确定包括细胞的体液中的靶分子的存在的制作方法
【专利摘要】一种确定具有细胞的体液(16)中的靶分子的存在的方法，包括以下步骤：裂解体液(16)中的细胞，以生成裂解物(17)；将所述裂解物(16)与具有第一检测器分子的粒子(36)混合；通过第一检测器分子将靶分子结合到所述粒子；将具有第二检测器分子的基底(38)暴露于所述裂解物(17)；通过第二检测器分子将靶分子结合到所述基底；检测被附着到所述基底(36)的粒子(36)。
【专利说明】确定包括细胞的体液中的靶分子的存在
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种确定包括细胞的体液中的靶分子的存在的方法、分析器设备以及用于分析器设备的插盒。
【背景技术】
[0002]检测体液(如血液)中的靶分子对于许多检测技术来说是挑战。具体地，诸如荧光和比色法的光学技术可以具有如下缺点:红细胞导致高的光学背景(例如，自发荧光、高吸收)。像FTIR(frustrated total internal reflect1n,受抑全内反身寸)技术的近场光学技术可以对这些类型的光学干扰较不敏感。连同FTIR技术，磁性粒子可以用于检测被结合到基底表面的靶分子，其中，磁性粒子可以被引导到具有磁场的基底。然而，当使用磁性粒子时，它们可以具有不可逆地附着到血液细胞的倾向，并且由于红细胞占据基底表面上的空间，它们可以干扰磁性致动过程，并且可以排斥磁性粒子结合。
[0003]移除血液细胞的最常见的方法是经由离心力或分离技术(例如过滤器、直接捕获)将其移除。结果是干净的血浆基质，可以更容易地对其进行分析。
[0004]可以通过将血液进行离心来获得最高质量的血浆。然而，在大多数情况下，这需要使用具有移动部件的电机。为了避免移动部件、高功耗和昂贵的部件，大多数医护点分析器设备采用过滤器作为便宜并且简单的解决方案。使用过滤器可以具有如下缺点:其可以具有高表面区域，在所述高表面区域上经常观察到靶分子的吸附(所谓的滞留)。因此，对于要被检测的每个类型的靶分子，需要采用化学措施来阻断通常具有蛋白质的过滤器，使得靶分子不能够结合到过滤器。然而，对于要被检测的每个新类型的靶分子，需要寻找不干扰化验的阻断分子，这不是在所有情况下都是可能的，并且在一些情况下，可以观察到少量滞留。对于高灵敏度和高精确度分析确定，由于上述原因，过滤器的使用可能是不适合的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种可以在医护点处执行的检测靶分子的简单、廉价且准确的方法。具体地，本发明的目的是提供这样一种方法:其可以由医护点和/或手持式分析器设备执行，以实现在使用离心技术的中心实验室分析器中所观察到的性能。
[0006]该目的通过独立权利要求的主题来实现。其他范例性实施例根据从属权利要求和下面的说明书是显然的。
[0007]本发明的方面涉及一种确定包括细胞的体液中(例如血液中)的靶分子的存在或量的方法。
[0008]根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤:裂解体液中的细胞，以生成裂解物；将裂解物与具有第一检测器分子的粒子混合；通过第一检测器分子将靶分子结合到所述粒子；将具有第二检测器分子的基底暴露于所述裂解物；通过第二检测器分子将靶分子结合到所述基底；检测被附着到所述基底的粒子。
[0009]所述方法可以用于血液中的生物靶分子(特别是蛋白质)的直接检测。可以将如下看作是本发明的要旨:首先裂解所述体液的样本，其后所述裂解物直接用于确定例如具有所述磁性粒子和所述基底的磁性标记化验中的所述靶分子浓度。具体地，可以在所述裂解物中(具体地，在没有移除所述体液或所述裂解物的任何成分的情况下)直接执行所述革巴分子的分析确定。
