体液的细胞分析的制作方法

体液的细胞分析的制作方法
【专利摘要】本文提供在血液学分析器上进行细胞分析的方法。在各种方面，所述方法提供红细胞(RBC)与白细胞(WBC)之间的分离和/或区分，其利用荧光染料来选择性染色WBC以使得其发出更强的荧光信号。所述方法提供对于WBC和RBC的最佳检测极限，从而允许分析具有稀少细胞浓度的样品。可使用仅仅一种试剂来制备用于体液分析的单一稀释液，从而简化所述体液分析。使用本公开的多个方面中描述的无溶胞方法来实现对于WBC的最小破坏。
【专利说明】体液的细胞分析
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年12月27日提交的美国临时专利申请序号61/580，623的优先权权益；所述美国临时专利申请的整个公开内容以引用的方式整体并入本文。
【背景技术】
[0003]各种方法用于细胞分析，包括经由光或荧光显微术的目测和/或自动检验。通常实施这些类型的细胞检查和分析以便获得关于样品中的细胞谱系、成熟阶段和细胞计数的信息。
[0004]流式细胞术是在非均质样品中的不同细胞类型之间进行识别和区分的方法。在流式细胞仪中，细胞一次一个或几乎一次一个穿过感测区域，其中每个细胞被能量源照射。典型地，单一波长光源(例如，激光器等)用作能量源并且各种传感器中的一个或多个基于细胞与施加能量的相互作用来记录数据。流式细胞术普遍地用于血液学并且已经尤其成功地诊断血液癌症。除了流式细胞术以外，其它分析方法用于血液学中并且表征细胞群体。
[0005]血液样品倾向于具有高浓度的细胞。不论通过流式细胞术或其它技术，具有显著较低浓度细胞的样品的分析较困难并且因此不太常见。另外，被设计成测量全血样品的传统血液学分析器倾向于具有对于低端细胞浓度的有限检测灵敏度。在一些情况下，样品的手动检查是细胞分析的唯一可用方法。在医学、微生物学和其它领域需要分析具有低细胞计数的样品的改进方法。

【发明内容】

[0006]在一方面，本公开提供分析含有细胞的体液的方法，所述方法包括:用荧光染料将体液染色，其中荧光染料渗透细胞膜并且结合至核酸以在细胞内形成染料复合物；用来自能量源的能量照射染色体液；并且测量染色体液中的由染料复合物发出的荧光信号。
[0007]在一些这类方面，体液包含少于约20个细胞/微升。
[0008]在一些这类方面，体液包含超过约20个细胞/微升。
[0009]在一些这类方面，核酸选自DNA和RNA。
[0010]在一些这类方面，能量源提供具有可见光谱中的波长的单色光，并且其中单色光的波长和荧光信号的波长是不同的。
[0011]在一些这类方面，与染料复合物相比，未结合荧光染料在用来自能量源的能量照射时发出较少荧光。
[0012]在一些这类方面，在未结合至核酸时，未结合荧光染料在用来自能量源的能量照射时不发荧光，以使得没有染料复合物的细胞不发出荧光信号。
[0013]在一些这类方面，所述方法包括基于存在或不存在荧光染料来区分具有细胞核的细胞与没有细胞核的细胞。
[0014]在一些这类方面,测量涉及点计(enumerating,计算、计数)和区分RBC和WBC。
[0015] 在一些这类方面，所述方法在测量之前不涉及使RBC溶解(Iysing)。[0016]在一些这类方面，体液包含完整WBC和RBC。
[0017]在一些这类方面，测量使用自动血液分析器、流式细胞仪或体液样品的其它诊断分析器来执行。
[0018]在一些这类方面，测量包括使体液流经血细胞计数器中的流槽(flow cell，流动室)。
[0019]在一些这类方面，荧光染料提供在进一步包括水的组合物中。
[0020]在另一方面，本公开提供分析流体的方法，其中所述流体含有少于约40个细胞/微升，所述方法包括:使流体与荧光染料接触，其中荧光染料渗透细胞膜并且结合至核酸以在细胞内形成染料复合物；用来自能量源的能量照射流体；并且测量流体中的由染料复合物发出的荧光信号。
[0021]在一些这类方面，所述流体含有少于约20个细胞/微升。
[0022]在一些这类方面，所述流体含有小于约5个细胞/微升。
[0023]在一些这类方面，所述流体是体液。
[0024]在一些这类方面，所述流体是生物流体。
[0025]在另一方面， 本公开提供区分细胞的方法，所述方法包括:使细胞与包含荧光染料的溶液接触，其中荧光染料是水溶性的，能够渗透细胞膜，并且能够结合至核酸；用来自激发光源的激发光照射细胞；并且测量来自细胞的光发射，并且基于测量来区分含有核酸的细胞与没有核酸的细胞。
[0026]在另一方面，本公开提供分析体液的组合物，所述组合物包括水和荧光染料，其中荧光染料是水溶性的，能够渗透细胞膜，并且能够结合至核酸。
[0027]在另一方面，本公开提供血液学系统，其包括:用于保持将要分析的样品的样品保持器；用于将至少一部分将要分析的样品与染色组合物混合的混合容器；用于存储染色组合物的存储容器，其中染色组合物包含能够渗透细胞膜并且结合至核酸的染料，并且其中染料在结合至核酸时发荧光；流槽；用于将电磁能施加至流槽的至少一个能量源；用于检测来源于流槽内的荧光的一个或多个检测器；和用于检测散射的可见光的一个或多个可见光检测器。
[0028]在一些这类方面，所述系统包括抽吸机构，其用于将至少一部分将要分析的样品从样品保持器抽吸至混合容器。
[0029]在一些这类方面，所述系统包括抽吸机构，其用于将染色组合物从存储容器抽吸至混合容器。
[0030]在一些这类方面，至少一个能量源提供波长λ I下的单色光。
