在单个样品上的免疫荧光和基于荧光的核酸分析的制作方法
【专利摘要】提供单个生物样品的合成图像的方法，包括以下步骤：产生所述生物样品的第一图像，产生所述生物样品的第二图像，和产生提供靶蛋白和靶核酸两者的相对位置的合成图像。还提供的是分析生物样品的方法，包括按照提供合成图像的方法提供所述生物样品的合成图像，和根据所述合成图像分析蛋白表达和目标核酸序列。进一步提供的是包括用于进行所述新方法的工具的系统和试剂盒。
【专利说明】在单个样品上的免疫荧光和基于荧光的核酸分析 发明领域
[0001] 本发明涉及在生物样品上对蛋白表达和靶核酸序列的检测。更具体地讲，本发明 涉及能够在生物样品的同一切片上进行蛋白表达和靶核酸序列的荧光检测的方法。还提供 的是用于进行所述新方法的试剂盒和系统。
[0002] 发明背景 大部分疾病具有不同类型的表型，并且需要复杂的表征，用于患者评价。例如，乳腺 癌由5种不同亚型组成，每种亚型都涉及不同表型、生存时间和治疗反应性。例如，管腔型 (luminal type)具有最好的预后并对激素治疗有良好反应，而HER2-阳性和基底肿瘤的患 者却发展不良。尽管目前靶向疗法的发展已经显著地影响了 HER2-阳性肿瘤的治疗，但是 这些患者中的许多都不反应，或发展出抗性。在这些案例中的许多案例中，已经鉴定了 HER2 基因中的突变或其它途径（例如PI3K/AKT)的活化，并且已经提出了同时靶向正常的和突 变的HER2的新的疗法或者还影响其它途径的组合疗法。另外，若干研宄甚至已经指出，在 不同乳癌亚型中的相同基因的变化可能差异地影响疾病进程和治疗反应两者。因此，对患 者肿瘤的综合分析（comprehensive profiling)对于医生能够为该患者做出最佳治疗决策 而言是至关重要的。
[0003] 在一部分乳腺癌患者中，扩增HER2基因作为恶性转化和肿瘤发展过程的部分。 HER2基因扩增通常导致乳腺癌细胞表面上的HER2蛋白过量表达。在25-30%的乳腺癌中已 经证明了 HER2基因的扩增和/或其蛋白的过量表达。若干研宄已经证明HER2状态与对某 些化学治疗方案的敏感性或抗性有关。高HER2蛋白过量表达或HER2基因扩增的表现对于 启动用Herceptin (针对HER2蛋白的一种单克隆抗体）的疗法是必不可少的。临床研宄 已经证明，具有高HER2蛋白过量表达和/或HER2基因扩增的肿瘤的患者从Here印tinHER2 蛋白水平和HER2基因扩增。然而，两种患者样品常规用于进行IHC和FISH分析，可能导致 两种结果之间缺少一致性。理想的是，在同一样品上和在细胞-细胞水平上同时进行这两 种分析。
[0004] 在胃或胃-食管结合处的晚期或转移癌的患者中，大约20%具有HER2-阳性疾病。 与未分化的癌症和混合肿瘤相比，腺癌更常见为HER2-阳性；与胃肿瘤相比，胃-食管结合 处癌症更有可能为HER2-阳性。已经证明曲妥单抗?改善了 HER2-阳性的胃或胃-食管结 合处的晚期或转移性癌症患者的生存率。研宄表明基因扩增（FISH)和蛋白过量表达（使 用免疫荧光检测）与乳腺癌的关联不一样，因此不应该用单一方法来确定HER-2状态。
[0005] 尽管多种方法可用于生物学和医学，以观察生物样品中的不同靶标，但是许多现 有技术在单个样品中在同一时间内仅可检测少量靶标（例如免疫荧光（IF)，其中可检测的 靶标数量受限于基于荧光的检测系统）。对靶标的进一步分析可能需要使用来自来源的额 外的生物样品，限制了测定靶标的相对特性（例如生物样品中的多个生物靶标的存在、不 存在、浓度和/或空间分布）的能力。此外，在某些情况下，可以得到有限量的样品用于分 析或者可能需要单个样品用于进一步分析其它目标蛋白，例如细胞周期或其它癌症生物标 记。因此，需要能够反复分析单个样品的方法、试剂和装置。
[0006] 若干实验室已经试图在单个样品上组合蛋白表达和基于DNA的分析。Lottner等 人描述了一个方案，其在单个组织样品上先进行FISH，再进行HER2的IF，接着进行图像分 析。JPathol. 2005 ;205 (5) :577-84 ;doi: 10. 1002/path. 1742。作者注意到，在 FISH 之 前进行IF导致较高的荧光背景和较弱的免疫荧光。Reisenbichler等人在单个样品上对于 HER2进行了免疫组织化学（IHC)和显色原位杂交（CISH)组合的实验。Am J Clin Pathol 2012 ;137:102-110 ;doi: 1(λ 1309/AJCPLNHINN906YSF。尽管作者通过先使CISH样品成像、 再使IHC样品成像而能够得到信号，但他们发现当不仅是在CISH之后进行IHC，而且直到所 有湿实验室（wet lab)实验完成才使样品成像（即没有中间成像步骤）时，获得更好的图 像。重要的是，当Reisenbichler等人在样品上先进行IHC，再进行CISH时，他们不能获得 CISH信号。
[0007] Gaiser等人描述了在同一组织样品内对于基因扩增通过蛋白表达而定位的组 织结构的分析方法。作者首先在结肠癌组织样品中测定CD133表达，使用单克隆抗体和 FITC-标记的第二抗体。使用40x放大倍数，手工选择目标区并记录。成像之后，对于 扩增的cMyc癌基因和ZNF217同时进行FISH分析。在相同区域，以40x放大倍数，对样 品再次进行成像。对基于tile的FISH分析，将自动化显微镜和用户定制设计的分类器 用于分析图像。Anal Cell Pathol (Amst)。2010 ;33 (2) : 105 - 112 ;doi: 10.3233/ ACP-CL0-2010-0532) 〇
[0008] 仍然需要改进的方法，用于在同一生物样品中检测多个靶标并创建合成图像，以 在细胞-细胞基础上比较表达，允许根据蛋白表达、细胞凋亡等而包括或排除细胞。
