专利名称：孔雀石绿快速检测装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种孔雀石绿快速检测装置及其使用方法。
背景技术：
孔雀石绿(Malachite green, MG):又名碱性绿、盐基块绿,是一种带有金属光泽的绿色结晶体，属三苯甲烷类染料，过去常被用于制陶业、纺织业、皮革业、食品颜色剂和细胞化学染色剂，近来常被用于水生动物中的真菌和原生物感染。孔雀石绿从1933年起其作为驱虫剂、杀菌剂、防腐剂在水产中使用，后被广泛用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等，特别在治疗水霉病上具有非常有效的作用。孔雀石绿是三个芳香胺的聚合物，存在潜在的致癌性，其阳离子化形式对人体的危害极大，其严重的“三致”毒性对人类健康与环境造成严重危害，这在各种毒理学实验中已得到证实。隐孔雀石绿是已知的孔雀石绿在鱼体及其他生物体内的主要代谢产物和存在形式，属于脂溶性药物，危害程度比孔雀石绿更大，在体内残留时间更长，孔雀石绿Carbinol Base是孔雀石绿和隐孔雀石绿的相互转化的中间产物。由于孔雀石绿及其代谢产物隐孔雀石绿在鱼体内和环境中残留时间长，并有致突变、致畸和致癌的危险性，FDA早已禁止孔雀石绿在渔业中应用。加拿大于1992年已禁止其作为鱼场杀菌剂使用，且加拿大和美国均规定在食用鱼等水产品中禁止检出孔雀石绿和无色孔雀石绿。欧盟于2002年6月也颁布法令禁止其在作为食品鱼的鱼场中使用，我国也于2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。农业部2001年10年I日实施的NY5070-2001《无公害食品水产品中渔药残留限量》中，将孔雀石绿列为不得检出。2002年5月将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》(农业部公告193号)。农业部办公厅于2005年7月7日发布了《关于组织查处“孔雀石绿”等禁用兽药的紧急通知》，要求各地尽快组织开展孔雀石绿等禁用药物的专项整治工作。但由于孔雀石绿低廉的价格及在水霉病防治方面尚无很好的替代品，一些不法商贩仍在非法使用，致使孔雀石绿事件仍有发生，给国家经济和人民健康造成了严重影响。2002年5月欧盟向我国通报在2批浙江舟山向德国出口鳗鱼中检出孔雀石绿(摘自国家质检总局[2002]第65号文件“进出口食品安全警示通报”)。随后，日本发现我国出口的鳗鱼中发现孔雀石绿和隐孔雀石绿残留。2005年6月5日，英国食品标准局在英国一家知名超市连锁店出售的鲑鱼体内发现“孔雀石绿”成分，弓丨发欧洲国家继“苏丹红I号”之后的又一食品安全警报。在国内，重庆市执法部门在某水产交易市场查获600多只含有孔雀石绿的甲鱼。2006年3月韩国媒体报道中国产养殖淡水鳗鱼被检查出孔雀石绿，随后日本又在我国鱼粉中检测出孔雀石绿。2006年11月香港食物安全中心日前在抽取淡水鱼样本化验时发现，15个桂花鱼样本有11个含有孔雀石绿。上述孔雀石绿事件的发生给国家经济和人民健康带来一定影响。因此，在国际社会普遍关注食品安全的形势下，鉴于孔雀石绿的危害性，为保证人民身体健康，保障国家经济发展，建立孔雀石绿及其代谢物的快速检测技术显得尤为必要。[0004]孔雀石绿-隐孔雀石绿结构在体内相互转化具有不确定性，有的实验证明孔雀石绿在生物体内代谢转化为隐孔雀石绿，也有文献报道说隐孔雀石绿在在冰冻的鱼体内转化为孔雀石绿。因此，对于孔雀石绿及其代谢物的检测现在仍以孔雀石绿和隐孔雀石绿的总量来计算其药物残留。仪器分析法具有准确度高、重复性好、适于定量检测等优点，是孔雀石绿检测的确证方法。但无论采用何种仪器分析方法，都存在着检测费用高昂，需要专业人员操作等问题。针对此问题，国内外研究者开始研究能弥补仪器检测法不足的快速检测方法。其中免疫分析因具有的高特异性和极低检测限等优点在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用，该方法一般不需要贵重精密仪器，对于操作人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大批量样品快速筛查分析，现已成为当前最具竞争性和挑战性的检测分析技术之一。免疫层析技术是上世纪80年代初期的一种简便快速免疫检测技术，由该技术制成的免疫层析试纸条通常由以下几部分组成:背衬及粘贴在背衬上的样品垫、结合垫、纤维素膜、吸收垫等。检测时，将样品滴加到样品垫上，样品会通过毛细作用在层析条上迁移，在迁移的过程中，与结合垫上的标记物发生特异性反应，产生免疫复合物，该免疫复合物继续迁移，与纤维素膜上检测区域的相应抗原/抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、乳胶等等，其中以纳米金应用最为广泛。目前，免疫层析试纸条产品已在疾病最为成熟的免疫层析产品已在医学检测、食品安全、药物滥用等领域得到广泛应用。目前，市场上已有检测孔雀石绿的免疫层析试纸条，但普遍存在着灵敏性不理想的缺陷。