[0010]可以利用光学检测技术(例如FTIR技术)来确定所述靶分子浓度，在所述FTIR技术中，根据从具有结合的磁性粒子的所述基底反射的光来确定所述靶分子浓度。可以在全血样本中直接执行所述FTIR技术和/或所述磁性标签技术，使得来自细胞的干扰不存在。
[0011]本发明的其他方面涉及一种分析器设备和一次性插盒，可以利用所述分析器设备执行在上下文中描述的方法，并且所述一次性插盒用于插入分析器设备。
[0012]需要理解，上下文中描述的分析器设备和/或插盒的特征可以是上下文中描述的方法的特征，反之亦然。
[0013]根据本发明的实施例，所述插盒包括用于裂解体液中的细胞的洗涤剂、具有第一检测器分子的粒子以及具有第二检测器分子的基底。体液的样本可以被放入所述插盒中，由所述洗涤剂裂解，并且可以在上下文中描述的分析器设备中进行分析。
[0014]参考下文所述的实施例，本发明的这些方面和其他方面将是显而易见的并且得到阐明。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]下面，参考附图对本发明的实施例进行更详细地描述。
[0016]图1示意性地示出了根据本发明的实施例的分析器设备；
[0017]图2示意性地示出了根据本发明的实施例的插盒；
[0018]图3示意性地示出了具有根据本发明的实施例的被插入的插盒的分析器设备的详细视图；
[0019]图4示出了根据本发明的实施例的用于检测靶分子的方法的流程图；
[0020]图5示出了根据本发明的实施例的通过裂解没有靶分子的血液样本而引起的检测信号变化的图表；
[0021]图6示出了根据本发明实施例的通过裂解具有靶分子的血液样本而引起的检测信号变化的图表。
[0022]原则上，在附图中相同的部分提供有相同的附图标记。
【具体实施方式】
[0023]图1示意性示出了手持式分析器设备10，其可以在护理点处(例如医生办公室、医院床边、救护车以及患者家中)使用。手持式分析器设备也可以用于实验室环境之外的快速医疗诊断。
[0024]手持式分析器设备具有槽12，其用于容纳一次性插盒14。已经取自患者的体液16(如血液)的样本可以被放置在插盒14上。插盒14可以被插入分析器设备10中的槽12内。样本16可以由分析器设备10进行分析，并且结果可以被直接显示在分析器设备10的显示器18上。
[0025]图2示意性地示出了插盒14。插盒14包括:用于容纳体液16的样本的第一腔室或入口 26 ;毛细管输送通道28 ;用于分析体液16的第二腔室或样本室30 ；以及，出口 32。关于图3，插盒14可以包括可以由注模塑料制造的顶部部分20和底部部分22。可以利用粘合带24将这两个部分20、22附着在一起，以形成插盒14。
[0026]可以形成第一腔室26，作为入口 26，裂解化学物质(洗涤剂)可以被沉积在其中。
[0027]根据本发明的实施例，插盒14包括用于裂解体液16中(特别是第一腔室26中)的细胞的洗涤剂。
[0028]根据本发明的实施例，插盒包括由通道28连接的第一腔室26和第二腔室30。
[0029]根据本发明的实施例，洗涤剂被布置在第一腔室26中。
[0030]根据本发明的实施例，插盒包括通道28中的阀34。通道28可以包括阀34，所述阀34在体液16的样本已经被沉积在入口 26上后的特定时间之后打开。例如，阀34可以是被以磁性、电学和/或流体方式致动来释放的。
[0031]根据本发明的实施例，阀34适于在体液16已经进入第一腔室26后的特定时间之后打开。
[0032]通道28可以包括混合结构35，例如静态微流体结构，由机械、磁性、电学和/或光学的力来驱动的混合结构。混合结构35可以允许裂解剂在血液中迅速散布，以实现快速裂解。这可能不再需要阀34或仅有在短暂关闭的通道端部处的阀。如果裂解与化验同时完成，也可以将混合结构35包含在第一腔室26内、在通道28内和/或在具有化验的腔室30内。