[0009] 发明概沐 本发明的一方面，提供了在同一生物样品上进行蛋白以及靶核酸序列的荧光检测的方 法。因此，本发明的一个实施方案提供用于提供单个生物样品的合成图像的方法，包括以下 有序步骤：（1)产生所述生物样品的第一图像；(2)产生所述生物样品的第二图像；和（3) 产生提供所述靶蛋白和所述靶核酸两者的相对位置的合成图像。产生所述生物样品的第 一图像的步骤包括以下步骤：(a)使固体载体上的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触； (b)所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染色；（c)通过荧光检测来自第一结合剂和 所述荧光标记的信号；(d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像。 产生所述生物样品的第二图像的步骤包括以下步骤：(a)使来自步骤（1)的同一样品与至 少一种靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所述探针与所述靶核酸序列杂交；(b)任选 地，所述样品用所述荧光标记来染色；(c)通过荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的 探针和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的 第二图像。在某些实施方案中，所述合成图像是通过将来自第一图像的一种或多种信号与 来自第二图像的一种或多种信号合并而产生。
[0010] 本发明的另一实施方案提供产生单个生物样品的第一和第二图像的方法，包括以 下步骤：（1)产生所述生物样品的第一图像，包括以下步骤：(a)使固体载体上的所述样 品与靶蛋白的第一结合剂接触；(b)所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染色；（C) 通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的信号；（d)根据所检测的荧光信号产生 所述样品的至少部分的第一图像；和然后（2)产生所述生物样品的第二图像，包括以下步 骤：(a)使来自步骤（1)的同一样品与至少一种靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所 述探针与所述靶核酸序列杂交；(b)任选地，所述样品用所述荧光标记来染色；(C)通过 荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的探针和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检 测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第二图像。
[0011] 在本发明的另一方面，提供的是分析生物样品的方法，包括提供所述生物样品的 合成图像，和根据所述合成图像分析蛋白表达和目标核酸序列。
[0012] 在本发明的又一方面，提供的是在同一生物样品上荧光检测蛋白以及靶核酸序列 的试剂盒。因此，本发明的实施方案提供试剂盒，其包括用于进行本发明的新方法的组分。
[0013] 在本发明的再一方面，提供的是在同一生物样品上荧光检测蛋白以及靶核酸序列 的系统。因此，本发明的一个实施方案提供系统，其包括用于进行本发明的新方法的工具。
[0014] 附图简沐 图1是流程图，显示本发明实施方案的关键步骤。
[0015] 图2A :表明以IOx成像的乳腺癌组织的伪彩色图像。使用Cy3标记的细胞角蛋白 抗体、Cy5标记的Her2抗体和DAPI对组织切片进行染色。用单色相机采集免疫荧光图像， 如下进行数字化重叠和上色：DAPI，蓝色；细胞角蛋白，绿色；Her2,红色。ROI的选择，如图 2所示，显示为浅蓝色长方形。
[0016] 图2B :将来自图IA的DAPI和细胞角蛋白图像以及在绿色通道中代表背景荧光的 图像转化形成如所述的虚拟H&E图像。
[0017] 图2C :由IA中的DAPI和Her2图像产生的虚拟DAB图像。
[0018] 图3 :从图2中所示的组织选择的40x ROI的合并的Her2免疫荧光（黄色）、DAPI (蓝色）、Her2 FISH (红色）和着丝粒17 FISH (绿色）。
[0019] 发明详沐 定义： 为了更清楚而简明地描述并指出所要求保护的发明的主题，对于在以下说明书及其所 附权利要求书中使用的特定术语，提供以下定义。
[0020] 单数形式"a"、"an"和"the"包括复数对象，除非上下文明确另外指出。在整个说 明书和权利要求书中使用的近似语言可应用于修饰任何定量表示，其在不导致与其相关的 基本功能变化的情况下可允许变化。因此，由术语例如"约"修饰的值不限于所指定的精确 值。除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、性质例如分子量、反应 条件等的所有数值，都理解为在所有情况下都用术语"约"来修饰。因此，除非有相反的说 明，以下说明书和所附权利要求书中给出的数值参数是近似值，其可根据本发明实施方案 力图获取的所需性质而改变。最起码，每个数值参数应当至少根据所报告的有效数字的值 和通过应用常规四舍五入技术来解释。
[0021] 本文使用的术语"固体载体"是指生物样品可固定于其上且随后可通过本文公开 的方法检测其上的蛋白和靶核酸序列的制品。生物样品可通过物理吸附、共价键形成或其 组合固定在固体载体上。固体载体可包括聚合物、玻璃或金属材料。固体载体的实例包括 膜、微量滴定板、珠、滤纸、测试条、载玻片、盖玻片和试管。
[0022] 本文使用的术语"荧光标记"是指对特定亚细胞区室选择性染色的荧光团。合适的 荧光标记（以及它们的靶细胞、亚细胞区室或细胞组分，如果合适的话）的实例可包括但不 限于：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)(核酸）、伊红（碱性细胞组分、细胞质）、H 〇echst 33258和Hoechst 33342 (两种双苯酰亚胺）（核酸）、碘化丙啶（核酸）、奎纳克林（核 酸）、荧光素-鬼笔环肽（肌动蛋白纤维）、色霉素 A3 (核酸）、吖啶黄-福尔根反应（核 酸）、金胺O-福尔根反应（核酸）、溴化乙锭（核酸）。尼氏染色（神经元）、高亲和力DNA 荧光团例如POPO、BOBO、YOYO和TOTO和其它，和融合到DNA结合蛋白（例如组蛋白）的绿 色荧光蛋白、ACM和吖啶橙。优选地，所述荧光标记使细胞核染色。
