无细胞体液中npm1核酸的检测的制作方法

专利名称：无细胞体液中npm1核酸的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学领域，包括癌症的诊断和治疗。
背景技术：
下面对本发明背景的讨论仅用于帮助读者理解本发明，并非承认描述或构成本发明的现有技术。核磷蛋白又被称为B23、核基质蛋白和N038，是一种普遍表达的核仁磷酸蛋白 (nucleolar phoshoprotein)，它能连续穿梭于细胞核与胞质之间。核磷蛋白的功能包括结合核酸，调控中心体复制和核糖体功能，以及调控ARF-p53肿瘤抑制通路。编码核磷蛋白的基因是NPM1。NPMl基因位于染色体5q35上。由染色体相互易位造成的NPMl破坏与多种淋巴造血系统(hematolymphoid)恶性肿瘤有关O^alini et al. Hematologica, 2007 ；92 (4) :519-532)。这些易位导致多种融合蛋白的形成—— 所述融合蛋白保留了核磷蛋白的N端，并且与肿瘤病症相关，包括间变性大细胞淋巴瘤中的NPM-间变性大细胞淋巴瘤激酶(NPM-ALK) (Morris et al. Science. 1994 ；263 1281-1观4)、急性早幼粒细胞白血病中的NPM-视黄酸受体α (NPM-RAR α ) (Redner et al. Blood. 1996 ；87 :882-88)以及AML/骨髓增生异常综合征中的NPM-脊髓发育不良/髓性白血病因子 I(NPM-MLFl) (Yoneda-Kato et al. Oncogene. 1996 ；12 :265-275)。在急性髓性白血病(AML)患者中，约有35%的成年人和6. 5%的儿童被鉴定出 NPMl 基因的杂合突变(Falini et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Cazzaniga et al. Blood. 2005 ；106 :1419-1422)。在AML患者中，迄今已有多种NPMl突变的分子变体被描述，主要集中于外显子12 (Falini et al. Blood. 2007 ； 109 :874-85)。在AML中已被鉴定出的多种NPMl突变的特征是简单的1-或2-四核苷酸插入，4-碱基对(bp)或5-bp缺失结合 9-bp 插入，或 9-bp 缺失结合 14-bp 插入(Falini et al. Blood. 2007 ； 109 :874-85 ；Chen et al. Arch. Pathol. Lab Med. 2006 ；130 :1687-1692)。NPMl 基因的外显子 12 的突变通常导致移码，产生保留在细胞质中的延伸蛋白。NPMl突变与高水平的骨髓母细胞，高白细胞(WBC)和血小板计数，以及fms相关酪氨酸激酶 3 内部串联复制(FLT3-ITD)相关(Thiede et al. Blood. 2006 ；107 :4011-4020)。 具有NPMl突变而没有FLT3突变的患者在该研究中显示了明显较好的总存活率和无疾病存活率(Thiede et al. Blood. 2006 ；107 :4011-4020)。NPMl突变常见于具有正常核型的 AML 中(Schnittger et al. Blood. 2005 ； 106 :3733-3739)。在具有正常核型的 AML 患者群中，多项研究显示，患有NPMl-突变AML的患者的完全缓解率类似于或明显高于患有野生型 NPMl AML 患者的完全缓解率(Boissel et al. Blood. 2005 ；106 :3618-3620 ；Falini
4et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Suzuki et al. Blood. 2005 ；106 :2854-2861 ； Dohner et al.Blood. 2005 ；106 :3740-6)。发明概述本发明提供了检测无细胞体液中NPMl核酸的方法。在某些方面，本发明包括确定 NPMl核酸是否包含一个或多个突变。本发明还提供了基于确定NPMl基因突变(一个或多个)是否存在，确定被诊断为患有AML的个体的诊断和预后的方法。一方面，本发明提供了检测个体无细胞体液中NPMl核酸是否存在的方法。该个体可以被诊断为患有恶性疾病(例如AML或MDS)，或可以被怀疑患有恶性疾病。另一方面，本发明提供了确定诊断有血液学疾病(如AML或MDS)的个体的预后的方法，包括确定NPMl核酸中是否存在一个或多个突变，其中该NPMl核酸得自该个体的无细胞体液，以及为所述个体提供预后，其中NPMl基因中存在一个或多个突变表明该患者的预后相对于诊断有AML而没有所述一个或多个突变的患者较好。适合的无细胞体液包括，例如，血清和血浆。被分离和/或评价的适合的NPMl核酸包括，例如，基因组DNA和RNA (例如，mRNA)。在优选的实施方式中，NPMl突变是相对于SEQ ID NO :1的NPMl序列确定的。在一些实施方式中，被评价的一个或多个NPMl突变选自图2A或2B中的突变。在其他实施方式中，该NPMl突变是插入突变，包括，例如在对应于SEQ ID NO 1的1018位的核苷酸之后的插入。在其他实施方式中，该插入是CTCT或CTCG插入。NPMl突变——包括插入突变—— 的存在与改善的预后有关(即，比诊断有血液学疾病而没有NPMl突变的个体预后好)。在优选的实施方式中，该改善的预后是相对于诊断有血液学疾病而没有NPMl突变的个体，改善的缓解率或改善的总存活率。在其他实施方式中，得自无细胞体液的核酸被进一步评价是否存在FLT3基因的一个或多个突变。在一些实施方式中，该FLT3基因突变是内部串联重复的复制。在一种解释下，没有FLT3突变而进一步含有NPMl突变的个体相对于诊断有血液学疾病并有NPMl突变和FLT3突变之一或两者的个体，具有改善的预后。在其他实施方式中，该方法还包括确定该个体的细胞遗传学(cytogenetics)。在一种解释下，具有中等细胞遗传学(intermediate cytogenetics)并进一步包含NPMl突变的个体相对于没有NPMl突变并具有中等、正常或差细胞遗传学(poor cytogenetics)的个体，具有改善的预后。在另一种解释下，具有正常细胞遗传学并进一步包含NPMl突变的个体相对于具有正常细胞遗传学而没有NPMl突变的个体，具有改善的预后。在其他实施方式中，NPMl突变是否存在是通过确定至少部分NPMl核酸的核苷酸序列来评价的。在另一种实施方式中，NPMl突变是否存在是通过确定至少部分NPMl核酸的大小来评价的。任选地，NPMl核酸被扩增。扩增可以使用SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :4的寡核苷酸扩增引物进行。任选地，个体的接合性(zygosity)状态被确定。在另一方面，本发明提供通过确定从无细胞体液获得的NPMl核酸中是否存在移位来诊断个体患有血液学疾病并在检测到NPMl核酸中的移位时诊断所述个体患有血液学疾病的方法。在某些实施方式中，该血液学疾病是间变性大细胞淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病或急性髓性白血病。在其他实施方式中，移位发生在NPMl基因和间变性大细胞淋巴瘤激酶基因、视黄酸受体α基因或脊髓发育不良/髓性白血病因子1基因其中一个之间。任
