的原理框图。
[0013]图3是电解槽的等效电路图。[0014]图4是对硫磷农药浓度一阻抗标准曲线。
【具体实施方式】
[0015]参见图1、2所示的用于农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测装置，由驱动系统、进样系统、反应系统、检测系统、控制系统组成。驱动系统由注射泵1，排出泵10组成，进样系统由转盘2、导管3组成，电解槽4的反应系统，检测系统由工作电极5，对电极6，参比电极7组成，控制系统由阻抗分析仪8，计算机9组成，从电解槽的出口流出的废液经排出泵10排入废液池11。工作电极可以为叉指式带列微电极或者盘阵微电极(圆盘电极)，对电极为钼电极，参比电极为Ag/AgCl电极。
[0016]与阻抗分析仪电连接的工作电极5、对电极6和参比电极7伸入到电解槽内；阻抗分析仪与计算机相连。转盘2内具有沿着径向延伸的6条通道:电解液通道A、磷酸盐缓冲液通道B、待测样本通道C、电极清洗通道D、电极预处理通道E、抗体注入通道F ；6条通道的入口位于靠近转盘中心部的同一内圆的圆周上；注射泵的出口与所述6条通道入口所在内圆的圆周密封接触。6条通道的出口位于转盘外周的同一圆周上。导管的进口与所述6条通道出口所在外圆的圆周密封接触。导管的出口与电解槽的入口相通；电解槽的出口通过排液泵与废液池相通。口当转盘绕中心转动时，6条通道中任一通道的入口和出口可以同时分别与注射泵的出口、导管的入口相通。
[0017]对农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法，是对电极经过预处理后，固定农药抗体，加样检测得到交流阻抗谱，进行等效电路拟合，通过比较不同浓度农药作用的电荷转移电阻Ret值，制定标准曲线；测得待测农药作用下的电荷转移电阻Ret值，并与标准曲线比较，判定待测物中的目标农药残留浓度。其具体方法如下:
1、建立对硫磷农药的浓度一阻抗标准曲线。
[0018]a.电极清洗
以注射泵在2mL/min的速度下分别把4 mL丙酮、乙醇和去离子水通过电极清洗通道D注入电解槽内并通过排出泵排出，再以注射泵把4mL的1: 1:5 (v/v) H2O2 /ΝΗ40Η/Η20混合溶液通过电极清洗通道D注入电解槽内并排出，10分钟后，再以注射泵注入去离子水彻底冲洗并排出，后通入氮气干燥；对工作电极、对电极和参比电极进行清洗并干燥。
[0019]b.电极预处理
以注射泵把4mL 2% 3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液通过电极预处理通道E注入电解槽内并排出，处理电极工作；再以注射泵分别把甲醇和水清洗通过电极清洗通道注入电解槽内并排出，清洗电极，去除非特异性吸附；
c.抗体固定
以注射泵把lmg/mL浓度的对硫磷多克隆抗体溶液4mL,在0.5mL/min的速度下,通过抗体注入通道注入电解槽内并排出，使抗体通过交联固定在工作电极上；20分钟后以注射泵把含1%血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PH值为7.4)通过磷酸盐缓冲液通道注入电解槽内并排出，以注射泵把去离子水通过电极清洗通道注入电解槽内并排出，对电极进行清洗，去除未绑定的抗体。
[0020]d.阻抗测试
以注射泵把不同浓度的农药标准溶液通过待测样本通道注入电解槽并排出，使得农药标准溶液与电极上的固定抗体发生特异性反应；30分钟后以注射泵把磷酸盐缓冲液通过磷酸盐缓冲液通道注入电解槽内并排出，再以注射泵把0.01 mol/L的[Fe (CN)6]3_/4_ (1:1)磷酸盐电解液通过电解液通道A泵入电解槽内，然后以阻抗分析仪和计算机检测电解液的交流阻抗谱，阻抗分析仪的采样频率范围lHz-100 kHz，振幅为±5 mV。对交流阻抗谱采用图3所示的等效电路拟合，计算出与农药浓度相应的法拉第阻抗。图3中，Ret表示电荷转移电阻，Rt表示溶液电阻，Cdl表示双层电容，CPE表示常相位角元件，代表氧化还原探针的属性。