[0031]在一些这类方面，当染料结合至核酸时，染料吸收波长λ I下的光并且发出波长λ 2下的光。
[0032]在一些这类方面，检测器检测波长λ 2下的光。
[0033]在一些这类方面，所述系统包括用于提供非单色可见光的至少一个额外能量源。
[0034]在一些这类方面，将要分析的样品是体液。
[0035]在另一方面，本公开提供用于制备血液学系统的方法，该方法包括:提供用于将至少一部分将要分析的样品与染色组合物混合的混合容器；提供用于存储染色组合物的存储容器，其中染色组合物包含能够渗透细胞膜并且结合至核酸的染料，并且其中染料在结合至核酸时发荧光；提供流槽；定位用于将电磁能提供至流槽的能量源；定位用于检测从流槽内发出的荧光的检测器。
[0036]在另一方面，本公开提供制备用于分析体液的容器的方法，所述方法包括将包含能够渗透细胞膜并且结合至核酸的染料的组合物添加至容器，其中染料在结合至核酸时发荧光，并且其中容器是血液学系统的一体化或模块化部分。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]图1提供本文描述的体液分析方法的方面的示意性图像。在DNA-染料相互作用和随后发出荧光后，WBC与RBC分离。荧光信息，以及其它光学散射信号，用于体液样品的细胞分析。FLl指示用530±20nm带通滤波器来收集的荧光。ALL和IAS是分别在O至I度和3至10度收集的光散射信号。
[0038]图2A是体液样品的细胞分析的散布图(ALL相比于IAS)。WBC = 89/ μ L(参考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (参考=1733/μ L)。
[0039]图2B是体液样品的细胞分析的散布图(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在荧光(FLl)中完全分离。WBC = 89/μ L(参考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L(参考=1733/μ L)。
[0040]图3A是另一个体液样品的细胞分析的散布图(ALL相比于IAS)。WBC = 0.95/μ L (参考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L (参考=122/μ L)。 [0041]图3B是另一个体液样品的细胞分析的散布图(FLl相比于ALL)。WBC和RBC在荧光(FLl)中完全分离。WBC = 0.95/μ L(参考=0.33/ μ L) ；RBC = 142/μ L(参考=122/μ L)。
[0042]图4A是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第一稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制
备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0043]图4Β是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第二稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制
备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0044]图4C是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第三稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制
备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0045]图4D是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第四稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制
备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0046]图4Ε是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第五稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0047]图4F是血沉棕黄层样品的六个水平连续稀释的第六稀释的FLl相比于IAS散布图。原始血沉棕黄层样品含有6.1xlO3/ μ L WBC和15χ103/ μ L RBC0六个水平(A)、(B)、(C)、(D)、(E)和(F)分别基于使用 PBS 的 1:10、1:30、1:100、1:300、1:1000 和 1:3000 稀释来制
备。所有样品使用稀释液在原型分析器上测量。