[0023] 本文使用的术语"荧光团"是指如下化合物：当通过暴露于特定波长的光来激发 时，所述化合物发射光（以不同波长）。术语"荧光"、"荧光的"或"荧光信号"都指通过激发 的荧光团发射光。荧光团可根据其发射特性或"颜色"描述。绿色荧光团（例如Cy3、FITC 和Oregon Green)的特征可为其通常在515-540纳米范围的波长下发射。红色焚光团（例 如Texas Red、Cy5和四甲基若丹明）的特征可为通常在590-690纳米范围的波长下发射。 荧光团的实例包括但不限于4-乙酰氨基-4' -异硫氰酸根合芪-2, 2' -二磺酸、吖啶、吖啶 衍生物和异硫氰酸吖啶、5-(2' -氨乙基）氨基萘-1-磺酸（EDANS)、4_氨基-N-[3-乙烯基 磺酰基）苯基]萘二甲酰亚胺-3, 5-二磺酸酯（Lucifer Yellow VS)、N-(4-苯胺基-1-萘 基）马来酰亚胺、邻氨基苯甲酰胺、亮黄、香豆素、香豆素衍生物、7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC，香豆素120)、7_氨基-三氟甲基香豆素（香豆冉151)、四氯四溴焚光素（cyanosine)、 V，6_二脒基-2-苯基吲哚（DAPI)、5'，5"_二溴邻苯三酚-磺酞（溴邻苯三酚红）、 7-二乙基氨基-3-(4' -异硫氰酸根合苯基）4_甲基香豆素、4, 4'-二异硫氰酸根合二 氢-芪_2,2'-二磺酸、4, 4'-二异硫氰酸根合芪_2,2'-二磺酸、5-[二甲氨基]萘-1-磺 酰氯（DNS，丹磺酰氯）、伊红、伊红衍生物诸如异硫氰酸伊红、赤藓红、赤藓红衍生物诸如赤 藓红B和异硫氰酸赤藓红；乙啡啶；荧光素和衍生物，诸如5-羧基荧光素（FAM)、5-(4, 6-二 氯三嗪-2-基）氨基荧光素（DTAF)、2'，7' -二甲氧基-4'，5' -二氯-6-羧基荧光素（JOE)、 荧光素、异硫氰酸荧光素（FITC)、QFITC (XRITC);荧光胺衍生物（与胺反应时发荧光）； IR144 ;IR1446 ;异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；碱性副品红；酚 红、B-藻红蛋白；邻苯二甲醛衍生物（与胺反应时发荧光）；芘和衍生物，诸如芘、芘丁酸酯 (pyrene butyrate)和 1-花丁酸瑭泊酰亚胺醋（sucinimidyl 1-pyrene butyrate);活性 红4 (Cibacron. RTM.亮红3B-A)、若丹明和衍生物，诸如6-羧基-X-若丹明（ROX)、6_羧 基若丹明（R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰氯、若丹明（Rhod)、若丹明B、若丹明123、异硫氰酸 若丹明X、磺基若丹明B、磺基若丹明101和磺基若丹明101的磺酰氯衍生物（Texas Red); N，N，N'，N'-四甲基-6-羧基若丹明（TAMRA);四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯 (TRITC);核黄素；玫红酸和镧系螯合衍生物、量子点（quantum dot)、花菁和方酸菁。
[0024] 在某些实施方案中，焚光团可以基本上包括可以与抗体结合的焚光团，例如，在免 疫荧光分析中。可以缀合到抗体上的合适的荧光团包括但不限于：荧光素、若丹明、Texas Red、Cy2、Cy3、Cy5、VECTOR Red、ELF. TM.(酶-标记的荧光）、Cy2、Cy3、Cy3. 5、Cy5、Cy7、 FluorX、钙黄绿素、钙黄绿素-AM、CRYPT0FLU0R. TM. ' S、Orange (42 kDa)、Tangerine (35 kDa)、Gold (31 kDa)、Red (42 kDa)、Crimson (40 kDa)、BHMP、BHDMAP、Br-〇regon、Lucifer Yellow、Alexa染料家族、N-[6-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基）氨基]己酰基] (NBD)、B0DIPY.、二吡咯甲烷二氟化硼、Oregon Green、MITOTRACKER、Red、DiOC. sub. 7 (3)、 DiIC. sub. 18、藻红蛋白、藻胆蛋白 ΒΡΕ (240 kDa) RPE (240 kDa) CPC (264 kDa) APC (104 kDa)、Spectrum Blue、Spectrum Aqua、Spectrum GreeruSpectrum GolcUSpectrum Orange、 Spectrum Red、NADH、NADPH、FAD、红外（IR)染料、环状⑶P-核糖（c⑶PR)、Calcofluor White、丽丝胺、伞形酮、酪氨酸或色氨酸。在某些实施方案中，荧光团可以基本上包括花菁 染料。在某些实施方案中，荧光团可以基本上包括一种或多种花菁染料（例如Cy3染料、Cy5 染料或Cy7染料）。
[0025] 本文使用的术语"抗体"是指与另一分子特异性结合且由此定义为与该分子的特 定空间和极性结构互补的免疫球蛋白。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体，且可通过本领 域熟知的技术而制备，所述技术例如：使宿主免疫和收集血清（多克隆的），或制备连续杂 交细胞系和收集分泌的蛋白质（单克隆的），或克隆并表达至少编码特异性结合天然抗体 所需要的氨基酸序列的核苷酸序列或其诱变形式。抗体可包括完全免疫球蛋白或其片段， 所述免疫球蛋白包括多种分类和同种型，诸如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3、 IgM。功能性抗体片段可包括能够保留与全长抗体类似的亲和力的结合的抗体部分（例如， Fab、Fv和F (ab'）2或Fab'）。另外，在适当的情况下，可使用免疫球蛋白或其片段的聚集 体、聚合体和缀合物，只要基本保持对特定分子的结合亲和力即可。
[0026] 本文使用的"靶标"，通常是指当存在于生物样品中时可被检测的生物样品的组 分。靶标可为任何物质，对该物质存在着天然存在的特异性结合剂（例如，抗体）或可制 备针对该物质的特异性结合剂（例如，小分子结合剂）。一般来讲，结合剂可经靶标的一 个或多个离散化学部分或靶标的三维结构组分（例如，由肽折叠产生的三维结构）与靶标 结合。革G标可包括以下的一种或多种：肽、蛋白质（例如，抗体、亲和体（affibody)或适体 (aptamer))、核酸（例如，多核苷酸、DNA、RNA或适体）；多糖（例如，凝集素或糖）、脂质、 酶、酶底物、配体、受体、抗原或半抗原。在一些实施方案中，靶标可包括蛋白质或核酸。