[0021]e.数据分析
根据得到的与各浓度的农药相应的法拉第阻抗，制定农药浓度与拉第阻抗的标准曲线,如图4所示。图4中，纵坐标表示电荷转移电阻,单位欧姆；横坐标表示对硫磷农药的浓度，单位纳克/毫升。
[0022]2、对硫磷农药的快速检测
步骤a、b、C、d与上述相同，只不过以待测对硫磷农药代替农药标准溶液，计数出与待测对硫磷农药的农药浓度相应的法拉第阻抗。然后以把待测对硫磷农药的法拉第阻抗与标准曲线比较，计算待测对硫磷农药中的农药浓度。
[0023]为了达到传感器重复使用的目的，测试完后，在通过磷酸盐缓冲液通道泵入磷酸盐缓冲液冲洗，再通过电极清洗通道泵入蛋白质去垢剂，去除电极表面结合的抗原抗体复合物。
[0024]本发明可以快速测定目标农药在样品中的残留量，准确度好，灵敏度高，可以重复使用。
[0025]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。
【权利要求】
1.用于农药残留速测的免疫阻抗生物传感器检测方法，使用免疫阻抗生物传感器检测装置，免疫阻抗生物传感器检测装置包括与阻抗分析仪电连接的工作电极、对电极和参比电极伸入到电解槽内；阻抗分析仪与计算机相连；其特征在于:该检测方法包括下述步骤: 电极清洗 以清洗物质对工作电极、对电极和参比电极进行清洗； 电极预处理 以硅烷溶液对电极处理；再以甲醇和水清洗电极去除非特异性吸附； 抗体固定 把农药抗体溶液注入电解槽内，使抗体通过交联固定在工作电极上；以磷酸盐缓冲液和去离子水，对电极进行清洗； 阻抗测试 把待测液体样本注入电解槽，使得待测液体样本与电极上的固定抗体发生特异性反应；然后以磷酸盐缓冲液通清洗电极，再把含有[Fe(CN)6] 3_或者[Fe(CN)6] 4_的电解液注入电解槽内，然后以阻抗分析仪和计算机检测并计算出电解液的法拉第阻抗； 数据分析 对不同浓度的农药标准溶液，分别按照上述a-d步骤，得到与各浓度的农药相应的法拉第阻抗，制定农药浓度与拉第阻抗的标准曲线；将待测液体样本按照上述a-d步骤得到的法拉第阻抗，根据标准曲 线判断待测液体样本中的农药浓度。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于: 步骤a中，对电极清洗时，分别以丙酮、乙醇和去离子水进行清洗，再以1: 1:5 (v/v)H2O2 /ΝΗ40Η/Η20溶液清洗，10分钟后，再以去离子水冲洗，后通入氮气干燥； 步骤b中，硅烷溶液为3-氨丙基三乙氧基硅烷； 步骤c中，含牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中含有体积比为1%牛血清白蛋白，磷酸盐缓冲液的PH值为7.4; 步骤d中，电解液中，[Fe(CN)6] 3_与[?6(0的6] 4_的浓度比1:1;法拉第阻抗测试频率IHz-1OOkHz，振幅为 ±5mV0
3.在权利要求1或2的检测方法中使用的免疫阻抗生物传感器检测装置，其特征在于:它包括注射泵、转盘、电解槽、排出泵；与阻抗分析仪电连接的工作电极、对电极和参比电极伸入到电解槽内；阻抗分析仪与计算机相连；转盘内具有沿着径向延伸的6条通道:电解液通道、磷酸盐缓冲液通道、待测样本通道、电极清洗通道、电极预处理通道、抗体注入通道；6条通道的入口和出口分别位于转盘的同一圆周上；当转盘绕中心转动时，一通道的入口和出口同时分别与注射泵的出口、电解槽的入口相通；电解槽的出口与排出泵的入口相通。
4.如权利要求3所述的免疫阻抗生物传感器检测装置，其特征在于:它还包括与排出泵的出口相通的废液池。
5.如权利要求3所述的免疫阻抗生物传感器检测装置，其特征在于:工作电极为盘阵微电极或叉指式带列微电极。
【文档编号】G01N33/543GK103543180SQ201310520942
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】蒋雪松, 周宏平, 许林云, 茹煜 申请人:南京林业大学