5选地，还可以评价个体的NPMl基因和/或FLT3基因中的一个或多个突变，如上述方面所述。本文所用的术语“样品”或“患者样品”包括生物样品，如组织和体液。“体液”包括但不限于血液、血清、血浆、唾液、脑脊液、胸膜液、泪液、乳管液(lactal duct fluid)、淋巴、痰、尿液、羊水和精液。样品包括“无细胞”的体液。“无细胞体液”包括少于约(w/ w)的全细胞物质。血浆或血清是无细胞体液的例子。样品可以包括天然或合成来源(即将细胞样品制成无细胞样品)的样品。本文所用的“血浆”是指发现于血液中的无细胞液体。“血浆”可通过用本领域已知的方法(例如离心，过滤及类似方法)从血液中除去全细胞物质而得到。如本文所用，“外周血浆”是指从外周血液样品中得到的血浆。本文所用的“血清”包括在使血浆或血液凝固并除去凝固部分后得到的血浆部分。术语“核酸”意在包含多聚形式的任意长度的核苷酸，其含有任意组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及类似物。核酸可以具有三维结构，并可以执行任意已知或未知的功能。术语核酸包括双链、单链、部分双链、发夹结构和三螺旋的分子。除非另有说明或要求， 本文所述的本发明的任意实施方式中，核酸包括双链形式和已知或预测构成双链形式DNA、 RNA或杂交分子的两种互补形式中的每一种。核酸可被扩增、重组，或可以直接从天然来源分离。核酸包括已被扩增(例如使用聚合酶链反应)的核酸。核酸的具体例子包括基因或基因片段；基因组DNA ；RNA,包括mRNA、tRNA和rRNA ；核酶；cDNA ；重组核酸；分支核酸；质粒和载体。核酸可以是天然的或合成的。本文所用的术语“基因组核酸”指细胞中的核酸，该核酸存在于生物体的细胞染色体(一条或多条)中，该细胞染色体含有编码该生物体细胞的各种蛋白质的基因。优选的基因组核酸类型是存在于真核细胞细胞核内的基因组核酸。在优选的实施方式中，基因组核酸是DNA。基因组核酸可以是双链或单链，或部分双链，或部分单链，或发夹结构的分子。 基因组核酸可以是完整的或片段的(例如，用限制性内切核酸酶消化过的或经过超声处理或通过用本领域已知的方法施加剪切力)。在一些情况下，基因组核酸可以包括来自一个基因的全部或部分，或来自多个基因的序列；来自一个或多个染色体的序列；或来自细胞全部染色体的序列。众所周知，基因组核酸包含基因编码区、内含子、5’和3’非翻译区、5’和 3，侧翼DNA和结构区段，如端粒和中心粒DNA、复制起点和基因间DNA。表示基因组总核酸的基因组核酸被称为“总基因组核酸”。如本领域所熟知，基因组核酸可通过提取/纯化的方法从无细胞体液中得到。基因组核酸的最终来源可以是正常细胞或可以是含有基因组核酸中一个或多个突变——例如复制、缺失、移位或颠换——的细胞。在基因组核酸的含义中包括经过扩增步骤的基因组核酸，该扩增步骤增加所要检测的感兴趣目标序列相对于该基因组核酸中其他核酸序列的含量。如本文所用，术语“cDNA”是指通过RNA依赖性DNA聚合酶活性(例如逆转录酶) 的作用从RNA模板产生的互补或拷贝多核苷酸。cDNA可以是单链、双链或部分双链。cDNA 可含有非天然核苷酸。cDNA能在合成后被修饰。cDNA可包含可检测标记。如本文所用，在多核苷酸或多肽背景下，术语“分离的”是指与其天然相关的细胞大分子基本分离的分子。如果分子在组成上占与其天然相关的细胞大分子的至少25%、50 %、75 %、90 %、95 %或99 %，则该分子是分离的。“基因”是指包含产生RNA所需的调控和编码序列的DNA序列，该RNA可以具有非编码功能(例如，核糖体RNA或转运RNA)，或可以包含多肽或多肽前体。只要保留期望的活性或功能，该RNA或多肽可由全长编码序列或由编码序列的任意部分编码。术语“野生型”是指与天然存在的来源分离时具有基因或基因产物特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最频繁地观察到的基因，因此被专门称为基因的“正常” 或“野生型”形式。“野生型”也指在特定核苷酸位置(一个或多个)处的序列、在特定密码子位置(一个或多个)处的序列，或在特定氨基酸位置(一个或多个)处的序列。如本文所用，“突变的”、“修饰的”或“多态的”是指与野生型基因或基因产物相比时，在序列和或功能性质上显示改变(即，特征改变)的基因或基因产物。“突变的”、“修饰的”或“多态的” 也指在特定核苷酸位置(一个或多个)处的序列、在特定密码子位置(一个或多个)处的序列，或在特定氨基酸位置(一个或多个)处的序列。“突变”意在包含相对于正常序列核苷酸序列中至少核苷酸的改变。突变可以包括替换、缺失、倒置或插入。对于编码多肽，突变可以是“沉默的”并且不导致编码多肽序列发生改变，或者突变可以导致编码多肽序列发生改变。例如，突变可以导致编码多肽序列发生替换。对于编码多肽序列，突变可以导致移码。术语“同源性”或“同源的”指同一性的程度。可以有部分同一性或完全同一性。 部分同源的序列是与另一序列相比具有小于100%序列同一性的序列。“杂合的”指在同源染色体片段中一个或多个基因座具有不同的等位基因。如本文所用，“杂合的”也指可在其中一个或多个基因座检测到不同等位基因的样品、细胞、细胞群或生物体。杂合的样品也可用本领域已知的方法——例如核酸测序——进行确定。例如， 如果测序电泳图在单个基因座显示两个峰，而且这两个峰大小大致相同，则该样品可被表征为杂合的。或者，如果一个峰小于另一个峰，但它是较大峰大小的至少约25%，则该样品可被表征为杂合的。在一些实施方式中，较小峰是较大峰的至少约15%。在其他实施方式中，较小峰是较大峰的至少约10%。在其他实施方式中，较小的峰是较大峰的至少约5%。 在其他实施方式中，检测到最小量的较小峰。本文所用的“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，其可以是单链或双链，并且呈现有义链或反义链。核酸可以包括DNA或RNA，并且可以来自天然或合成来源，可以含有任意组合的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸类似物。多核苷酸的非限定性实例包括基因或基因片段、基因组DNA、外显子、内含子、 mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸，分支多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离 DNA、任意序列的分离RNA、合成核酸、核酸探针和引物。多核苷酸可以是天然的或合成的。 多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物；尿嘧啶(uracyl)； 其他糖和连接基团，如氟核糖(fluororibose)和硫醇盐；以及核苷酸分支(nucleotide branches)。核酸可被修饰，例如通过与标记组分轭合。本定义包含的其他类型的修饰有加帽；用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸；以及引入化学实体将该多核苷酸与其他分子如蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体载体连接。核酸可以包括已被扩增的核酸(例如使用聚合酶链反应)。核酸片段通常包含至少约15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、500、1000