[0048]图5提供所有六个水平的稀释血沉棕黄层样品(A)和仅三个低端样品(B)之间的WBC(测量相比于计算)的相关图。每个水平下的多个点指示执行多个操作。总体相关性为:对于所有六个水平来说，Y=L 0239Χ-4.9 (R2 = 0.9984)，并且对于具有最低细胞浓度的三个水平来说，Y=L 0787Χ-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0049]图6提供91个体液样品的WBC(当前方法相比于参考)的相关图。相关性在不同范围中作图:(A)完全范围(约 40，000/μ L)，(B)〈2，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。稀释比是1:35(样本相比于标记试剂)。 [0050]图7提供91个体液样品的RBC (当前方法相比于参考)的相关图。相关性在不同范围中作图:(A)完全范围(约 200，000/μ L)，(B)〈3，000/μ L，(C)〈200/μ L 和(D)〈50/μ L。具有许多RBC影的样品未包括于相关分析中。稀释比是1:35(样本相比于标记试剂)。
[0051]图8是具有极低细胞浓度(WBC〈50/ μ L)的72个体液样品的WBC(发明方法相比于参考)的相关图表。稀释比是1:10(样本相比于标记试剂)。
[0052]图9是具有极低细胞浓度(RBC〈50/ μ L)的38个体液样品的RBC (当前方法相比于参考)的相关图表。具有许多RBC影的样品未包括于相关分析中。稀释比是1:10(样本相比于标记试剂)。
【具体实施方式】
[0053]定义
[0054]除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或等效于本文所描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是本文描述了代表性的说明性方法和材料。应理解的是，如果有矛盾，本公开内容取代所并入公开文献的任何公开内容。
[0055]应注意的是，如本文所用并且在随附权利要求中，除非上下文清楚地另外指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the) ”包括复数个指示物。还应注意，所述权利要求可以起草为排除任何任选的要素。因此，对于使用诸如“唯一”、“仅”等与权利要求要素的叙述相关的排他性术语或使用“负面”限制而言，该叙述旨在起到前提基础的作用。
[0056]术语“典型地”用于指示本发明的通常做法。此术语指示这类公开对于本发明的材料和方法来说是示例性的，而不是必需的(除非另外指示)。因此，术语“典型地”应理解为“典型地，但是不一定”。类似地，如在任选存在的材料或组分中，术语“任选地”指示本发明包括材料或组分存在的情况，也包括材料或组分不存在的情况。
[0057]如本文使用，术语“体液”是指存在或从动物获得的流体，包括流体如脑脊液、腹膜液、心包液、胸膜液、滑液、尿液、唾液、眼泪、精液、羊膜水、痰等，以及从包囊、肿瘤等获得的流体。除非另外规定，否则术语“体液”不包括全血，虽然体液可含有红细胞(RBC)和/或白细胞(WBC)。[0058]在一些方面，本公开提供分析具有低细胞计数的流体的方法和材料。低细胞计数是指流体具有少于约100个细胞/微升，或少于约80个细胞/微升，或少于约60个细胞/微升，或少于约40个细胞/微升，或少于约30个细胞/微升，或少于约20个细胞/微升，或少于约10个细胞/微升，或少于约5个细胞/微升。在一些实施方案中，这类低细胞计数是浓度较高原始样品的稀释结果。在其它实施方案中，这类低细胞计数是将要分析的流体的自然特性(即，不需要稀释以获得低细胞计数)。
[0059]在一些实施方案中，将要使用本文描述的方法和材料来分析的流体选自体液。在其它实施方案中，将要分析的流体在性质上是生物的，但是并非体液。在一些实施方案中，将要分析的流体是“合成的”，意指细胞群体添加至流体，其中流体生物学相容但是不是细胞通常发现于其中的流体。这类流体的实例包括缓冲水溶液等。
[0060]材料
[0061]在一些实施方案中 ，所感兴趣的方法涉及使细胞群体与适合于帮助细胞的所需表征的标记组合物接触。在一些实施方案中，标记组合物包括突光染料，并且任选地进一步包括如本文以下描述的那些额外组分。标记组合物的组分和这类组分的相对浓度可根据预定用途的需要和要求来改变。在存在或不存在染料的情况下，标记组合物可替代地在本文中称为“试剂”。
[0062]所感兴趣的方法和材料涉及荧光染料(在本文中也称为“染料”)。荧光染料可为具有执行所感兴趣的方法需要或合适特性的任何合适染料。举例来说，在一些实施方案中，染料是水溶性的。举例来说，在一些实施方案中，荧光染料具有至少I μ g/L或至少5μ g/L或至少10 μ g/L或至少20 μ g/L或至少50 μ g/L的水溶性。在一些实施方案中，染料在水溶液中是稳定的，意指染料在适合于本文描述的分析方法的时间尺度内不显著降解。举例来说，染料在周围温度(例如，近似20-25°C )下、在缓冲水溶液(例如，细胞试剂)中稳定至少30分钟，或至少I小时或至少6小时，或至少12小时，或至少24小时，或至少2天，或至少7天，或至少I个月。还例如，染料在冷藏(例如，低于近似10°C )下、在缓冲水溶液(例如，细胞试剂)中稳定至少I小时，或至少12小时，或至少24小时，或至少2天，或至少7天，或至少I个月，或至少6个月，或至少12个月。
[0063]在一些实施方案中，染料能够渗透细胞膜，如血细胞的壁等。在一些实施方案中，一旦在细胞内部,染料进一步能够渗透细胞核。
[0064]在一些实施方案中，染料结合至核酸。在一些实施方案中，染料结合至DNA。在一些实施方案中，所感兴趣的染料结合至DNA但是不结合至RNA。在一些实施方案中，所感兴趣的染料优先结合至DNA而非RNA。在一些实施方案中，染料结合至DNA分子涉及氢键合或另一种非共价相互作用。在一些实施方案中，染料结合至DNA的单链或双链DNA复合物的单链。在一些实施方案中，染料结合至双链DNA复合物的两个链。