发明内容本发明旨在针对现有孔雀石绿检测试纸条灵敏性不理想的缺陷提供一种高灵敏度的孔雀石绿快速检测装置。如上所述的检测装置，包括试纸条和反应杯两部分:试纸条包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、层析膜、吸水纸组成；反应杯内含有标记物-孔雀石绿的抗体/受体复合物。如上所述的试纸条，其特征是在免疫层析复合膜上分别设有检测区和质控区。如上所述的检测区，其特征是检测区包被有孔雀石绿-载体蛋白偶联物。如上所述的免疫层析检测装置，其特征是其使用方法是将待检样本加入反应杯中，样本中的孔雀石绿与标记物-孔雀石绿抗体/受体充分反应，反应结束后，将试纸条的样品垫一端插入反应杯中，反应杯中的液体通过层析作用到达层析膜，与层析膜上检测区和质控区中的分子发生反应，检测区信号的强弱提示所检测样本中孔雀石绿含量的高低(浓度越高，信号越弱)。本实用新型具有以下有益效果:I)灵敏性好。本实用新型提供了一种含有标记物-孔雀石绿抗体/受体的反应杯。待检样品首先在该反应杯中与标记物-孔雀石绿抗体/受体发生充分的结合反应。与现有带有结合垫的免疫层析试纸条相比，本实用新型反应更为充分，能够有效提高检测的灵敏性。2)简便快捷。本实用新型提供的检测装置能够快速检测样本中的孔雀石绿，检测时间更短，检测更为方便。整个检测过程(包含样品前处理)仅需50min左右。3)成本低，易于推广。本实用新型生产工艺简单，成本低廉，易于大规模生产，也易于推广使用。
以下结合附图对本实用新型做进一步说明。
图1是本实用新型反应杯的结构示意图。图2是本实用新型试纸条的结构示意图。图1中9:反应杯；10:标记物抗体偶联物(标记物-孔雀石绿受体/抗体)。图2中1:样品塾；18:检测区；19:质控区；7:层析 旲；8:吸水塾。
具体实施方式
从图1、图2可以看出，一种孔雀石绿检测装置，其包反应杯(图1)和试纸条(图2)两部分。反应杯(图1)中含有标记物-抗体偶联物10 (标记物-孔雀石绿受体/抗体)。试纸条(图2)包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫1、层析膜7、吸水垫8。层析膜7上设有检测区18和质控区19。实施例
I)将鱼虾去皮取肉，用匀质器匀质样品至糊状；2)称取5g左右均质好的样品，放入50mL离心管中；3)并加入2mL提取试剂A和IOmL提取试剂B高速震荡3_4min ；4)将试剂C中粉末全部倒入上述3)中，拧紧盖子并上下充分摇晃20-30S，然后4000rpm 离心 5min ；5)从中转移4mL上清溶液到新的15mL离心管中，加入50 μ L氧化剂混勻，室温静置 3min ；6)加入等体积的正己烷，拧紧盖子上下充分颠倒混匀5-6次，室温下静置3min，然后小心吸弃上层后，并将约3mL下层倒入5mL离心管中，60°C下氮气吹干；7)加入200 μ L样品复溶液，震荡15-20s，待测；8)吸取200 μ L的处理后的备用样品于反应杯中，抽吸5-10次，混合均匀；9)室温下计时3分钟；10)第一次3分钟温育结束后，按下计时器停止计时，将试纸条插入到反应杯中(样品垫一端朝下);11)开始室温下第二次4分钟温育，并计时；12)当第二次4分钟温育结束，停止计时，从反应杯中取出试纸条，去掉试纸条的样品垫并进行结果判读:检测线信号越弱，样品中的孔雀石绿含量越高。
权利要求1.一种孔雀石绿检测装置，包括试纸条和反应杯两部分:试纸条由底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、层析膜、吸水纸组成；反应杯内含有标记物-孔雀石绿的抗体/受体复合物。
2.如权利要求1所述孔雀石绿检测装置，其特征是在免疫层析复合膜上分别设有检测区和质控区。
3.如权利要求1所述孔雀石绿检测装置，其特征是检测区包被有孔雀石绿-载体蛋白偶联物。
专利摘要本实用新型涉及生物技术领域，具体涉及一种孔雀石绿快速检测装置，包括试纸条和反应杯两部分试纸条包括底板以及底板上依次搭接粘贴的样品垫、层析膜、吸水纸组成；反应杯内含有标记物-孔雀石绿的抗体/受体复合物。检测样品时，将待检样本加入反应杯中，样本中的孔雀石绿与标记物-抗体/受体充分反应，反应结束后，将试纸条的样品垫一端插入反应杯中，反应杯中的液体通过层析作用到达层析膜，与层析膜上检测区和质控区中的分子发生反应，检测区信号的强弱提示所检测样本中孔雀石绿含量的高低(浓度越高，信号越弱)。本实用新型具有灵敏性好、简便快捷、成本低，易于推广等优势。
文档编号G01N33/558GK203164188SQ201320035529
公开日2013年8月28日 申请日期2013年1月24日 优先权日2013年1月24日
发明者朱海, 付辉, 李金峰, 张美娟, 马涛, 李颖, 王西丽, 余优慧, 石锡莲, 陈玉玲 申请人:深圳市易瑞生物技术有限公司