[0033]图3示意性地示出了通过被插入分析器设备10内的插盒14的第二腔室30的横截面视图。磁性粒子36被布置在第二腔室30中，其包括可以适于结合到特定类型的靶分子的第一检测器分子。必须注意，磁性粒子36可以是与磁场反应的任何类型的粒子，例如，磁性粒子可以在磁场的帮助下移动。粒子36可以是纳米粒子。
[0034]第二腔室30包括基底表面38，其包括也可以适于结合到特定类型的靶分子的第二检测器分子。
[0035]第一检测器分子和第二检测器分子可以是相同的类型，或者可以是不同的类型。
[0036]检测器分子可以是任何类型的特定结合种类，例如，抗体、配体、反义核酸和/或抗体片段等。
[0037]根据本发明的实施例，插盒14包括的具有第一检测器分子的粒子36(例如，磁性粒子36)和具有第二检测器分子的基底38。
[0038]根据本发明的实施例，粒子36和基底38被布置在第二腔室30中。
[0039]当来自第一腔室26的被裂解的体液17或裂解物17经由通道28进入第二腔室30时，被裂解的体液17中的靶分子通过第一检测器分子结合到磁性粒子36，并且通过第二检测器分子结合到基底表面38。以这样的方式，磁性粒子36被结合到基底表面38。被结合到基底表面38的磁性粒子36的量取决于体液16中的靶分子的量。
[0040]为了支持与基底表面38的结合反应，分析器设备10包括两个可控制的电磁体40、42，以朝向基底表面38和远离基底表面移动磁性粒子36。两个磁体40、42分别被放置在插盒14的上方和下方，并且具体地在第二腔室30的上方和下方。
[0041]为了检测磁性粒子36，分析器设备10具有光源44 (例如，LED)和光检测器46 (例如，CXD照相机)。光源42发射光束穿过插盒的底部部分22至基底表面38上。光束至少部分地被反射并且落到光检测器46上。根据反射的程度，可以确定被结合到基底表面的磁性粒子36的量，以及可以由此间接地确定体液16中的靶分子的量。在没有被结合到基底表面38的磁性粒子36的情况下，光在体液16与插盒14的底部部分22之间的边界处被全反射。进一步地，创建以指数方式衰减并且仅穿透被裂解的体液17亚波长距离的渐逝场。当存在磁性粒子38时，它们吸收并且散射渐逝场的一部分，并且干扰光的全反射，从而降低反射光的强度。这种技术可以被称为受抑全内反射(FTIR)。
[0042]图4示出了针对用于检测体液中的靶分子的方法的流程图，将对于图1至图3对其进行解释。
[0043]例如体液16可以是全血，即，未移除任何成分的血液。
[0044]根据本发明的实施例，体液16包括血液或者是血液。
[0045]根据本发明的实施例，靶分子是特定类型的蛋白质。
[0046]根据本发明的实施例，靶分子是以下中的至少一种:心肌肌钙蛋白I(cTnl)、心肌肌钙蛋白T、利尿钠肽(BNP，NT-proBNP)、肌红蛋白、肌酸激酶MB、d_ 二聚体、降钙素原以及甲状旁腺激素。
[0047]在步骤100中，提供体液16的样本，并且将其沉积在插盒的入口 26、第一室或第一腔室26处。在沉积插盒14中的体液16之后，插盒14可以被直接插入分析器设备10的槽12中。
[0048]在步骤102中，裂解体液16。例如，第一腔室26中的洗涤剂可以裂解体液16中的细胞。
[0049]根据本发明的实施例，所述方法包括裂解体液16中的细胞，以生成裂解物17。裂解可以被定义为细胞被破坏的过程。有可能在得到的裂解物中执行化验前的细胞裂解。然而，可以同时执行裂解和化验。
[0050]根据本发明的实施例，细胞由洗涤剂来裂解。洗涤剂可以是适于裂解细胞的任何物质。
[0051]使用如吸附的方法可以将裂解化学物质(洗涤剂)固定在插盒14的各种表面上(例如，无机的(例如玻璃)和有机的(例如塑料))。洗涤剂可以以干燥形式存在，例如与抗凝血剂(穿过整个插盒或在第一腔室26处)。洗涤剂可以与也可以以干燥形式存在的磁性粒子36 —起存在。洗涤剂可以被固定在插盒14的微流体结构上，使得在样本沉积后，体液16可以迅速被直接暴露于洗涤剂。