[0027] 本文使用的术语"结合剂"是指可与生物样品中的一种或多种靶标结合的分子。结 合剂可与靶标特异性结合。合适的结合剂可包括以下一种或多种：天然或修饰的肽、蛋白质 (例如，抗体、亲和体或适体）、核酸（例如，多核苷酸、DNA、RNA或适体）；多糖（例如，凝集 素、糖）、脂质、酶、酶底物或抑制剂、配体、受体、抗原或半抗原等。合适的结合剂可根据待 分析的样品和可用于检测的靶标来选择。例如，在样品中的靶标可包括配体且结合剂可包 括受体，或者靶标可包括受体且探针可包括配体。类似地，靶标可包括抗原且结合剂可包括 抗体或抗体片段，或反之亦然。在一些实施方案中，靶标可包括核酸且结合剂可包括互补核 酸。在一些实施方案中，靶标和结合剂两者可包括能够彼此结合的蛋白质。
[0028] 本文使用的术语"特异性结合"是指与其他分子的明显较低识别相比，两种不同分 子之一对另一分子的特异性识别。所述分子在其表面上或在腔中可具有在两分子之间产生 特异性识别的区域，所述特异性识别由静电相互作用、氢键或疏水性相互作用中的一种或 多种产生。特异性结合的实例包括但不限于抗体-抗原相互作用、酶-底物相互作用、多核 苷酸相互作用等。在一些实施方案中，结合剂分子在环境条件（即PH大约6至大约8和温 度范围大约〇°C至大约37°C )下可对靶标具有不低于约IO5 M4的固有平衡结合常数（KA)。
[0029] 本文使用的术语"原位"通常是指在原始位置，例如在完整器官或组织中或在器官 或组织的代表性节段中发生的事件。在一些实施方案中，靶标的原位分析可在来源于各种 来源的细胞上进行，所述来源包括生物体、器官、组织样品或细胞培养物。原位分析提供前 后关系信息，该信息可在靶标从其来源位点除去时丢失。因此，靶标的原位分析描述了对 位于全细胞或组织样品中的结合有靶标的探针的分析，不管细胞膜是完全完整或部分完整 的，其中结合有靶标的探针保持在细胞内。此外，本文公开的方法可用于分析固定或未固定 的细胞或组织样品中的原位靶标。
[0030] "化学试剂"可包括能够修改荧光团或荧光团与结合剂之间的可切割接头（如果 存在的话）的一种或多种化学品。可使化学试剂与固体、溶液、凝胶或悬液形式的荧光团接 触。可用于修改信号的合适化学试剂包括：调节PH的试剂（例如酸或碱）、电子供体（例 如亲核试剂）、电子受体（例如亲电试剂）、氧化剂、还原剂或其组合。在某些实施方案中， 化学试剂可包括碱，例如，氢氧化钠、氢氧化铵、碳酸钾或乙酸钠。在某些实施方案中，化学 试剂可包括酸，例如，盐酸、硫酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸或二氯乙酸。在某些实施方案中，化 学试剂可包括亲核试剂，例如，氰化物、膦类或硫醇类。在某些实施方案中，化学试剂可包括 还原剂，例如，膦类、硫醇类、连二亚硫酸钠或在水存在下可使用的氢化物例如氢硼化物或 氰基氢硼化物。在某些实施方案中，化学试剂可包括氧化剂，例如，活性氧类、羟自由基、单 态氧、过氧化氢或臭氧。在某些实施方案中，化学试剂可包括氟化物，例如四丁基氟化铵、吡 啶-HF 或 SiF4。
[0031] -种或多种前述化学试剂可用于本文公开的方法，取决于荧光团、结合剂、靶标或 生物样品对该化学试剂的易感性。在某些实施方案中，可以使用基本上不影响结合剂、靶标 和生物样品的完整性的化学试剂。在某些实施方案中，可以使用不影响结合剂与靶标之间 的结合特异性的化学试剂。
[0032] 在某些实施方案中，当可同时使用两种或更多种荧光团时，化学试剂可能能够选 择性修饰一种或多种信号发生体（signal generator)。不同的信号发生体对化学试剂的易 感性可以部分地取决于信号发生体的浓度、温度或pH。例如，两种不同的荧光团对碱可具有 不同的易感性，取决于碱的浓度。
[0033] 本文使用的术语"明场型图像"或"虚拟染色图像"（VSI)是指模拟由明场染色方 案获得的图像的生物样品的图像。所述图像具有与明场图像类似的对比度、强度和颜色。这 允许表征生物样品内的特征，包括但不限于细胞核、上皮、基质或任何类型的胞外基质材料 特征，如同明场染色方案直接用于生物样品上。
[0034] 发明概沐 本发明包括通常涉及可用于将免疫荧光检测与基于荧光的核酸分析组合的分析、诊断 或预后应用的方法的实施方案。所公开的方法通常涉及来自单个生物样品的不同类型的靶 标（即蛋白和核酸）的检测和关联。在某些实施方案中，公开了使用相同检测通道检测相 同类型（即分别为蛋白或核酸）的多个靶标的方法。在这样的实施方案中，在多个不同类 型的靶标中可以获取相关性。
[0035] 本文公开的方法可以允许在同一生物样品中检测多个靶标，同时对生物样品的完 整性少有或没有影响。在同一生物样品中检测靶标，还可以提供在生物样品中有关靶标的 相关空间信息。本文公开的方法也可用于分析应用，在所述分析应用中可能得到有限量的 生物样品用于分析和可能必须处理同一样品用于多个分析。此外，可以使用相同检测通道 用于检测在样品中不同的靶标，使得对于多个靶标的分析而言较少的化学需要成为可能。 所述方法可以进一步帮助基于因为可分辨信号的限制而可受限于同时可检测靶标数量的 检测方法的分析。
[0036] 在某些实施方案中，在生物样品中检测多个靶标的方法包括在生物样品中序贯检 测靶标。所述方法通常包括以下步骤：在生物样品中检测第一靶标，任选修改来自第一靶标 的信号，和在生物样品中检测第二靶标。所述方法可以进一步包括重复以下步骤：修改来自 第一或第二靶标的信号，然后检测生物样品中的不同靶标，等等。