7个核苷酸或更多。较大的片段是可能的，并且可以包含约2000、2500、3000、3500、4000、 5000,7500 或 10000 个碱基。术语“特异性杂交”指两个享有高度互补性核酸序列之间的杂交反应，其中该杂交将感兴趣核酸和其他相关核酸之间的杂交排除在外。特异性杂交复合物在允许的退火条件下形成并在任意随后的洗涤步骤后保持杂交。核酸序列退火的允许条件通常可由本领域普通技术人员确定，并且可以，例如，在约6XSSC存在的情况下在65°C下发生。杂交的严格性可部分地参考进行洗涤步骤的温度表示。这些温度通常被选定为比特定序列在限定离子强度和PH下的热熔点(Tm)低约5°C至20°C。Tm是(在限定离子强度和pH下)50%的目标序列与完全配对的探针杂交的温度。本领域已知计算Tm和核酸杂交条件的等式。本文所用的术语“严格杂交条件”是指至少与下述杂交条件一样严格的杂交条件 在 50% 甲酰胺、5xSSC、50mM NaH2PO4, pH 6. 8、0· 5% SDS、0. lmg/mL 超声波处理的鲑鱼精子 DNA以及切Denhart溶液中在42°C下杂交过夜；用h SSC、0. 1 % SDS在45°C下洗涤；以及用0. 2x SSC、0. 1% SDS在45°C下洗涤。在另一个实例中，严格杂交条件应当不允许在一段 20个连续核苷酸上有两个以上碱基不同的两个核酸杂交。用作特异性扩增(即扩增特定目标核酸序列)或特异性检测(即检测特定目标核酸序列)目标核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能与目标核酸特异性杂交。如本文所用，用于扩增的“引物”是与目标核苷酸序列互补的寡核苷酸，该目标核苷酸序列在处于引物延伸启动(例如，与应用——如PCR——相关的引物延伸)的条件下时能作为合成的启动点，并在DNA或RNA聚合酶存在的情况下使核苷酸添加到引物的3’末端。在优选的实施方式中，引物的3’核苷酸与对应核苷酸位置的目标序列互补，以实现最优表达和扩增。“引物”可以天然存在于如纯化的限制性消化产物中，或可以合成产生。本文所用的术语“引物”包含全部形式的可被合成的引物，包括肽核酸引物、锁定核酸引物、 硫代磷酸修饰的引物、标记的引物，以及类似物。引物长度通常是至少约10、15、20、25、30、 35、40、45、50或更多个核苷酸。具体引物应用的最优长度可用H. Erlich，PCR Technology, Principles and Application for DNA Amplification(1989)中所述的方法容易地确定。“探针”指通过杂交与目标核酸相互作用的核酸。探针可以是寡核苷酸、人工染色体、人工染色体片段、基因组核酸、基因组核酸片段、RNA、重组核酸、重组核酸片段、肽核酸 (PNA)、锁定核酸、环状的杂环寡聚体、或核酸的轭合物。探针可包含修饰的核苷碱基和修饰的糖部分。探针可以与目标核酸序列完全互补或部分互补。探针可用于检测目标核酸的存在与否。探针(一个或多个)能用于例如根据目标的序列特征检测核酸序列中是否存在突变。探针可以是标记的或未标记的，或用本领域熟知的多种方式中任意一种进行修饰。探针可以与目标核酸特异性地杂交。探针的长度通常为至少约10、15、20、25、30、35、40、50个核苷酸或更多。在优选的实施方式中，NPMl探针与核酸特异性地杂交，该核酸包含与包含核苷酸位点1018和1019的SEQ ID NO 1的区域基本上同一的至少20个核苷酸。优选地， 探针与野生型NPMl序列或包含插入突变的NPMl序列特异性地杂交。本文所用的术语“可检测标记”是指用于鉴定感兴趣目标分子的分子、化合物或分子组(例如检测系统)。典型地，可检测标记代表检测系统的组分，并与另一分子相连，该分子与目标分子特异性地结合。在一些情况下，可检测标记可以直接被检测。在其他情况下， 可检测标记可以是结合对的部分，其随后能被检测到。来自可检测标记的信号能通过多种手段检测到，并且取决于可检测标记的性质。检测可检测标记的手段的实例包括但不限于光谱学手段；光化学手段；生物化学手段；免疫化学手段；电磁学手段；放射化学手段或化学手段，如荧光、化学荧光或化学发光；或任意其他适合的手段。术语“目标核酸”和“目标序列”在本文中可互换地使用，并且指拟被鉴定的核酸序列。目标序列可以是DNA或RNA。“目标序列”可以是基因组核酸。目标序列可以包括野生型序列；含有点突变、缺失或复制的核酸序列；来自单个基因的全部或部分，或来自多个基因的序列；来自一个或多个染色体的序列；或任意其他感兴趣序列。目标序列可以呈现特定基因的可选序列或等位基因。目标序列可以是双链或单链，或部分双链，或部分单链， 或发夹结构的分子。目标序列可以是约1-5个碱基、约10个碱基、约20个碱基、约50个碱基、约100个碱基、约500个碱基或更多。本文所用的术语“扩增(amplification/amplify) ”包括拷贝目标核酸从而增加所选核酸序列的拷贝数的方法。扩增可以是指数的或线性的。目标核酸可以是DNA或RNA。 用该方式扩增的序列形成“扩增子”或“扩增产物”。尽管后文所述的示例性方法涉及使用聚合酶链反应(PCR)的扩增，但本领域熟知许多其他扩增核酸的方法(例如，等温方法、滚环方法等等)。本领域技术人员会理解，这些其他方法可以代替PCR方法或与PCR方法一起使用。参见，例如，Saiki，“Amplification of Genomic DNA"in PCR Protocols (1990), Innis et al. , Eds. , Academic Press,San Diego,CA,pp 13-20 ；ffharam,et al. , Nucleic Acids Res. (2001), Jun 1 ；29(11) :E54-E54 ； Hafner, et al. ， Biotechniques (2001), 4 852-6，858，860。如本文所用，术语“约”就定量而言是加或减10%。如本文所用，术语“正常核型”指没有染色体畸变的细胞，染色体畸变包括但不限于移位、倒置以及染色体外成分如微卫星DNA的存在。本文所用的术语“接合性状态”指如通过本领域已知的和本文所述的测试方法所确定表现为杂合、纯合或半合的样品、细胞群或生物体。术语“核酸的接合性状态”指确定核酸来源是否表现为杂合、纯合或半合。“接合性状态”可以指序列中单个核苷酸的差异。在一些方法中，单个突变的样品的接合性状态可分为纯合野生型、杂合型(即一个野生型等位基因和一个突变等位基因)、纯合突变型或半合型(即野生型或突变型等位基因单个拷贝)。由于临床实验室中常规进行的对血浆或细胞样品的直接测序不能可靠地区分半合性和纯合性，所以在一些实施方式中这两类被分为一组。例如，没有或最小量野生型核酸被检测到的样品被称为“半合/纯合突变型”。本文所用的短语“确定预后”指预测患者病症的病程或结果的过程。术语“预后” 不是指100%准确地预测病症的病程或结果的能力，而是指确定表现出给定病症/标记的患者与没有表现出该病症的那些个体相比发生某一病程或结果的可能性的增加或减少。预后的性质取决于具体的疾病和被评价的病症/标记。例如，预后可表示为患者预期存活的时间量、疾病缓解的可能性或疾病预期维持缓解的时间量。附图简述

图1是核磷蛋白(NPMl)基因及NPMl基因的产物核磷蛋白的示意图。术语“NES”、 “NLS”和“NoLS”分别表示核磷蛋白的核输出信号、核定位信号和核仁定位信号。“**”表示 NPMl基因和核磷蛋白中的突变位点。
9图2A显示了在AML患者中鉴定出的外显子12中的多种NPMl突变的核苷酸序列。 NPMl突变体序列相对于野生型(“WT”)NPM1序列被显示。图2B显示了由图2A所示的突变产生的核磷蛋白的部分核仁定位信号(以SEQ ID NO 2的氨基酸观6开始)。图3显示了骨髓细胞、血浆和外周血细胞中存在的NPMl突变的检测结果。A部分表示来自单个AML患者的外周血细胞(PB细胞；上)、骨髓细胞(BM细胞；中)和外周血浆 (下)的PCR扩增产物的大小分析。WT NPMl(212bp)存在于每个样品类型中，而含有4bp插入的突变型NPMl(216bp)仅在骨髓和血浆中被检测到。最左侧的峰代表200bp的标准品。 B部分表示与WT患者相比杂合患者中NPMl突变的序列分析。插入位点用黑框画出，表明产生的RNA中移码的起始(自插入位点从右向左阅读)。图4显示了 NPMl突变的大小分析的结果。分析是在AML患者血浆上进行的。结果揭示了新的4bp缺失突变。PCR扩增产物的大小分析区分出WTNPMl (212bp ；下)、上文所述的4bp插入突变Ql6bp冲)和新的NPMl的4bp缺失突变Q08bp ；上)。最左侧的峰代表200bp的标准品。