[0052]根据本发明的实施例，洗涤剂包括诺乃(Nonidet)洗涤剂-P40、诺乃洗涤剂-P40替代品、蔗糖十二烷酸酯、Chemal LA-9以及Triton XlOO中的至少一个。这些洗涤剂对裂解红细胞可以是高度有效的。具体地，仅观察到对cTnl化验的小干扰。
[0053]备选地或额外地，根据本发明的实施例，可以通过物理裂解方法来裂解细胞。例如，可以通过声波降解法(sonicat1n)(即，通过将细胞暴露于超声)来裂解细胞。例如，分析器设备可以适于生成超声。
[0054]总体上，可以通过使用包括机械(例如玻璃粒子的加入、超声、在受限制的通道内的剪切)、电学(高电压)、热力和化学的技术(高渗透压、洗涤剂、酶)的多种技术来完成细胞的裂解。
[0055]在任选步骤104中，可以使用额外的药剂来结合从被裂解的细胞中释放的物质。例如，非化验磁性粒子可以被加入到第一室或腔室26，以移除可以从细胞中释放的任何生物干扰物质(例如，蛋白质、核酸)。非化验磁性粒子可以包含能够结合到干扰分子(抗蛋白质抗体、针对核酸的带电硅表面等)的结合基团。在裂解期间或裂解之后可以加入非化验磁性粒子。当已清洁的裂解物17被允许进入含有化验粒子38的室或腔室30中时，磁场可以用于将非化验粒子滞留在第一室或腔室26中。该磁场可以由分析器设备10生成。
[0056]根据本发明的实施例，所述方法包括向裂解物17中加入结合剂(例如，非化验磁性粒子)，以结合从被裂解的细胞中释放的物质。
[0057]在任选步骤106中，阀34打开，以将裂解物释放到第二腔室30。阀34可以是永久的微流体阀(以磁性、电学、流体方式致动来释放)或半永久阀。阀34可以是疏水性阀，其包括疏水性被动结构，例如，其被直接注模在塑料插盒14中。当来自体液16的蛋白质吸附所述结构时，疏水性阀34可以慢慢地变成亲水性的。在固定的特定时间量之后，该结构的接触角使得体液16(或裂解物17)被允许通过。该时间可以是大约一至几分钟的量级。可以通过加入或从样本16移除大量的蛋白质并且通过调节所述结构来调谐特定时间。可以选择特定时间，使得在裂解物17被释放到第二腔室30之前在第一腔室26中裂解所有细胞。
[0058]总体上,在体液16已经进入第一腔室26之后,第一腔室26和第二腔室30在特定时间内(例如，低于一分钟)彼此分离。
[0059]根据本发明的实施例，在体液16的细胞的裂解开始后的特定时间之后，将裂解物17与粒子38混合。进一步地，在特定时间之后，基底38可以被暴露于裂解物17。
[0060]在步骤108中，将裂解物17经由通道28从第一腔室26传送至第二腔室30，例如通过毛细管输送。可以首先在分离的腔室或室26中裂解体液样本16，然后将裂解物输送到磁性粒子38存在于其中的弟二腔室或室30。化验可以在弟二室30中或在后续室中执打。当磁性粒子38与细胞结合时，可以在将细胞暴露于磁性粒子38之前将细胞裂解，这会导致粒子38的不可逆的聚合。
[0061]根据本发明的实施例，所述方法包括将裂解物16与具有第一检测器分子的粒子36混合。
[0062]根据本发明的实施例，所述方法包括将具有第二检测器分子的基底38暴露于裂解物17。
[0063]根据本发明的实施例，在第一位置26 (例如，第一腔室26)处裂解体液16的细胞，并且在与第一位置26不同的第二位置30 (例如，第二腔室30)处将裂解物17与粒子36混合和/或将基底38暴露于裂解物17。
[0064]备选地，可以在相同位置(例如，插盒14的单个腔室或室中)处生成和分析裂解物17。
[0065]在步骤110中，第二腔室中的磁性粒子36和基底38结合到裂解物17中的靶分子。磁性粒子36可以被看作用于特定靶分子的标签。
[0066]根据本发明的实施例，所述方法包括通过可以被附着到粒子36的第一检测器分子将靶分子结合到粒子36。
[0067]根据本发明的实施例，所述方法包括通过可以被附着到基底38的第二检测器分子将靶分子结合到基底38。