[0037] 在一个实施方案中，提供的是用于提供单个生物样品的合成图像的方法，其包括 以下有序步骤：（1)产生所述生物样品的第一图像；（2)产生所述生物样品的第二图像； 和（3)产生提供靶蛋白和靶核酸两者的相对位置的合成图像。产生所述生物样品的第一图 像的步骤包括以下步骤：(a)使固体载体上的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触；(b) 所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染色；(c)通过荧光检测来自第一结合剂和所述 荧光标记的信号；（d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像。产生 所述生物样品的第二图像的步骤包括以下步骤：(a)使来自步骤（1)的同一样品与至少一 种靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所述探针与所述靶核酸序列杂交；(b)任选地， 所述样品用所述荧光标记来染色；（c)通过荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的探针 和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第二 图像。在某些实施方案中，产生合成图像的步骤包括使用在第一图像的产生和第二图像的 产生中所得的信号信息以产生所述合成图像。在某些实施方案中，产生合成图像的步骤包 括登记来自步骤（1)中所得的荧光标记的信号位置以及来自步骤（2)中所得的荧光标记的 信号位置。
[0038] 在某些实施方案中，步骤（I) (d)包括：（i)根据所检测的荧光信号产生所述样品 的至少部分的初始图像；和（ii)根据所述初始图像选择目标区，和通过荧光检测来自至 少第一结合剂和所述荧光标记的信号，以比所述初始图像更高的分辨率产生第一图像。在 某些实施方案中，通过合并来自更高分辨率图像和第二图像的信号信息而产生所述合成图 像。在其它实施方案中，通过以下方法产生合成图像：所述方法包括登记来自更高分辨率图 像中的荧光标记的信号位置以及来自第二图像中的荧光标记的信号位置。在再其它实施方 案中，所述合成图像的产生包括登记来自步骤（1)中所得的荧光标记的信号位置以及来自 步骤（2)中所得的荧光标记的信号位置。
[0039] 在另一个实施方案中，提供的是用于产生单个生物样品的第一和第二图像的方 法，包括以下步骤：（1)产生所述生物样品的第一图像，包括以下步骤：（1)使固体载体上 的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触；(b)所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染 色；（C)通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的信号；（d)根据所检测的荧光信 号产生所述样品的至少部分的第一图像；和然后（2)产生所述生物样品的第二图像，包括 以下步骤：(a)使来自步骤⑴的同一样品与至少一种靶核酸序列的每一个的探针接触因 此使所述探针与所述靶核酸序列杂交；(b)任选地，所述样品用所述荧光标记来染色；（C) 通过荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的探针和所述荧光标记的信号；和（d)根据 所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第二图像。
[0040] 在具体的实施方案中，所述方法包括产生福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品 的第一低放大倍数图像，其已经被用于一种或多种标记和荧光标记（例如DAPI)染色法的 免疫荧光染色；根据低放大倍数图像产生虚拟H&E或虚拟DAB图像和使用该图像，根据染色 强度或形态学来选择目标区；产生所述样品的第二图像，其已经FISH和荧光标记染色法染 色；根据使用荧光标记染色法所得的共同图像，重叠或登记所述图像作为坐标以产生合成 图像。因此，在某些实施方案中，所述合成图像是明场型图像，例如虚拟H&E或虚拟DAB图 像。在某些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述图像，以测定单个细胞中的蛋白表达 和靶核酸序列的量。
[0041] 牛物样品 依据本发明的一个实施方案的生物样品可以是固体或液体。生物样品是指从生物受试 者获得的样品，包括体内或体外获得的生物组织或流体来源的样品。生物样品的合适实例 可以包括但不限于血、唾液、脑脊液、胸膜液、奶、淋巴、痰、精液、尿、粪、泪、针吸出物、皮肤 的外部切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、肿瘤、器官、细胞培养物或实体组织切片。在某些 实施方案中，所述生物样品可按原样分析，即不用收获和/或分离目标靶标。在替代实施方 案中，可在分析前收获样品。在某些实施方案中，本文公开的方法可特别适合于生物样品的 体外分析。可将生物样品固定在固体载体上，例如在玻璃载片、微量滴定板或ELISA板中。
[0042] 生物样品可包括任何前述样品，无论它们的物理状态如何，例如但不限于被冷冻 或染色或经其它处理。在某些实施方案中，生物样品可包括不天然与天然样品混合的化合 物，例如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。
[0043] 生物样品可为原核来源或真核来源（例如，昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬行动物）。在 某些实施方案中，所述生物样品为哺乳动物（例如，大鼠、小鼠、牛、狗、驴、豚鼠或兔）。在某 些实施方案中，所述生物样品为灵长类动物来源（例如，黑猩猩或人）。
[0044] 在某些实施方案中，生物样品可包括组织样品、全细胞、细胞组分、细胞离心涂片 或细胞涂片。在某些实施方案中，生物样品基本上包括组织样品。组织样品可包括得自生 物受试者组织且可具有相似功能的相似细胞的集合。在某些实施方案中，组织样品可包括 得自人体组织的相似细胞的集合。人体组织的合适实例包括但不限于（1)上皮组织；（2) 结缔组织，包括血管、骨和软骨；（3)肌肉组织；和（4)神经组织。组织样品的来源可以是 得自新鲜、冷冻和/或保藏的器官或组织样品或活检或吸出物的实体组织；血或任何血液 组分；体液，例如脑脊液、羊膜液、腹膜液或间隙液；或来自受试者的妊娠或发育的任何时 间的细胞。在某些实施方案中，所述组织样品可包括原代或培养的细胞或细胞系。