图5显示了 NPMl插入突变的存在与AML患者改善的临床结果之间的关联。NPMl 突变给对治疗反应缓慢的AML患者带来了显著的存活优势。Kaplan-Meier图将数周内的患者存活率作为花费35天以上的AML患者群体的比例给出，以证明对治疗的反应。显示患者存活周数与花费35天以上证明对治疗反应的AML患者群体的比例。该图比较了 NPMl突变阳性和突变阴性患者，显示携带NPMl突变的患者具有显著的存活优势(P = 0. 027)。(E，总事件；N，死亡数)。图 6 提供了人 NPMl 基因的 cDNA 序列(SEQ ID NO :1)。图7提供了核磷蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :2)。图 8 提供了 FLT3 的 cDNA 序列(SEQ ID NO :5)。发明详述本发明基于下列发现能使用从患者的无细胞体液(例如血清或血浆)中分离的核酸可靠地检测NPMl基因的突变，该突变导致多种血液学恶性肿瘤。具体而言，已经发现外周血血浆是检测AML患者中NPMl突变的可靠样品类型。同时检测骨髓细胞和血浆时，在成对的样品中存在完全一致性。此外，血浆分析显示了比用外周血细胞进行NPMl突变分析更高的灵敏度。不欲受任何理论的约束，认为癌细胞高于正常细胞的周转率导致了从血浆中检测 NPMl突变比从外周血细胞检测有更高的灵敏度。由于该周转，癌细胞的DNA、RNA和蛋白质进入循环，它们都可以作为检测的底物。在血液学恶性肿瘤——例如AML和MDS中，大量肿瘤细胞在骨髓中。然而，只有相对少的白血病细胞在一些患者的外周血中循环，因此，在一些患者中外周血分析对于检测NPMl突变是不可靠的。血浆和/或血清检测具有优势，因为其含有源自骨髓肿瘤细胞的核酸。而且，检测血浆/血清最小化了残留正常细胞对所得测量值的影响，从而有助于避免有时由于残留正常细胞“稀释”恶性骨髓样品引起的低估。认为这是由于这样的事实在血浆中正常细胞程序性细胞死亡产生的碎片被网状内皮系统迅速清除，而白血病细胞周转所产生的碎片则很少被有效地清除。如本文所述，血浆被证明比外周血细胞更灵敏，有8 %的基于细胞的检测产生假阴性结果。外周血细胞中的假阴性结果可能主要归因于骨髓疾病没有循环的白血病细胞，而血浆中含有来自已在骨髓中死去的恶性肿瘤细胞的遗传物质，从而给出阳性结果。此外，血浆与外周血细胞同样采集便利，避免对痛苦性和创伤性获取骨髓样品的需要。为了进一步确认检测血浆的临床价值，将突变结果与临床观察关联，该临床观察与进行骨髓检测时所报告的类似。具有中等细胞遗传学的NPMl突变-阳性患者较好的存活与实现缓解需要35天以上的治疗存在显著关联。这一观察说明，在35天治疗中存活而没有显示缓解迹象的AML患者，如果他们具有NPMl突变，则不应当被认为是高危的。核磷蛋白基因(NPMl)核磷蛋白基因(NPMl)的杂合突变最近被描述为急性髓性白血病(AML)中最频繁的基因损害之一。NPMl基因位于人染色体5q35上。其包含12个外显子。图1显示了 NPMl 基因的示意图。包含NPMl基因的基因组DNA的示例性序列可以在NCBI GenBank登录号 NW_001838954中找到，该序列通过弓|用并入本文。NPMl mRNA的几种变体在本领域中是已知的。许多已知序列是全长cDNA序列， 而有些是部分cDNA序列。示例性NPMl cDNA序列包括但不限于NCBI GenBank登录号NM_002520、NM_199185、NM_001037738、BC002398、BC050628、BC021983、BC021668、 BC016824、BC016768、BC016716、BC014349、BC012566、BC008495、DQ303464、BC009623、 BC003670、AY740640、AY740639、AY740638、AY740637、AY740636、AY740635、AY740634、 M286990上述全部NPMl变体的序列通过引用并入本文。SEQ ID N0:1(图6)中提供了 NPMl 基因的一个示例性cDNA序列。AML中已鉴定出的最常见的NPMl突变是1_或2_四核苷酸插入、4_碱基对(bp) 或5-bp缺失结合9-bp插入以及9-bp缺失结合14-bp插入。这些突变大部分位于外显子 12中，并且显示于图2A中。NPMl存在于两个可变剪接的同种型中。普遍存在的同种型B23. 1存在于所有组织中，并且包含294个氨基酸，而截短的蛋白B23. 2缺少B23. 1的最后35个C端氨基酸，并且以非常低的水平表达。NPMl分子(图1中示意性地示出)包含不同的功能结构域，包括形成NPM 二聚体或六聚体所需的N端同型寡聚(homo-oligomerization)结构域；在靶向其他蛋白质中涉及的异型二聚结构域，如核仁蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P14/ 另起读框(P14ARF，以下简称ARF)；以及对于与核糖体RNA加工相关的RNA缔合至关重要的 C端核酸结合结构域。SEQ ID NO :2(图7)中提供了 B23. 1 NPMl同种型的氨基酸序列。尽管大部分NPMl位于核仁内，但其能从核内穿梭到胞质内。核定位信号(NLS)驱使NPMl从胞质进入核浆，其中NPMl通过其核仁定位信号(NoLQ移位至核仁。NoLS中特别重要的残基是SEQ ID NO 2的色氨酸288和色氨酸290残基。NPMl保持在核仁内，即使其在SEQ ID NO 2的残基94-102和42-49中含有高度保守的疏水性富含亮氨酸的核输出信号(NES)基序，该基序驱动NPMl离开细胞核。NPMl突变体最独特的特征之一是其在白血病细胞胞质内的异常定位。这与白血病突变体C端的两个改变有因果关系(i)产生了额外的富含亮氨酸的NES基序；和(ii)丧失了在SEQ ID NO 2的288和290位之一或两者处的色氨酸残基，该残基对NPMl的核仁定位是至关重要的。两个色氨酸的突变与非常常见的NES基序L-XXX-V-XX-V-X-L有关；色氨酸观8的保留与稀有NES变体有关，其中第二位的缬氨酸被亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸或甲硫氨酸代替(Falini et al. Blood. 2006 ； 107 :4514-23)。大部分NPMl突变体共有最后 5个氨基酸残基VSLRK。AML中的NPMl突变通常与正常细胞遗传学和FLT3基因内部串联复制(FLT3-ITD) 相关。多项研究表明，在具有正常核型的AML患者组中，具有NPMl突变的患者具有类似或显著高于具有野生型NPMl AML患者的完全缓解率(Boissel et al. Blood. 2005 ； 106 3618-3620 ；Falini et al. N. Engl. J. Med. 2005 ；352 :254-266 ；Suzuki et al. Blood. 2005 ； 106 :2854-2861 ；Dohner et al. Blood. 2005 ；106 :3740-6)。多数研究显示了在无事件(event-free)存活率和总存活率中向有利结果的统计趋势。在其他分子异常背景下的进一步分析显示，具有NPMl突变而没有伴随的fms相关酪氨酸激酶3内部串联复制(FLT3-ITD)的患者比具有FLT3-ITD的AML患者具有更有利的预后，并与年轻患者中5年约60%的存活概率相关(Dohner et al. Blood. 2005 ；106 3740-6)。FLT3 基因FLT3基因位于人染色体13上。NCBI GenBank登录号NG_007066中公开了人染色体中FLT3基因的示例性序列，其通过引用并入本文。图8中示出了 FLT3基因的示例性 cDNA序列。在一些实施方式中，本发明提供在无细胞体液中单独检测FLT3基因或同时检测 FLT3基因与NPMl的方法。