[0068]可以通过中间结合分子(例如，链霉亲和素、生物素)形成经由靶分子将粒子36链接到基底表面38的链来促进所述结合。
[0069]如上所述，磁性粒子可以通过磁力来移动。
[0070]根据本发明的实施例，所述方法包括通过可以由底部磁体42生成的磁力在朝基底38的方向上移动磁性粒子36。
[0071]根据本发明的实施例，所述方法包括通过可以由顶部磁体40生成的相反的磁力移除未被附着到基底38的磁性粒子36。
[0072]在步骤112中，如上所述，检测裂解物17中的靶分子的量。
[0073]根据本发明的实施例，所述方法包括检测被附着到基底36的粒子36，例如，磁性粒子36。
[0074]根据本发明的实施例，所述方法包括通过检测由粒子反射的辐射来检测被附着到基底38的磁性粒子36。
[0075]图5示出了通过裂解不具有靶分子的人类血液样本引起的检测信号变化的图表，并且图6示出了通过裂解包含cTnl形式的靶分子的人类血液样本16引起的检测信号变化的图表。
[0076]图表的纵轴示出了相对于参考信号的检测器46的信号变化的百分比，当第二腔室30内充满参考流体时，生成所述参考信号。
[0077]不同的竖条示出了针对以不同方式处置的血液16的检测到的信号。第一竖条200是针对来自已离心的血液16的血浆的信号，并且可以用作参考。第二竖条202是针对通过声波降解法裂解的血液16的信号。其他竖条204、206、208、210、212是针对分别用洗涤剂诺乃洗涤剂-P40、诺乃洗涤剂-P40替代品、蔗糖十二烷酸酯、Chemal LA-9和Triton XlOO (在IX磷酸盐缓冲盐水中占1%，pH7.4)裂解的全血的信号。
[0078]在202的情况中，使用2mm探头在40%的振幅上对血液进行声波降解5秒钟。在204至212的情况下，洗涤剂以1:1的比例被加入至血液，并且在室温下温育I分钟。
[0079]为了生成信号202至212，一次性插盒14包含涂覆有示踪物抗cTnl抗体的干燥的500纳米磁性粒子，以及在第二腔室30中由HEPES、蔗糖、BSA、KBr和KCl组成的干燥的缓冲剂。使用磁性致动协议执行cTnl化验，所述磁性致动协议由具有裂解物17的磁性粒子36温育I分钟和在基底表面38处的磁性粒子36脉冲致动4分钟来组成，在所述基底表面38上耦合捕获抗cTnl抗体。使用受抑全内反射来检测被结合到表面38的磁性粒子38。给定的信号为在通过磁力已经从基底表面38移除未结合的磁性粒子36之后的信号。
[0080]如从图5和图6中的竖条可以看出，在血液通过声波降解或利用洗涤剂诺乃洗涤剂-P40、诺乃洗涤剂-P40替代品、蔗糖十二烷酸酯、Chemal LA-9以及Triton XlOO裂解之后，cTnl化验仍是功能性的。
[0081]总之，通过首先裂解体液样本16 (例如，血液样本16)中的细胞，可以直接在被裂解的样本17中以低干扰级别执行具有磁性粒子36的化验。裂解物17可以直接用于使用具有磁性粒子36的免疫化验来确定靶分子浓度。以这种方式，没有分析物丢失并且没有或仅有轻微的具有磁性粒子36的细胞的干扰发生。仅对折射率变化敏感并且对颜色、荧光等不敏感的FTIR技术可以用于直接检测。可以避免大细胞的位阻，并且可以不存在磁性粒子36与细胞的结合。
[0082]尽管在附图和前面的描述中已经对本发明进行了详细的图示和描述，但是这种图示和描述应当被认为是图示性的或范例性的，而非限制性的；本发明不限于所公开的实施例。本领域技术人员能够理解和实现对所公开的实施例的其他变型，并且通过研究附图、公开文本和权利要求书实践所要求保护的发明。在权利要求中，“包括” 一词不排除其他元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。单个处理器或控制器或其他单元可以实现权利要求中记载的若干项的功能。在互不相同的从属权利要求中记载特定措施并不指示不能有利地使用这些措施的组合。权利要求书中的任何附图标记不应被解读为对范围的限制。