[0045] 组织样品可以通过多种程序而获得，所述程序包括但不限于手术切除、吸引术或 活检。在某些实施方案中，所述组织样品可以是固定的和包埋在石蜡中。所述组织样品可 以是固定的或通过常规方法而另外保存的；可以按照组织是进行组织染色或其它分析的目 的来确定固定剂的选择。固定的长度可以取决于组织样品的大小和所用的固定剂。例如， 中性缓冲的福尔马林、Bouin氏或低聚甲醛，可用于固定或保存组织样品。
[0046] 在某些实施方案中，生物样品包括正常或癌变来源的组织切片，例如来自结肠、乳 腺、前列腺、肺、肝和胃的组织切片。组织切片可包括一份或一片组织样品，例如，从组织样 品上切下的组织或细胞薄片。在某些实施方案中，可获取组织样品的多个切片并进行分析， 前提是本文公开的方法可用于分析组织样品的同一切片的至少2个不同靶标（即其中之一 是蛋白质来源，另一是核酸来源）。组织切片，如果用作生物样品，可以具有的厚度范围小于 大约100微米，范围小于大约50微米，范围小于大约25微米，或范围小于大约10微米。
[0047] 靶蛋白 本发明的实施方案的靶蛋白可以存在于生物样品表面上（例如组织切片表面的抗原） 或存在于大块样品中（例如缓冲液中的抗体）。在某些实施方案中，靶蛋白可能并非固有地 存在于生物样品表面上并且生物样品可能必须经处理而使靶蛋白在表面上可用。在某些实 施方案中，所述靶蛋白可以在组织中，无论是在细胞表面还是细胞内。
[0048] 可以根据生物样品所需分析的类型和性质来确定待分析的靶蛋白的适用性。在某 些实施方案中，靶标可提供有关生物样品中的分析物存在或不存在的信息。在另一个实施 方案中，靶蛋白可提供生物样品状态的信息。例如，如果生物样品包括组织样品，本文公开 的方法可用于检测靶蛋白，其可有助于比较不同类型的细胞或组织，比较不同发育时期，检 测疾病或异常的存在，或确定疾病或异常的类型。
[0049] 合适的靶蛋白可包括一种或多种肽、蛋白质（例如抗体、亲和体或适体）、酶、配 体、受体、抗原或半抗原。一种或多种前述靶蛋白可以是特定细胞所特有的，而其它靶蛋白 可以与特定疾病或病症相关。在某些实施方案中，使用本文公开的方法可检测和分析的组 织样品中的靶蛋白可以包括但不限于预后标记、预测标记、激素或激素受体、淋巴样、肿瘤 标记、细胞周期相关标记、神经组织和肿瘤标记或群分化标记。
[0050] 预后标记的合适实例可包括酶靶标例如半乳糖基转移酶II、神经元特异性烯醇 酶、质子ATP酶-2或酸性磷酸酶。预后蛋白或基因标记的其它实例包括Ki67、细胞周期蛋 白 E、p53、cMeto
[0051] 预测标记（药物反应）的合适实例可包括蛋白或基因革El标例如EGFR、Her2、ALK。
[0052] 激素或激素受体的合适实例可包括人绒毛膜促性腺激素（HCG)、促肾上腺皮质激 素、癌胚抗原（CEA)、前列腺-特异性抗原（PSA)、雌激素受体、黄体酮受体、雄激素受体、 gClq_R/p33补体受体、IL-2受体、p75神经营养蛋白受体、PTH受体、甲状腺激素受体或胰 岛素受体。
[0053] 淋巴样的合适实例可包括α-l-抗胰凝乳蛋白酶、α-l-抗胰蛋白酶、B细胞靶 标、bcl-2、bcl-6、B淋巴细胞抗原36 kD、BMl (骨髓样靶标）、ΒΜ2 (骨髓样靶标）、半乳 凝素-3、粒酶B、HLA I类抗原、HLA II类（DP)抗原、HLA II类（DQ)抗原、HLA II类（DR) 抗原、人嗜中性粒细胞防卫素、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白Μ、κ 轻链、κ轻链、λ轻链、淋巴细胞/组织细胞抗原、巨噬细胞靶标、胞壁质酶（溶菌酶）、P80 间变性淋巴瘤激酶、浆细胞靶标、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂、T细胞抗原受体（JOVI 1)、T 细胞抗原受体（JOVI 3)、末端脱氧核苷酸转移酶或未成簇的B细胞靶标。
[0054] 肿瘤标记的合适实例可包括α甲胎蛋白、载脂蛋白D、BAG-1 (RAP46蛋白）、 CA19-9 (sialyl lewisa)、CA50 (癌相关粘蛋白抗原）、CA125 (卵巢癌抗原）、CA242 (肿 瘤相关粘蛋白抗原）、嗜铬粒蛋白A、簇集蛋白（载脂蛋白J)、上皮膜抗原、上皮相关抗原、上 皮特异性抗原、巨囊性病的液状蛋白-15、肝细胞特异性抗原、调蛋白、人胃粘蛋白、人乳汁 脂肪球、MAGE-1、基质金属蛋白酶、melan A、黑素瘤革巴标（HMB45)、间皮素、金属硫蛋白、小眼 转录因子（MITF)、Muc_l核心糖蛋白、Muc-I糖蛋白、Muc-2糖蛋白、Muc_5AC糖蛋白、Muc-6 糖蛋白、髓过氧化物酶、Myf-3 (横纹肌肉瘤靶标）、Myf_4 (横纹肌肉瘤靶标）、MyoDl (横 纹肌肉瘤靶标）、肌红蛋白、nm23蛋白、胎盘碱性磷酸酶、前白蛋白、前列腺特异性抗原、前 列腺酸性磷酸酶、前列腺抑制素肽、PTEN、肾细胞癌靶标、小肠粘蛋白抗原、四连接素、甲状 腺转录因子-1、基质金属蛋白酶1的组织抑制剂、基质金属蛋白酶2的组织抑制剂、酪氨酸 酶、酪氨酸酶相关蛋白 -1、绒毛蛋白或von Willebrand因子。
[0055] 细胞周期相关标记的合适实例可包括凋亡蛋白酶活化因子-1、bcl-w、bcl-x、溴 脱氧尿苷、CAK (cdk活化激酶）、细胞凋亡易感性蛋白（CAS)、胱冬蛋白酶2、胱冬蛋白酶8、 CPP32 (胱冬蛋白酶-3)、CPP32 (胱冬蛋白酶-3)、细胞周期蛋白依赖性激酶、细胞周期蛋 白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白D2、细胞周期蛋白D3、细胞周期蛋 白E、细胞周期蛋白G、DNA片段化因子（N-末端）、Fas (⑶95)、Fas-相关死亡结构域蛋白、 Fas配体、Fen-1、IPO-38、Mcl-U微型染色体维持蛋白、错配修复蛋白（MSH2)、多（ADP-核 糖）聚合酶、增殖细胞核抗原、P16蛋白、p 27蛋白、p34cdc2、p57蛋白（Kip2)、pl05蛋白、 Stat I α、拓扑异构酶I、拓扑异构酶II α、拓扑异构酶III α或拓扑异构酶II β。