在优选的实施方式中，本发明提供单独检测FLT3基因中一个或多个突变或同时检测FLT3基因中一个或多个突变与NPMl基因中一个或多个突变的方法。生物样品采集和制备本发明的方法和组合物可用来使用从个体获得的生物样品检测NPMl核酸(例如， 基因组DNA和/或RNA)中的突变。核酸可根据本领域技术人员熟知的任意方法从样品中分离。如果必要，样品可用离心或类似方法收集或浓缩。样品中的细胞可被裂解，如用酶、 加热、表面活性剂、超声波或其组合进行处理，以便制备无细胞液体。可选地，NPMl基因中的突变可根据美国专利公开US 2007/0248961所述的方法用无细胞体液进行检测，其通过引用并入本文。血浆或血清制备方法本领域熟知血浆或血清的制备方法。可以使用“新鲜”血浆或血液，或冷冻(储存) 并随后融化的血浆或血清。冷冻(储存)的血浆或血清应当最佳地保持在-20至-70摄氏度的储存条件下，直到被融化和使用。“新鲜”血浆或血液应放入冰箱或保持在在冰上直到被使用，核酸(例如，RNA，DNA或总核酸)提取应尽快进行。下文描述了示例性方法。血液可用标准方法抽入采集管，优选硅化处理的玻璃管中，其中不含有制备血浆用抗凝剂或含有EDTA、柠檬酸钠、肝素或制备血浆用类似抗凝剂。如果制备血浆或血清用于储存，优选的方法——尽管不是绝对要求——是将血浆或血清在冷冻前首先从全血中分离。这样能减少冷冻和融化的细胞裂解释放出的额外的胞内RNA的负担，该细胞能通过释放PCR抑制剂如卟啉和血色素，降低扩增分析的灵敏度或干扰扩增分析。“新鲜”血浆或血清可通过离心从全血中分离，其优选使用在300-800倍重力下温和离心5至10分钟，或用其他标准方法分离。应该避免能分离出凋亡小体的高离心速率。由于肝素可以干扰RT-PCR，使用肝素化的血液需要用肝素酶预处理，随后在逆转录前除去钙。Imai，H. ,et al. ,J.Virol.
12Methods36 =181-184, (1992)。因此，EDTA对于计划PCR扩增的血液样品是优选的抗凝剂。核酸提取和扩增任选地，无细胞液体中的核酸可被扩增以便易于突变分析。多种提取方法适于分离DNA或RNA。适合的方法包括酚和氯仿提取。参见ke Maniatis et al. , Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press,page 16. M(1989)。多种商业试剂盒也能得到适合的DNA和RNA，其包括但不限于 QIAamp 微型血液试剂盒、Agencourt Genf ind 、Roche Cobas Roche MagNA Rire 或使用Eppendorf Phase Lock Gels 的酚氯仿提取以及NucliSens提取试剂盒 (Biomerieux, Marcy 1' EtoiIe， France)。胃砠^^去巾，^Tffi MagNAPure LC mRNA HSi^ 剂盒禾口 Mag NA Pure LC Instrument (Roche Diagnostics Corporation, Roche Applied Science, Indianapolis, IN)从患者血液/骨髓样品中提取mRNA。从组织、细胞、血浆或血清中提取的核酸可用本领域熟知的核酸扩增技术扩增。这些扩增方法中有许多也可以通过设计以特定方式与具体目标序列相互作用或杂交的寡核苷酸引物或探针，用于简单地检测突变的存在。这些技术的实例而非限制包括聚合酶链反应(PCR)；逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)；嵌套式PCR;连接酶链反应。参见Abravaya， K.，et al.，Nucleic Acids Research 23 :675-682, (1995)；分支 DNA 信号扩增，Urdea, M. S.，et al.，AIDS 7(suppl 2) =Sll-S 14，(1993)；可扩增 RNA 报道分子；Q-β 复制；基于转录的扩增；回旋式DNA扩增；链移位活化；成环探针技术；基于核酸序列的等温扩增 (NASBA)。参见 Kievits，Τ. et al.，JVirological Methods 35:273-286，(1991)；侵染技术；或其他序列复制分析或信号扩增分析。血清和血浆RNA灵敏、特异且丰富，可用于替代基于(基因组)DNA的检测。RNA 可以根据 Boom，R.，et al.，J. Clin. Micro. 28 :495-503, (1990)的方法或改进，用硅颗粒、 玻璃珠或硅藻从血浆或血清中提取。描述了由Cheung，R. C.，et al.，J. Clin Micro. 32 2593-2597，(1994)改进的方法的应用。例如，按大小分离的硅颗粒是按以下方法制备的将60克二氧化硅(Si02，Sigma Chemical Co.，St. Louis,Mo.)悬浮在500毫升脱矿物质的灭菌双蒸水中。然后将悬浮液在室温下静置M小时。吸去430毫升上清液，加入脱矿物质的灭菌双蒸水至体积为500毫升， 将颗粒物重悬浮在其中。在又静置5小时后，吸去440毫升上清液，加入600微升HCl (32% wt/vol)以调整悬浮液的pH至2。分装悬浮液并遮光保存。裂解缓冲液制备方法为将120克硫氰酸胍(GuSCN，Fluka Chemical, Buchs，
Switzerland)溶解在 100 毫升 0. IM Tris 盐酸(Tris-HCl) (pH6. 4)、22 毫升 0. 2MEDTA-
用 NaOH 调整 pH 至 8. O-禾口 2. 6 克 Triton X-100 (Packard Instrument Co.，Downers
Grove, 111.)中。然后，将溶液混勻。洗涤缓冲液制备方法为将120克硫氰酸胍(GuSCN) 溶解在 100 毫升 0. IM Tris-HCl (pH6. 4)中。100至250微升(在微小疾病(minimal disease)的情况下需要更多量)血浆或血清与40微升如上制备的硅悬浮液和900微升如上制备的裂解缓冲液混合，用Eppendorf 5432混合器在室温混合超过10分钟。然后将混合物以12000Xg离心1分钟，吸出并弃去上清液。然后用450微升如上制备的洗涤缓冲液将硅-RNA沉淀洗涤两次。再将该沉淀用 1毫升70% (vol/vol)乙醇洗涤两次。最后将该沉淀用1毫升丙酮洗涤，并在56摄氏度的加热块(heat block)上干燥10分钟。将该沉淀在56摄氏度下重悬浮于20至50微升二乙基焦碳酸酯处理的水中10分钟，以洗脱RNA。该样品也能可选地用TE缓冲液在56摄氏度下洗脱10分钟，TE缓冲液由以下组成10毫摩尔Tris-HClU毫摩尔EDTA(pH 8.0)以及 RNA 酶抑制剂(RNAsin, 0. 5U/微升，Promega)，有或无蛋白酶 K (100ng/ml)，如 Boom, R.，et al.，J. Clin. Micro. 29 :1804-1811, (1991)所述。在洗脱后，将样品以 12000Xg 离心 3 分钟，回收含有RNA的上清液。作为可选的方法，RNA可以用 Chomczynski，P. and Sacchi，N.，Analytical Biochemistry 162:156-159，(1987)描述的酸性硫氰酸胍盐-酚-氯仿提取方法，或 Chomczynski，P.，Biotech 15:532-537，(1993)描述的改进的方法从血浆或血清中进行提取，其中每一个通过引用并入本文。循环的胞外DNA，包括源自肿瘤的胞外DNA，也存在于血浆和血清中。由于在上述的RNA提取方法中，该DNA会另外不同程度地被提取，因此在进行进一步的RNA分析之前， 期望或有必要(取决于临床目的)进一步纯化该RNA提取物并除去痕量DNA。这可以用DNA 酶,例如通过 Rashtchian，A.，PCR Methods Applic. 