[0065]在本说明书通篇，结合至DNA的染料被称为染料复合物。在一些实施方案中，染料以高亲和力和高结合常数来结合至DNA。在一些实施方案中，并且如本文中提到，染料的亲和力和浓度足够大以致于染料足以“染色”(在渗透和DNA结合后)至少250，000个细胞/微升。
[0066]在一些实施方案中，染料是发荧光的。因此，染料吸收一个波长或围绕峰吸收波长(也称为峰激发波长)的一组波长下的入射光，并且发出另一个波长或围绕峰发射波长的一组波长下的光。在一些实施方案中，峰吸收波长不同于峰发射波长。此外，在一些实施方案中，峰吸收波长和/或峰发射波长取决于染料环境。举例来说，在一些实施方案中，结合至DNA的染料(即，染料复合物)的峰吸收波长和/或峰发射波长不同于未结合染料的峰吸收波长和/或峰发射波长。
[0067]在一些实施方案中，染料复合物的峰吸收波长和峰发射波长不同达至少10nm，或至少15nm,或至少20nm,或至少25nm,或至少30nm,或至少35nm,或至少40nm,或至少45nm,或至少50nm。在一些实施方案中，染料复合物的峰吸收波长在400_700nm范围内。举例来说，在一些实施方案中，峰吸收在425-550nm范围内，或在450_525nm范围内，或在475-500nm范围内，或在480_495nm范围内，或在485_490nm范围内。还例如，在一些实施方案中，峰吸收在500-700nm范围内，或在550_675nm范围内，或在600_650nm范围内，或在620_640nm 范围内。
[0068]在一些实施方案中，染料复合物的峰发射波长在425_800nm范围内，如在425-700nm范围内。举例来说，在一些实施方案中，峰发射在450_650nm范围内，或在475-625nm范围内，或在500_550nm范围内，或在510_540nm范围内，或在520_530nm范围内。
[0069]举例来说，在一些实施方案中，荧光染料选自噻唑橙或1-甲基-4_[(3-甲基-2-(3H)_苯并噻唑亚基)甲基]喹啉鎗对甲苯磺酸盐、噻唑蓝、4-[(3_甲基-2-(3H)_苯并噻唑亚基)甲基]-1-[3-(三甲基铵)丙基]喹啉鎗二碘化物、3，3’-二甲基氧杂碳菁碘化物或3-甲基-2-[3 (3-甲基-2 (3H)-苯并噻唑亚基-1-丙烯基]苯并噁唑碘化物、硫黄素T、染色剂SYTO?和TOTO? (Life Technologies)、溴化乙锭、碘化丙啶、吖啶橙、科里膦O、金胺O、染色剂H0ECHST33258 (2’ - (4-羟苯基)-5- (4甲基-1-哌嗪基)-2，5’ -双-1H-苯并咪唑三盐酸盐水合物)和H0ECHST 33342? (2’-(4-乙氧苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2，5’-双- 1H-苯并咪唑三盐酸盐)、4’6-二氨基-2-苯基吲哚盐酸盐(DAPI)、4’，6-( 二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚盐酸盐(DIPI)、7_氨基放线菌素D、放线菌素D和LDS751 (2- (4- (4- 二甲氨基苯基)-1，3- 丁二烯基)-3-乙基苯并噻唑闻氯酸盐)、或以商标SYBR? (Life Technologies，例如 SYBR Green、SYBR Gold、SYBRll 等)出售的染料等。
[0070]在一些实施方案中，除了如上所述染料以外，所感兴趣的标记组合物进一步包括以下段落中识别的一个或多个组分。应认识到以下列表只是代表性的，并且在需要时可使用化学和/或生物学等效材料来进行取代。
[0071]在一些实施方案中,标记组合物含有表面活性剂或洗涤剂。可使用离子和中性表面活性剂。举例来说，可使用两性离子表面活性剂如类固醇糖苷(例如，Big CHAP,Big DoxyCHAP等)和吡喃葡萄糖苷，以及在本领域中已知的其它表面活性剂。表面活性剂可以任何合适量存在于标记组合物中，如0.0001-0.1% (w/v)。
[0072]在一些实施方案中，标记组合物进一步含有缓冲剂或pH调节剂。缓冲剂或pH调节剂的实例包括但不限于PBS、MOPS和HEPES。缓冲剂或pH调节剂的额外实例包括:酸如盐酸、氢溴酸、醋酸、磷酸等；碱如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、有机胺(例如咪唑、三乙基胺等)及其类似物；和盐如氯化钠、氯化钙等。举例来说，有机缓冲剂材料如咪唑可以约0.001-3% (w/v)范围内的浓度存在于标记组合物中。还例如，无机材料如HCl可以约0.001-5% (w/v)范围内的浓度存在。类似地，盐如NaCl可以约0.001-3% (w/v)范围内的浓度存在。如前所述，这类材料的等效物是已知的并且可在适当情况下取代。
[0073]在一些实施方案中，所感兴趣的方法和材料进一步涉及必要或需要的额外组分。这类额外组分的实例包括着色剂、防腐剂、抗微生物剂、渗透压调节剂和辅溶剂。
[0074]举例来说,可存在抗微生物剂如Proclin (例如,Proclinl50、200、300等)、万古霉素、青霉素等。抗微生物剂可以约0.001-0.5% (w/v)范围内的浓度存在。