【权利要求】
1.一种确定包括细胞的体液(16)中的靶分子的存在的方法，所述方法包括以下步骤: 裂解所述体液(16)中的细胞，以生成裂解物(17)； 将所述裂解物(16)与具有第一检测器分子的粒子(36)混合； 通过第一检测器分子将靶分子结合到所述粒子； 将具有第二检测器分子的基底(38)暴露于所述裂解物(17)； 通过第二检测器分子将靶分子结合到所述基底； 检测被附着到所述基底(36)的粒子(36)。
2.根据权利要求1所述的方法， 其中，所述细胞由洗涤剂或洗涤剂的混合物来裂解。
3.根据权利要求2所述的方法， 其中，所述洗涤剂包括诺乃洗涤剂-P40、诺乃洗涤剂-P40替代品、蔗糖十二烷酸酯、Chemal LA-9 和 Triton XlOO 中的至少一个。
4.根据权利要求2或3所述的方法， 其中，至少一种盐被加入到不存在蛋白质和碳水化合物的所述洗涤剂中。
5.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，所述细胞通过物理裂解方法来裂解。
6.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，在所述体液(16)的所述细胞的所述裂解开始后的特定时间之后，将所述裂解物(17)与所述粒子(38)混合和/或将所述基底(38)暴露于所述裂解物(17)。
7.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，在第一位置(26)处将所述体液(16)的所述细胞溶解，并且在第二位置(30)处将所述溶解产物与所述粒子(36)混合和/或将所述基底(38)暴露于所述裂解物。
8.根据上述权利要求中的一项所述的方法，还包括以下步骤: 向所述裂解物(17)中加入结合剂，以结合从被裂解的细胞中释放的物质。
9.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，所述靶分子为特定类型的蛋白质。
10.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，所述体液(16)包括血液。
11.根据上述权利要求中的一项所述的方法， 其中，所述粒子是磁性粒子(36)； 其中，所述方法包括以下步骤: 通过磁力在朝所述基底(38)的方向上移动所述磁性粒子(36)； 通过相反的磁力来移除未被附着到所述基底(38)的磁性粒子(36)； 通过检测由所述粒子反射的辐射来检测被附着到所述基底(38)的所述磁性粒子(36)。
12.一种用于插入分析器设备(10)的插盒(14)，所述插盒(14)包括: 洗涤剂，其用于裂解体液(16)中的细胞； 具有第一检测器分子的粒子(36)； 具有第二检测器分子的基底(38)。
13.根据权利要求12所述的插盒(14)，还包括: 由通道(28)连接的第一腔室(26)和第二腔室(30)； 其中，所述洗涤剂被布置在所述第一腔室(26)中； 其中，所述粒子和所述基底被布置在所述第二腔室(30)中。
14.根据权利要求13所述的插盒(14)，还包括: 所述通道(28)中的阀(34)； 其中，所述阀(34)适于在所述体液(16)已经进入所述第一腔室(26)后的特定时间之后打开。
15.一种分析器设备(10)，其适于执行根据权利要求1至11中的一项所述的方法。
16.根据权利要求15所述的分析器设备(10)，包括 槽(12)，其用于容纳根 据权利要求11至13中的一项所述的插盒(14)。
【文档编号】G01N33/50GK104053992SQ201380005531
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2012年1月16日
【发明者】P·德基维特, B·德雷格特, W·U·迪特默, J·G·奥塞尔 申请人:皇家飞利浦有限公司