4 :S83_S91，(1994)所述的方法实现。可选地，进一步RNA分析用引物可被构建，其有利于RNA产物的扩增，而不利于杂质DNA的扩增，如通过使用跨过RNA中剪接点的引物或跨过内含子的引物进行。扩增RNA 而非杂质 DNA 的可选方法包括 Moore，R. E.，et al.，Nucleic Acids Res. 18 :1921, (1991) 和 Buchman，G. W. , et al. ,PCR Methods Applic. 3 :28-31，(1993)所述的方法，这些方法使用含有dU的寡核苷酸作为接头引物(adaptor primer)。由于RNA在常规处理和分析中的不稳定性，可以期望提取RNA而分析DNA。分离的RNA序列可利用逆转录重新生成为DNA，这可以根据先前公开的程序进行。可以使用多种逆转录酶，其包括但不限于MMLV RT ；MMLV RT的RNA酶H突变体，如Superscript和 SuperscriptlKLife Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.) ；AMV RT;以及来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus)的热稳定逆转录酶。例如，可用于将从血浆或血清中提取的RNA转化为cDNA的一种但不唯一的方法是由Superscript II Preamplification system (Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md. ；catalog no. 18089—011)改进的方案，如 Rashtchian，Α.，PCR Methods Applic. 4 :S83_S91，(1994)所述。突变检测核酸(例如总核酸)可以用适当的方法从患者的生物样品中提取并扩增。然后可以例如通过凝胶纯化来纯化扩增产物，并且所得纯化产物可被测序。核酸测序方法是本领域已知的；示例性测序方法包括ABI Prism BigDye Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City，CA)。然后可分析测序数据，目标核酸(例如，NPMl 或FLT3核酸)中是否存在一个或多个突变。测序数据也可被分析来确定样品中存在的野生型核酸与突变型核酸的比例。扩增或突变检测的可选方法是等位基因特异性PCR(ASPCR)。ASPCR利用模板和引物3’端碱基之间的配对或错配，这是本领域所熟知的。参见，例如美国专利5639611。另一种突变探测的方法是核酸测序。测序能够用任意数目的本领域已知的方法、 试剂盒或系统进行。一个实例是使用染料终止子化学和ABI测序仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)。测序也可涉及单碱基测定方法，如单核苷酸引物延伸(“SNapShot”测
14序法)或等位基因或突变特异性PCR。在其他实施方式中，目标核酸突变可通过任选包含可检测标记的多核苷酸探针杂交进行评价。该探针可用本领域已知的方法被可检测地标记。有用的标记包括，例如荧光染料(例如075 、073@、？11^、罗丹明、lanthamide phosphors、德克萨斯红、FAM、JOE、Cal Fluor Red 610 , Quasar 670 )；放射性同位素(WhH131I)；电子致密试剂 (例如，金)；酶(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)；比色标记(例如胶体金)；磁性标记(例如Dynabeads )；生物素；dioxigenin ；或抗血清或单克隆抗体可用的半抗原和蛋白质。其他标记包括能够分别与相应受体或互补寡核苷酸形成复合物的配体或寡核苷酸。标记可以直接引入待检测的核酸中，或其可以连接到与待检测的核酸杂交或结合的探针(例如寡核苷酸)或抗体上。在其他实施方式中，探针是TaqMan 探针、分子信标和Scorpions (例如 Scorpion 探针)。这些种类的探针基于荧光淬灭的原理，并且包括供体荧光团和淬灭部分。本文所用的术语“荧光团”指吸收特定波长(激发频率)的光并随后发射较长波长(发射波长)的光的分子。本文所用的术语“供体荧光团”指当接近淬灭剂部分时将发射能量供给或转移到淬灭剂上的荧光团。由于将能量供给到淬灭剂上，供体荧光团自身将发射很少特定发射频率的光——其是供体荧光团没有接近淬灭剂部分时所具有的光。本文所用的术语“淬灭剂部分”是指这样的分子在接近供体荧光团时吸收供体产生的发射能量，并且以热的形式耗散该能量或发射波长比供体发射波长长的光。在后者情况下，淬灭剂被认为是受体荧光团。淬灭剂部分可通过近端(即碰撞)淬灭或通过FSrster 或荧光共振能量转移(“FRET”)起作用。通过FRET的淬灭通常用于TaqMan 探针中，而近端淬灭(proximal quenching)用于分子信标和korpion 型探针中。适当的淬灭剂基于特定荧光团的荧光光谱进行选择。有用的淬灭剂包括，例如Black Hole 淬灭剂BHQ-I、 BHQ-2 和 BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.)以及 ATTO 系列淬灭剂(ΑΤΤ0 540Q、ATT0 580Q和 ATTO 612Q ；Atto-Tec GmbH)。TaqMan 探针(Heid，et al.，Genome Res 6 :986-994,1996)利用 Taq聚合酶的荧光的5’外切核酸酶活性测量cDNA样品中目标序列的量。TaqMan 探针是含有通常在5’碱基处或其附近的供体荧光团和通常在3’碱基处或其附近的淬灭部分的寡核苷酸。淬灭剂部分可以是诸如TAMRA的染料或可以是诸如4-4-(二甲基氨基苯基偶氮基)苯甲酸(DABCYL) 的非荧光分子。参见 Tyagi，et al.，16 NatureBiotechnology 49-53(1998)。当被照射时， 被激发的荧光供体通过FRET将能量转移给邻近的淬灭部分，而不是发出荧光。因此，在探针完整时，供体和淬灭剂的紧密接近阻止了供体荧光团的发射。TaqMan 探针被设计成与PCR产物的内部区域退火。当聚合酶(例如逆转录酶) 复制结合了 TaqMan 探针的模板时，其5’外切核酸酶活性裂解探针。这终止了淬灭剂的活性(无FRET)，而供体荧光团开始发射荧光，该荧光在每个循环中与探针裂解的速率成比例增强。通过监测报道分子染料荧光的增加来检测PCR产物的累积(注意引物没有被标记)。如果淬灭剂是受体荧光团，则可以通过监测受体荧光团荧光的减少来检测PCR产物的累积。对于korpion引物，序列特异性引发(priming)和PCR产物检测用单个分子来实现。korpion引物在未杂交状态维持茎-环结构。荧光团被连接到5’端，并且通过与3’