[0075]在一些实施方案中，可在制备所感兴趣的标记组合物期间制成各种组分的储备溶液。举例来说，可制成任何组分(例如，染料化合物等)的储备溶液，以例如帮助溶解组分或精确地测量组分体积。储备溶液可使用水作为溶剂，或使用有机溶剂如二甲亚砜、异丙醇、乙醇或甲醇，或使用其组合来制成。
[0076]在一些实施方案中，所感兴趣的方法和材料涉及以上识别组分的水溶液。应认识到存在于标记组合物中的各种组分的浓度可根据预定用途来变化。以上和以下段落提供存在于标记组合物中的材料浓度的一些准则。如在本文中指示，在一些实施方案中，标记组合物与将要分析的流体(例如，体液)组合。因此，虽然本文提供的准则涉及如存在于标记组合物中的各种组分的量，应认识到这类准则也可适用于标记组合物与将要分析的流体的组合(即，在一些实施方案中，如在本文描述的血液分析器中实际上分析的材料含有类似百分比和相对量的各种组分)。
[0077]在一些实施方案中，染料以预定浓度存在于标记组合物中。应认识到预定浓度可取决于染料特性(即，化学结构、对于核酸目标的结合亲和力等)以及所使用的分析器的操作参数而变化。在一些实 施方案中，染料组分以至少染色存在于体液中的细胞量的所需量存在，如10个细胞/微升或更多，或50个细胞/微升或更多。举例来说，染料以染色100，000个细胞/微升或更多，或200，000个细胞/微升或更多，或250，000个细胞/微升或更多的所需量存在。在一些实施方案中，存在的染料化合物的量在0.000001-0.5%，或0.00001-0.5%，或 0.0001-0.5%，或 0.001-0.1% (w/v)范围内。
[0078]在一些实施方案中，有机缓冲剂存在于标记组合物中。这类材料的实例包括有机胺，如三乙胺、三甲胺，和环胺如咪唑等。有机缓冲剂(与任何其它缓冲剂)可以产生和保持分析物组合物中的所需PH的所需量存在。
[0079]在一些实施方案中，含有所感兴趣的染料的标记组合物等渗或大致上等渗(即，等渗的约20%内，或等渗的约10%内，或等渗的约5%内)。在一些实施方案中，含有所感兴趣的染料的标记组合物具有中性PH或大致上中性pH(即，在约6-8，或约6.5-7.5的pH范围内)。标记组合物的这些特性有助于减少样品制备和分析期间对于任何类型的细胞的破坏，因此导致体液样品的更精确细胞分析。
[0080]方法
[0081]在一些实施方案中，所感兴趣的方法涉及使细胞群体与标记组合物接触。在一些此类实施方案中，接触涉及使标记组合物与含有将要分析的细胞的流体(例如，体液)混合。因此，在一些实施方案中，所感兴趣的方法涉及将含有细胞的流体样品用标记组合物稀释，其中标记组合物包括水和染料，并且任选地包括如本文提供的那些其它组分。在一些此类实施方案中，所述方法涉及预定稀释比下的单一稀释步骤(即将标记组合物添加至流体样品仅一次)，所述稀释比提供用于荧光检测和测量的分析物的最佳浓度。
[0082]在一些实施方案中，因为所感兴趣的染料结合至DNA，所以没有DNA的细胞在暴露于染料时不能够形成染料复合物。因此，暴露于染料的没有DNA的细胞在使用本文描述的方法分析时(例如，在暴露于荧光激发能量源时)不展现染料复合物的发射特性或由于自体荧光只发射最少或微弱荧光。相比之下，含有DNA的细胞能够形成染料复合物。在用所感兴趣的染料染色时，这类细胞在使用本文描述的方法分析时展现染料复合物的发射特性。考虑到此区别，在一些实施方案中，所感兴趣的方法提供区分含有DNA的细胞与没有DNA的细胞的手段。在一些实施方案中，所感兴趣的方法还提供区分含有细胞核的细胞与没有细胞核的细胞的手段，尤其在细胞核含有DNA时。在一些实施方案中，基于荧光测量来提供区分，所述荧光测量观察到来自细胞的荧光(指示存在DNA并且可能指示存在细胞核)或未观察到荧光细胞(指示没有DNA并且可能指示细胞中没有细胞核)。另外，存在于所分析的流体中的非细胞事件(例如，没有DNA的非细胞对象)通过不存在特有荧光发射来区分。
[0083]举例来说，在RBC暴露于染料，成熟RBC (没有细胞核并且没有DNA)不形成染料复合物。因此，在使用本文描述的方法分析时，暴露于染料的RBC不展现染料复合物的发射特性。相比之下，WBC含有细胞核和DNA，并且因此在暴露于染料时形成染料复合物。因此，在一些实施方案中，所感兴趣的方法允许在含有这类细胞的样品中区分WBC与RBC。区分基于存在或不存在指示形成染料复合物的荧光信号。
[0084]除了如上所述的区分以外，所感兴趣的染料与DNA之间的染料复合物的形成还允许在含有细胞的流体样品中点计含有DNA的细胞。举例来说，所感兴趣的方法包括在含有这类细胞的流体样品中点计WBC。点计基于在适合于计数细胞的方法中观察到指示形成染料复合物的荧光。合适方法包括自动血液学分析器如流式细胞仪和其它基于荧光的细胞计数方法。
[0085]如在本文中提到，所感兴趣的方法允许在含有WBC和其它对象(例如，RBC和非细胞事件)的样品中点计和区分WBC。在一些实施方案中，样品是流体如体液，并且含有极低浓度细胞，如在本文中更详 细地描述。在一些实施方案中，本公开的方法进一步允许使用多角度散射技术将WBC分类成2部分、3部分或5部分区分。在某些实施方案中，RBC可使用多角度散射技术来进一步与其它非RBC颗粒分离。