[0056] 神经组织和肿瘤标记的合适实例可包括a B晶体蛋白、α-丝联蛋白、α突触核 蛋白、淀粉样蛋白前体蛋白、β淀粉样蛋白、钙结合蛋白、胆碱乙酰转移酶、兴奋性氨基酸转 运子1、GAP43、神经胶质原纤维酸性蛋白、谷氨酸盐受体2、髓磷脂碱性蛋白、神经生长因子 受体（gp75)、神经母细胞瘤靶标、神经丝68 kD、神经丝160 kD、神经丝200 kD、神经元特异 性烯醇酶、烟碱乙酰胆碱受体α 4、受体烟碱乙酰胆碱受体β 2、外周蛋白、蛋白基因产物9、 S-100蛋白、5-羟色胺、SNAP-25、突触蛋白I、突触素、tau、色氨酸羟化酶、酪氨酸羟化酶或 泛蛋白。
[0057] 群（cluster)分化标记的合适实例可包括 CDla、CDlb、CDlc、CDlcU CDle、CD2、 CD3A、CD3 ε、CD3y、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8a、〇)8β、CD9、CD10、CDlla、CDllb、CDllc、 CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、 CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、 CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD46、CD47、CD48、 CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、 CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD65s、CD66a、CD66b、 CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD68、CD69、CD70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、 CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、 CDw92、CDw93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CDlOl、CD102、CD103、CD104、 CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDwl08、CD109、CD114、CD115、CD116、CD117、CDwll9、CD120a、 CD120b、CD121a、CDwl21b、CD122、CD123、CD124、CDwl25、CD126、CD127、CDwl28a、CDwl28b、 CD130、CDwl31、CD132、CD134、CD135、CDwl36、CDwl37、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、 CD142、CD143、CD144、CDwl45、CD146、CD147、CD148、CDwl49、CDwl50、CD151、CD152、CD153、 CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166 和 TCR-zeta。
[0058] 其它合适的靶蛋白包括着丝粒蛋白-F (CENP-F)、巨蛋白、内披蛋白、核纤层蛋白 A&C (XB 10)、LAP-70、粘蛋白、核孔复合体蛋白、P180片层体蛋白、ran、组织蛋白酶D、Ps2 蛋白、他『2-1^11、？53、5100、上皮靶抗原出麻）、丁(11\]\^2、]\^3、？〇隱、灯67、细胞角蛋白、？131(、 cMyc 或 MAPK。
[0059] 再其它合适的靶蛋白包括Her2/neu (在乳腺癌和胃癌中过量表达的表皮生长因 子，经单克隆抗体治疗减缓肿瘤生长）；EGF-R/erbB (表皮生长因子受体）；ER (某些乳腺 癌肿瘤生长所需的雌激素受体，位于胞核中且用ISH检测以决定限制阳性患者中雌激素的 治疗）；PR (黄体酮受体是与DNA结合的激素）；AR (雄激素受体参与雄激素依赖性肿瘤生 长）；β-连环蛋白（癌症中的癌基因，从细胞膜易位到细胞核，其在细胞粘附和作为潜在基 因调节蛋白二者中起作用）；磷酸-β-连环蛋白（β-连环蛋白的磷酸化形式在胞质溶胶 中降解且不转运到细胞核）；GSK3 β (在Wnt途径中的糖原合酶激酶-3 β蛋白，使β -连 环蛋白磷酸化，标记磷酸-β-连环蛋白以便在原口动物（protosome)中快速降解）；PKC|3 (介体G-蛋白偶联受体）；NFKf3 (当转运到细胞核时炎症的核因子κΒ标记）；VEGF(血 管生成相关的血管内皮生长因子）；E-钙黏蛋白（在上皮细胞上表达的细胞-细胞相互作 用分子，其功能在上皮癌中丧失）；c-met (酪氨酸激酶受体）。在一个优选的实施方案中， 所述靶蛋白是HER2。
[0060] 靶核酸序列 本发明实施方案的靶核酸序列是指生物样品中的核酸分子所含有的目标序列。核酸分 子可以存在于生物样品的细胞核中（例如染色体DNA)或存在于细胞质中（例如mRNA)。在 某些实施方案中，核酸分子可能并非固有地存在于生物样品表面上并且生物样品可必须经 处理而使核酸分子可被探针接近。例如，样品的蛋白酶处理能够容易地带来靶核酸序列。
[0061] 可以根据生物样品所需分析的类型和性质来确定待分析的核酸分子的适用性。在 某些实施方案中，分析可提供有关生物样品中的靶核酸序列的基因表达水平的信息。在其 它实施方案中，分析可提供染色体DNA的存在或不存在或扩增水平的有关信息。例如，如果 生物样品包括组织样品，则本文公开的方法可用于检测靶核酸序列，其可以识别具有包含 靶核酸序列的特定染色体节段的增加的拷贝数的细胞。
[0062] 在某些实施方案中，使用本文公开的方法可以检测和分析的组织样品中的靶核酸 序列可以包括但不限于以下的核酸序列：预后标记、激素或激素受体、淋巴样、肿瘤标记、细 胞周期相关标记、神经组织和肿瘤标记、或群分化标记。这些标记的实例描述于题为"靶 蛋白"的部分中。例如，在一个实施方案中，所述靶核酸序列靶是针对以下的序列：EGFR、 T0P2A、cMyc、ALK、FGFRl 或 HER2 基因。
[0063] 在某些实施方案中，所述靶核酸序列包括其为编码靶蛋白的基因序列的一部分的 序列。在其它实施方案中，所述靶核酸序列不包括其为编码靶蛋白的基因序列的一部分的 序列。因此，所述靶核酸序列可包括其为编码并非靶蛋白的不同蛋白的基因序列的一部分 的序列。