15端相连的部分淬灭，尽管在适当的实施方式中，这种排列可以转换。茎的3’部分也包含与引物的延伸产物互补的序列。该序列通过不可扩增单体与特异性引物的5’端相连。在引物部分延伸后，特异性探针序列能够与延伸的扩增子中其互补序列结合，从而打开发夹结构环。这阻止了荧光被淬灭，并且观察到信号。特异性目标通a^orpion引物的反向引物部分和引物部分进行扩增，形成延伸产物。由于&011^011引物的探针成分(例如JAK2探针)与延伸产物结合造成荧光团和淬灭剂分离，而产生荧光信号。样品中接合性状态和野生型与突变型核酸的比率可通过本领域已知的方法包括序列特异性、定量检测方法进行确定。其他方法可以包括确定标准测序电泳图——如用ABI 测序系统(Applied Biosystems,Foster City CA)生成的标准测序电泳图——的测序峰曲线下的面积。例如，电泳图上代表特定核苷酸的位置只有单个峰例如“G”表明样品中的核酸在该位置只有一种核苷酸“G”。然后，该样品可被归类为纯合的，因为只检测到一个等位基因。电泳图上同一位置有两个峰，例如“G”峰和“T”峰表明，该样品含有两种核酸；一种核酸在所述核苷酸位置出携带“G”，另一种核酸在所述核苷酸位置处携带“T”。然后，该样品可被归类为杂合的，因为检测到一个以上等位基因。所述两个峰的大小可被确定(例如，通过确定每个曲线下的面积)，并且可以计算出两种不同种类核酸的比率。野生型核酸与突变型核酸的比率可用于监测疾病进展、确定治疗或进行诊断。例如，携带特定突变的癌细胞数目可能在疾病或治疗的过程中发生改变。 如果在疾病早期建立了基线比率，之后确定的突变型核酸与野生型核酸的较高比率可以表明疾病正在恶化或治疗无效；携带突变的细胞数目在患者体内可以渐增。突变型核酸与野生型核酸的较低比率可以表明治疗有效或疾病没有进展；携带突变的细胞数目在患者体内渐少。在某些实施方式中，NPMl核酸包括插入或缺失突变。通过确定至少一部分从患者分离的NPMl核酸的大小，可以方便地鉴定这些突变。本领域熟知检测不同大小的多核苷酸存在或量的方法，并且其中每种方法都可以用于本文所述的方法中。只要核酸彼此之间有至少一个核苷酸不同，所采用的大小分离/检测技术就应当允许分辨核酸。分离可在变性或非变性或天然条件下进行——即，分离可在单链或双链核酸上进行。优选分离和检测允许检测少至1个核苷酸的长度差异。进一步优选分离和检测能以高通量形式进行，这允许实时或同时确定循环反应过程中获取的多个反应整分试样中的核酸丰度。有用的分离和分析扩增产物的方法包括但不限于电泳(例如琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳(CE)，层析 (HPLC)和质谱。在一个实施方式中，CE是优选的分离手段，因为它对至少10-1000个碱基对范围内的多核苷酸提供了分辨率为单个碱基对的优异分离。CE可以通过本领域已知的方法进行，例如，如美国专利号6217731、6001230和5963456中所公开的，其通过引用并入本文。高通量 CE 装置可以商购，例如，Spectrumedix Corporation (State College, Pa.)的 HTS9610 高通量分析系统和SCE9610全自动96-毛细管电泳基因分析系统；Beckman Instruments Inc (Fullerton, Calif.)的 P/ACE5000 系列和 CEQ 系列；以及 ABI PRISM 3100 基因分析仪 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.)。在这些装置中，在CE柱末端附近，扩增的 DNA片段通过测量荧光标记信号的荧光检测器。这些仪器为荧光标记的PCR产物提供自动高通量检测。
16本文所述的方法中CE的采用允许与传统平板凝胶电泳相比更高的生产率。通过使用毛细管凝胶，分离速度比传统平板凝胶系统提高了约10倍。技术人员使用CE也能同时分析多个样品，这对高通量很重要。这是通过例如使用多毛细管系统实现的。在一些情况下，检测来自DNA碱基的荧光可以因来自多孔基质和毛细管壁的光散射而复杂化。然而，可以使用共聚焦荧光扫描仪来避免由于光散射带来的问题(Quesada et al. , Biotechniques(1991), 10 :616-25)。在一些实施方式中，可以使用琼脂糖凝胶电泳分析和检测核酸的大小。本领域熟知进行琼脂糖凝胶电泳的方法。参见Sambrook et al. ,Molecular Cloning =A Laboratory Manual(2nd Ed.)(1989)，Cold Spring Harbor Press, N. Y。在一种实施方式中，检测是通过DNA印迹法和与标记探针杂交进行的。本领域技术人员熟知DNA印迹法涉及的技术，这些技术可以在关于分子方案的许多标准书籍中找到。参见Sambrook et al.，(1989)。简要而言，用凝胶电泳分离扩增产物。然后将凝胶与膜如硝基纤维膜接触，以允许核酸和非共价结合物转移。随后，将该膜与轭合发色团的探针温育，该探针能与目标扩增产物杂交。通过将膜暴露于X线胶片或用离子发射检测装置进行检测。
实施例实施例1 源自血浆的核酸中NPMl突变的检测为评价血浆作为突变分析的遗传物质的来源的可行性，来自31位新诊断的AML患者的骨髓细胞、外周血细胞和外周血血浆被同时进行NPMl突变分析，并且在三种样品类型之间进行结果比较。用BioRobot EZl Blood DNA 试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)从患者骨髓或全血样品提取基因组DNA。用NucliSens提取试剂盒在fesyMag系统(bioMerieux，Durham, NC)上从血浆中提取总核酸。用与NPMl内含子11杂交的正向引物和与NPMl外显子12杂交的反向引物进行所有样品类型的NPMl基因PCR扩增。正向和反向引物用6-羧基荧光素(6-FAM ;Eurogentec，San Diego, CA)标记。NPMl突变型或野生型等位基因通过使用 ABI3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA)测定 PCR 产物的大小来进行确证。正向和反向引物的序列在下面给出。正向弓丨物5，-tta act ctc tgg tgg tag aat gaa_3，(SEQ ID NO :3)反向弓丨物5，-tgt tac aga aat gaa ata aga cgg_3，(SEQ ID NO :4)使用这些扩增引物，野生型(WT)NPMl核酸显示212bp的峰，而NPMl插入突变体除 NPMl WT峰外还显示额外的216bp的峰(参见例如图3A)。图证明，4碱基插入/移码突变也能够在与野生型相比杂合的患者中鉴定到，并且该突变是由CTCT插入引起的。这些结果证明，上述方法稳定(robust)并且能区分从所有测试来源包括骨髓细胞、外周血细胞和血浆分离的野生型和4bp插入NPMl突变型核酸。来自上述31位患者的血浆显示与骨髓细胞完全一致，但观测到与外周血细胞的差异。在31对外周血血浆和骨髓细胞样品中有6对检测到了突变的NPMl核酸。然而，在评价外周血细胞时，应用外周血细胞分析，6个含有突变的NPMl核酸的样品中一个(如在骨髓细胞和血浆中所评价的那样)被错误地鉴定为含有野生型NPM-I (图3A)。在该单个患者
17中，外周血细胞的NPMl核酸突变评价被证明不准确，但是使用骨髓细胞和血浆样品的评价显示了无误的经由插入的突变。在NPMl突变基于血浆的测试的准确性的进一步支持中，当测定血浆时，没有突变阳性的外周血或骨髓细胞样品给出假阴性。这些数据证实了，基于血浆的测定用于检测血浆核酸样品中NPMl突变。实施例2 =AML和MDS患者中的NPMl突变和新突变的鉴定^ ^ ^ University of Texas> MD Anderson Cancer Center ^ ! 的AML患者(98个样品)和骨髓增生异常综合征(MDQ患者Q8个样品)的成对血浆和外周血细胞样品进行NPMl核酸分析。所有样品采集自在开始治疗前先前未治疗过的患者。在获得分析用样品时，所有MDS患者都没有接受任何种类的治疗。所有样品用经伦理审查委员会(Institutional Review Board)批准的方法采集，所有患者提供了知情许可， 并且该研究符合世界医学协会(World Medical Association)的伦理规定(赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki))。临床数据通过病历审查(chart review)收集，并且是 MD Anderson Cancer Center的部分白血病数据库。诊断基于完整的形态学分析、免疫表型分析、细胞遗传学分析和分子分析，并且分类是根据法美英(French American British) (FA^分类法进行的。