[0086]在一些实施方案中，所感兴趣的方法不涉及溶解剂并且在记录数据之前不涉及使细胞溶解。举例来说，所感兴趣的方法在分析流体样品之前不涉及将溶解剂添加至含有细胞的流体样品。因此，在一些实施方案中，标记组合物不含有溶解剂。所分析的流体样品不是溶解产物并且不含有经由溶解从细胞释放的细胞内含物。在一些实施方案中，将要分析的流体样品含有完整RBC并且这类RBC在荧光测量之前未溶解。“溶解剂”意欲包括导致显著细胞溶解，尤其(但是不限于)RBC溶解的任何材料。溶解剂包括但不限于本领域中已知或后来发现的各种类型的表面活性剂、酶、抗体、PH调整剂、渗透剂(渗透压调整剂)等。
[0087]因为溶解剂不涉及将要分析的流体样品的制备，所以存在于流体中的WBC不受损，如果使用溶解剂，则其会或可能受损。这在含有WBC的体液中是尤其有利的，因为与全血中的WBC相比，其中包含的WBC通常更脆弱。
[0088]如上所述，在一些实施方案中，所感兴趣的方法涉及用预定量标记组合物稀释以提供所需稀释比和所需分析物浓度。预定量可基于用于分析流体样品的设备中的检测极限来确定。在一些实施方案中，检测极限通过相对于样品注入速率(相对于流槽速率)、测量持续时间等来调整而进行优化。举例来说，具有1:10 (血液:试剂)稀释比、4.0微升/秒注入速率和60秒样品测量(数据收集)的原型分析器导致收集10个细胞/微升的样品的近似240个事件，其足以支持精确细胞分析。
[0089]在一些实施方案中，所感兴趣的方法适合于分析具有WBC的任何流体样品。如前所述，这类流体样品包括体液，并且也包括其它流体样品，如细胞的制备水溶液，基于植物和从植物获得的溶液等，尤其当这类样品流体含有低细胞计数(例如，少于40个细胞/微升，或少于30个细胞/微升等)。
[0090]在一些实施方案中，所感兴趣的方法提供在含有WBC并且任选地含有RBC的样品流体中点计和区分WBC的简单、可靠和精确手段。使用自动血液学分析器的荧光检测确保精确度和可靠性，并且使用单一步骤稀释提供样品制备的简单性。含有细胞的样品流体用标记组合物中包含的荧光标记来染色，其中荧光标记渗透细胞壁并且结合至DNA以产生染料复合物。染色WBC发出指示染料复合物的荧光发射信号，而RBC不发出这类信号或发出显著较低强度的这类信号。标记组 合物不含溶解剂并且没有溶解剂添加至样品流体，从而保护所存在的WBC。最佳检测极限通过调整变量包括样品流速、检测频率等来确定。
[0091]分析WBC的方法和执行这类方法的系统的额外方面可发现于2011年5月4日提交的共同待决美国临时专利申请序列号61/482，541，以及2011年5月4日提交的共同待决美国临时专利申请序列号61/482，549中，其公开内容以引用方式整体并入本文。
[0092]输出和优势
[0093]在一些实施方案中，分析染色流体产生适合于多维度数据分析、图表等的各种信息。举例来说，在一些实施方案中，本文描述的方法提供精确总WBC计数。在一些实施方案中，所述方法提供关于样品中的不同类型WBC的相对比例(例如，嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和/或单核细胞或其各种组合的细胞计数)的数据。这类数据可用作例如治疗患者的诊断信息。
[0094]如在本文中提到，在一些实施方案中，所感兴趣的方法涉及通过引入染料来将流体样品中的WBC选择性染色，所述染料选择性结合至DNA并且在以这种方式结合时发出荧光。因此，染色样品流体的分析包括与来源于没有染料复合物的细胞(例如，RBC)的微弱或不存在的荧光发射比较，记录到来源于含有染料复合物的细胞(例如，WBC)的更强的荧光发射。荧光测量可使用，例如，多通道光学散射分析器来获得。
[0095]在一些实施方案中，所感兴趣的材料和方法允许体液和适用于例如医用诊断的其它流体的细胞分析。通过本文中的方法能够进行具有极低细胞计数(例如，少于40/μ L，或少于lO/yL等)的流体样品的细胞分析，包括具有特别脆弱细胞的体液。所述方法的简单性允许从患者抽取样品之后1-2小时内分析这类样品，从而也有助于分析脆弱细胞。本文描述的组合物和方法中不存在细胞溶解剂进一步增加分析含有脆弱细胞的样品的能力。所感兴趣的流体中的脆弱细胞的破坏潜在地导致不精确的分析如不精确的细胞计数和细胞区分。
[0096]本文描述的方法提供的最佳稀释比率是优于传统血液学分析的进一步改进。举例来说，传统血液学分析器所使用的稀释比率(即对于RBC稀释来说血液:稀释剂=1:300)不足够敏感以支持测量具有极低细胞浓度的样品。相比之下，在一些实施方案中，本文中的方法允许单一稀释提供最佳荧光检测的最佳稀释比。
[0097]本公开的方法是简单的，例如，在一些实施方案中，只需要单一试剂和单一稀释。在一些实施方案中，稀释比率可容易地调整和/或优化。此外，本公开的方法简单实施，并且可在不需要广泛调整和/或修改的情况下例如在传统血液分析器上执行。
[0098]基于本文提供的公开内容，包括以下实施例，这些和其它优势是本领域技术人员显而易知的。
[0099]实施例
[0100]一般试验程序:(A)改变CELL-DYN Sapphire血液分析器的流动脚本和算法以允许它用于体液测定。(B)所有体液(BF)测定使用(稍微改变)WBC扩展计数模式来进行:BF样品抽吸(约120 μ L)，随后样品(BF)与试剂(Sapphire网织红细胞试剂)混合，比率为I比35，随后将混合样品孵育(40°C x25秒)，随后将孵育样品传输至流槽以测量(32秒测量)，随后数据收集，原始数据记录为.fcs文件，随后使用软件如FCS Express来分析原始数据。
[0101]所有参考结果使用标准手册腔室计数程序来测量。
[0102]试剂使用以下组分和浓度来配制:
[0103]
13?浓度1

咪唑0.3400%

IN HCl2.5325%

NaCl0.6800%
Proclin300 0.0315%
BIGCHAP 0.0050%
SYBRll 0.0002%
DMSO20.0220%


至 100%
[0104]1IV0= lg/1 OOmL
[0105]2DMSO (二甲亚砜)用于制得染料组分的储备溶液。
[0106]实施例1
[0107]分析低细胞计数样品
[0108]具有1:35 (血液:试剂)稀释比、2.3微升/秒注入速率和32秒样品测量(数据收集)的原型分析器导致收集10细胞/微升的样品的超过20个事件。
[0109]图2A和2B展示体液样品的细胞分析的散点图。细胞在分析之后加以点计:WBC=89/μ L (参考=81/μ L) ；RBC = 2012/μ L (参考=1733/μ L)。图 3Α 和 3B 展示另一个体液样品的细胞分析的散点图。细胞在分析之后加以点计=WBC = 0.95/μ L(参考=0.33/μ L) ；RBC = 142/μ L (参考=122/μ L)。[0110]实施例2
[0111]分析极低细胞计数样品
[0112]在使用稀释血沉棕黄层样品的研究中进一步验证检测极限。使用连续稀释来制备六个水平的稀释血沉棕黄层样品。六个水平稀释血沉棕黄层样品的FLl相比于IAS散点图展示于图4A-4F。图5展示WBC的相关性(测量相比于计算)。获得很好相关性:(A)对于所有六个水平来说，Y = 1.0239X-4.9 (R2 = 0.9984)，并且(B)对于具有最低细胞浓度的三个水平来说，Y=L 0787X-1.5 (R2 = 0.9598)。
[0113]实施例3
[0114]1: 35稀释比的体液样品的细胞分析
[0115]进行综合体液研究以评估本文提供的方法。总共91个体液样本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:35(血液:试剂)稀释比、2.3微升/秒注入速率和32秒样品测量(数据收集)来进行测量和分析。WBC和RBC的参考值通过手动腔室计数来获得。
[0116]在如上所述方法与参考方法之间获得WBC的极好相关性(图6) =(A)Y = 1.1305X-9.8411，R2 = 0.997(完全范围，多达近似 40，000/μ L) ； (B) Y = 1.017Χ+7.1395，R2=0.9765 ?2, 000/μ L) ； (C)Y = 1.0899X+1.1253, R2 = 0.9663 ?200/μ L)；和(D)Y =
1.149X+1.1461，R2 = 0.8459 (〈50/μ L)。在如上所述方法与参考方法之间获得RBC的很好相关性(图 7) =(A)Y = 0.8996X+403.62, R2 = 0.9595 (完全范围，多达近似 200，000/μ L) ； (B) Y = 1.0833Χ-11.427, R2 = 0.9513 ?3, 000/μ L) ； (C) Y = 0.979X-1.0747，R2 =
0.8284 ?200/μ L);和(D) Y = 0.9994X+0.5951，R2 = 0.6917 (〈50/μ L)。对于 RBC 分析，具有许多RBC影的样品未包括于相关分析中。
[0117]实施例4
[0118]1:10稀释比的体液样品的细胞分析
[0119]进行另一个综合体液研究以评估本文提供的方法。总共155个体液样本，包括CSF液、胸膜液、腹膜液和腹水，在原型分析器上以1:10(血液:试剂)稀释比、2.3微升/秒注入速率和32秒样品测量(数据收集)来进行测量和分析。WBC和RBC的参考值通过手动腔室计数来获得。
[0120]甚至对于具有低端WBC浓度的样品，在如上所述方法与参考方法之间获得WBC的极好相关性(图 8):Y = 1.1327Χ+1.1937，R2 = 0.8195 (WBC<50/μ L, 72 个样品)。甚至对于具有低端RBC浓度的样品，在如上所述方法与参考方法(图9)之间获得WBC的很好相关性:Y = 0.8244Χ+0.6128，R2 = 0.7465 (RBC〈50/ μ L, 38 个样品)。对于 RBC 分析，具有许多RBC影的体液样品未包括于相关分析中。
【权利要求】
1.一种用于分析含有细胞的体液的方法，所述方法包括: 用荧光染料将所述体液染色，其中所述荧光染料渗透细胞膜并且结合至核酸以在所述细胞内形成染料复合物； 用来自能量源的能量照射所述染色体液；并且 测量所述染色体液中的由所述染料复合物发出的荧光信号。
2.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液包含少于约20个细胞/微升。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液包含大于约20个细胞/微升。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是DNA或RNA。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述能量源产生具有所述可见光谱中的波长的单色光，并且其中所述单色光的所述波长与所述荧光信号的所述波长是不同的。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中与所述染料复合物相比，未结合荧光染料在用来自能量源的能量照射时发出较少荧光。