所有MDS患者需要至少两个谱系的发育异常证据。细胞遗传学状态被分为有利的(t(15;17)、t(8，21)或invl6)、不利的(_5，-7或复杂(彡3)异常)或中等的(所有其他的)。表现状态(PQ，用^ibrod打分系统确定，分为好(O或1)或坏(2-4)。 有效者(responder)是根据完全有效(CR)的国际工作组标准(International Working group criteria)达到完全有效(CR)的患者。本研究中包括的AML和MDS患者的特征列于表1中。AML患者的年龄中位数是 62 (范围，18至82)，而MDS患者年龄中位数是68 (范围，43至81)。大部分AML患者具有中等(34% )或差(59% )的细胞遗传学状态。根据法美英(FAB)分类法，一半MDS患者被分类为患有难治性贫血伴原始细胞过多转变型(RAEB-T)，46%患有难治性贫血伴原始细胞过多(RAEB)。只有3%的患者患有急性前骨髓细胞性白血病，而24%患有白血病伴单核细胞分化(leukemia with monocytoid differentiation)(表 1)。AML 和 MDS 患者的分类基于 FAB分类法，而不是世界卫生组织(WHO)分类法。表1AML和MDS患者的特征
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权利要求
1.确定诊断有急性髓性白血病(AML)的个体的预后的方法，所述方法包括确定NPMl核酸中是否存在一个或多个突变，其中所述NPMl核酸从所述个体的无细胞体液获得，以及提供所述个体的预后，其中NPMl基因中存在一个或多个突变表明所述个体相对于诊断有AML而没有所述一个或多个突变的个体预后较好。
2.权利要求1所述的方法，其中所述无细胞体液是血清或血浆。
3.权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述是否存在一个或多个突变是相对于 SEQ ID NO 1 确定的。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸是基因组DNA。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸是mRNA。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突变之一包含 CTCT插入。
7.权利要求6所述的方法，其中所述插入是在对应于SEQID NO 1的1018位的核苷酸之后。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突变至少一个选自图2A或图2B。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，还包含检测FLT3基因中是否存在一个或多个突变。
10.权利要求9所述的方法，其中所述FLT3基因中的一个或多个突变是内部串联重复的复制。
11.权利要求9所述的方法，其中NPMl基因中存在一个或多个突变和FLT3基因中不存在一个或多个突变表明所述诊断有AML的个体预后较好。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，还包含确定所述个体的细胞遗传学。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法包含扩增从所述AML患者的无细胞体液中获得的NPMl核酸，以及将所述扩增的NPMl核酸与寡核苷酸探针杂交，所述寡核苷酸探针能够在杂交条件下特异性地检测至少NPMl核酸突变的存在。
14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述方法包含确定至少部分所述NPMl核酸的大小，其中大小增大表明存在插入突变。
15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述预后与缓解率有关。
16.权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述AML患者的所述预后与总存活率有关。
17.确定诊断有AML的个体的预后的方法，所述方法包括确定NPMl核酸中是否存在插入突变，其中所述NPMl核酸从所述个体的无细胞体液获得，以及提供所述个体的预后，其中存在所述插入突变表明所述个体相对于诊断有AML而没有所述插入突变的个体预后较好。
18.权利要求17所述的方法，其中所述插入突变包含在对应于SEQID NO :1的1018位的核苷酸之后的CTCT插入。
19.权利要求17-18中任一项所述的方法，还包括检测FLT3基因中是否存在一个或多个突变。
20.权利要求19所述的方法，其中FLT3基因中的所述一个或多个突变是内部串联重复的复制。
21.权利要求19所述的方法，其中存在所述插入突变和所述FLT3基因中不存在突变表明所述诊断有AML的个体预后较好。
22.权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述预后与缓解率或总存活率有关。
23.权利要求17-22中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定至少部分所述NPMl 核酸的大小，其中大小增大表明存在插入突变。
24.权利要求17-23中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用包含SEQID N0:3或 SEQ ID NO 4序列的扩增引物扩增所述NPMl核酸。
25.权利要求17-M中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用包含SEQID NO :3和 SEQ ID NO 4序列的扩增引物对扩增所述NPMl核酸。
26.诊断患有血液学疾病的个体的方法，所述方法包括确定NPMl核酸中是否存在移位，其中所述NPMl核酸从所述个体的无细胞体液获得，以及在检测到NPMl核酸中的移位时诊断所述个体患有血液学疾病。
27.权利要求沈所述的方法，其中所述血液学疾病选自间变性大细胞淋巴瘤、急性早幼粒细胞白血病和急性髓性白血病。
28.权利要求沈-27中任一项所述的方法，其中所述移位在NPMl基因和第二基因之间， 所述第二基因选自间变性大细胞淋巴瘤激酶、视黄酸受体α和脊髓发育不良/髓性白血病因子1。
29.权利要求沈-28中任一项所述的方法，包括进一步确定NPMl核酸中是否存在一个或多个突变。
30.权利要求四所述的方法，其中是否存在一个或多个突变是相对于SEQID Ν0:1确定的。
31.权利要求30所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突变之一包含CTCT插入。
32.权利要求31所述的方法，其中所述插入在对应于SEQID NO=I的1018位的核苷酸之后。
33.权利要求30所述的方法，其中所述NPMl核酸中的所述突变至少一个选自图2Α或图2Β。
34.权利要求沈-33中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸是基因组DNA。
35.权利要求沈-34中任一项所述的方法，其中所述NPMl核酸是mRNA。
全文摘要
本发明涉及检测无细胞体液样品中NPM1核酸并确定该核酸是否含有一个或多个包括插入和缺失在内的突变的方法。该方法可用于预测具有NPM1基因突变的细胞的AML患者预后。
文档编号C12Q1/68GK102186995SQ200980141251
公开日2011年9月14日 申请日期2009年10月14日 优先权日2008年10月17日
发明者M·阿尔比塔 申请人:奎斯特诊断投资公司