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，在未结合至所述核酸时，未结合荧光染料在用来自所述能量源的能量照射时不发荧光，以使得没有所述染料复合物的细胞不发出荧光信号。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括基于所述荧光染料的存在或不存在，来区分具有细胞核的细胞与没有细胞核的细胞。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测量涉及点计并且区分红细胞(RBC)与白细胞(WBC)。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法在所述测量之前不涉及使RBC溶解。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液包含完整WBC和RBC。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测量使用自动血液分析器、流式细胞仪，或用于体液样品的另一种诊断分析器来执行。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述测量包括使所述体液流经血细胞计数器中的流槽。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光染料提供于组合物中，所述组合物进一步包括水。
15.一种用于分析流体的方法，其中所述流体含有少于约40个细胞/微升，所述方法包括: 使所述流体与荧光染料接触，其中所述荧光染料渗透细胞膜并且结合至核酸以在所述细胞内形成染料复合物； 用来自能量源的能量照射所述流体；并且 测量所述流体中的由所述染料复合物发出的荧光信号。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述流体含有少于约20个细胞/微升。
17.如权利要求15至16中任一项所述的方法，其中所述流体含有少于约5个细胞/微升。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述流体是体液。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述流体是生物流体。
20.一种用于区分细胞的方法，所述方法包括: 使所述细胞与包含荧光染料的溶液接触，其中所述荧光染料是水溶性的、渗透细胞膜，并且结合至核酸； 用来自激发光源的激发光照射所述细胞； 测量来自所述细胞的光发射； 基于所述测量的光发射来区分含有核酸的所述细胞与没有核酸的所述细胞；并且基于使用一个或多个光散射检测器从所述样品获得的多个光学数据，将所述细胞分类为白细胞(WBC)或红细胞(RBC)。
21.一种用于分析体液的组合物，所述组合物包含水和荧光染料，其中所述荧光染料是水溶性的、渗透细胞膜，并且结合至核酸。
22.—种血液学系统,其包括: 用于保持样品的样品保持器； 用于将染色组合物与至少一部分所述样品混合的混合容器； 用于存储所述染色组合物的存储容器，其中所述染色组合物包含渗透细胞膜并且结合至核酸的染料，并且 其中所述染料在结合至核酸时发荧光； 流槽； 用于将电磁能施加至所述流槽的至少一个能量源； 用于检测来源于所述流槽内的荧光的检测器；和 用于检测散射的可见光的一个或多个可见光检测器。
23.如权利要求22所述的血液学系统，其进一步包括抽吸机构，所述抽吸机构用于抽吸至少一部分来自所述样品保持器的所述样品并且将其移动至所述混合容器。
24.如权利要求22至23中任一项所述的血液学系统，其进一步包括抽吸机构，所述抽吸机构用于抽吸所述染色组合物并且将其从所述存储容器移动至所述混合容器。
25.如权利要求22至24中任一项所述的血液学系统，其中所述至少一个能量源产生波长λ I下的单色光。
26.如权利要求22至25中任一项所述的血液学系统，其中当所述染料结合至核酸时，所述染料吸收波长λ I下的光并且发出波长λ 2下的光。
27.如权利要求22至26中任一项所述的血液学系统，其中所述检测器检测波长λ2下的光。
28.如权利要求22至27中任一项所述的血液学系统，其进一步包括用于提供非单色可见光的至少一个额外能量源。
29.如权利要求22至28中任一项所述的血液学系统，其中所述样品是体液。
30.一种用于制备血液学系统的方法,所述方法包括: 提供用于将至少一部分将要分析的样品与染色组合物混合的混合容器； 提供用于存储所述染色组合物的存储容器，其中所述染色组合物包含渗透细胞膜并且结合至核酸的染料，并且其中所述染料在结合至核酸时发荧光； 提供流槽； 建立稳定核心流以允许所述样品穿过所述流槽；定位用于将电磁能提供至所述流槽的能量源；并且 定位用于检测从所述流槽内发出的荧光的检测器。
31.一种制备用于分析体液的容器的方法，所述方法包括将包含能够渗透细胞膜并且结合至核酸的染料的组合物添加至所述容器，其中所述染料在结合至核酸时发荧光，并且其中所述容器是血液 学系统的一体化或模块化部分。
【文档编号】C12M3/00GK104024437SQ201280064502
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2012年12月19日 优先权日:2011年12月27日
【发明者】吴炯, 艾米丽·H.·林, 杨金平 申请人:雅培制药有限公司