[0064] 靶核酸序列的探针 在某些实施方案中，探针用于检测靶核酸序列。最好是探针特异性地结合到含有目标 序列的核酸分子的区域。因此，在某些实施方案中，所述探针是序列特异性的。序列-特异 性探针可包括核酸并且所述探针可以能够识别核苷酸或其衍生物的特定线状排列。在某些 实施方案中，所述线状排列可包括毗邻核苷酸或其衍生物，其各自可以与探针中的相应的 互补核苷酸连接。在替代的实施方案中，当有1、2或更多个核苷酸可以不具有探针上的相 应的互补残基时，所述序列可不毗邻。探针的合适实例可包括但不限于DNA或RNA寡核苷 酸或多核苷酸、肽核酸（PNA)序列、锁核酸（LNA)序列或适体。在某些实施方案中，合适的 探针可包括核酸类似物，例如dioxygenin dCTP、生物素 dcTP 7-氮杂鸟苷、叠氮胸苷、肌苷 或尿苷。
[0065] 在某些实施方案中，探针可以与革El核酸序列构成Watson-Crick键。在另一个实施 方案中，探针可以与革El核酸序列构成Hoogsteen键，从而形成三链体。通过Hoogsteen结合 而结合的探针可以进入核酸序列的大沟并与位于其中的碱基杂交。在某些实施方案中，探 针可以与革G核酸序列同时构成Watson-Crick键和Hoogsteen键（例如，双PNA探针能够与 核酸分子同时构成Watson-Crick和Hoogsteen结合）。
[0066] 在某些实施方案中，探针可包括核酸探针、肽核酸探针、锁核酸探针、mRNA探针、 miRNA探针或siRNA探针。
[0067] 探针的长度也可决定结合特异性。对于较短序列而言，探针和靶核酸序列之间的 单个错配的能量消耗可以比较长序列相对高。在某些实施方案中，较小探针的杂交比较长 探针的杂交可能更具特异性，因为较长探针可能更易于错配并且根据条件可以继续与核酸 结合。在某些实施方案中，在指定温度和盐浓度时，较短探针可能具有较低的结合稳定性。 与短序列结合具有更大稳定性的探针可用于这种情况（例如双PNA)。在某些实施方案中， 探针的长度范围可以是大约4个核苷酸至大约12个核苷酸，大约12个核苷酸至大约25个 核苷酸，大约25个核苷酸至大约50个核苷酸，大约50个核苷酸至大约100个核苷酸，大约 100个核苷酸至大约250个核苷酸，大约250个核苷酸至大约500个核苷酸，或大约500个 核苷酸至大约1000个核苷酸。在某些实施方案中，探针的长度范围可以是大于大约1000 个核苷酸。不管探针的长度如何，不是所有的探针核苷酸残基可以与靶核酸序列中的互补 核苷酸杂交。例如，探针长度可包括50个核苷酸残基，并且这些残基中仅有25个可与靶核 酸序列杂交。在某些实施方案中，可以杂交的核苷酸残基可以彼此毗邻。探针可以是单链 或可包括二级结构。
[0068] 在某些实施方案中，生物样品可包括细胞或组织样品并且所述生物样品可以使用 探针进行原位杂交（ISH)。在某些实施方案中，除免疫荧光（IF)外，组织样品还可以经历原 位杂交，以获取有关组织样品的想要的信息。
[0069] 无论探针和靶核酸序列的种类如何，探针和核酸序列之间的结合特异性也可能受 到结合条件的影响（例如，就互补核酸而言的杂交条件）。可通过调节PH、温度或盐浓度的 一项或多项，实现合适的结合条件。
[0070] 探针可以用荧光团固有标记（在探针合成期间连接荧光团）或非固有标记（在后 续步骤期间连接荧光团）。例如，可以使用将荧光团-标记的核苷酸直接掺入到生长中的核 酸链的方法，合成固有标记的核酸。在某些实施方案中，以可将荧光团在后期掺入的方式可 以合成探针。例如，这后一种标记可以通过将活性氨基或巯基引入核酸链中的化学方法而 得以实现。在某些实施方案中，可使用针对探针的合适化学，将探针例如核酸（例如DNA) 直接化学标记。
[0071] 结合剂 本文公开的方法涉及以特定方式与靶标物理结合的结合剂的使用。在某些实施方案 中，结合剂可以以足够的特异性与靶标结合，也就是说，结合剂可以比其与任何其它分子结 合更大的亲和力与靶标结合。在某些实施方案中，结合剂可与其它分子结合，但所述结合可 能是这样的：非特异性结合可以在背景水平或接近背景水平。在某些实施方案中，结合剂对 目标靶标的亲和力可以在其对其它分子的亲和力的至少2倍、至少5倍、至少10倍或更高 的范围内。在某些实施方案中，可以使用具有最大差异亲和力的结合剂，尽管它们可能并非 是与靶标具有最大亲和力的那些。
[0072] 靶标和结合剂之间的结合可能受到物理结合的影响。物理结合可包括使用非共价 相互作用而实现的结合。非共价相互作用可以包括但不限于疏水性相互作用、离子相互作 用、氢键相互作用或亲和力相互作用（例如，生物素-抗生物素蛋白或生物素-链霉抗生物 素络合作用）。在某些实施方案中，靶标和结合剂在它们的表面上或腔中可能具有区域，弓丨 起两者之间的特异性识别，导致物理结合。在某些实施方案中，根据它们分子形状的一部分 的相互配合，结合剂可以与生物靶标结合。
[0073] 结合剂及其相应的靶标可被认为是结合对，其非限制性实例包括：免疫型结合对， 例如，抗原/抗体、抗原/抗体片段或半抗原/抗半抗原；非免疫型结合对，例如生物素/抗 生物素蛋白、生物素/链霉抗生物素、叶酸/叶酸结合蛋白、激素/激素受体、凝集素/特异 性碳水化合物、酶/酶、酶/底物、酶/底物类似物、酶/假-底物（不能通过酶活性催化的 底物类似物）、酶/辅因子、酶/调节剂、酶/抑制剂或维生素 B12/内在因子。结合对的其 它合适实例可包括互补核酸片段（包括DNA序列、RNA序列、PNA序列、和肽核酸序列、锁核 酸序列）；蛋白A/抗体；蛋白G/抗体；核酸/核酸结合蛋白；或多核苷酸/多核苷酸结合蛋 白。
[0074] 在某些实施方案中，结合剂可以是序列-或结构-特异性结合剂，其中结合剂所识 别和结合的靶标的序列或结构对于该靶标而言可能是足够独特的。
[0075] 在某些实施方案中，结合剂可以是结构-特异性的并且可以识别靶标的一级、二 级或三级结构。靶标的一级结构可包括其原子组成和连接这些原子的化学键（包括立体化 学）的详细说明，例如，在蛋白质中的氨基酸的线状排列的种类和性质。靶标的二级结构可 指生物分子节段的常规三维形式，例如，对于蛋白而言，二级结构可指肽"主链"折叠为不同 构象，其可导致远离的氨基酸彼此靠近。二级结构的合适实例可包括但不限于α螺旋、β 折叠片或无规则卷曲。靶标的三级结构可以是其整体的三维结构。靶标的四级结构可以是 通过其与一个或多个其它靶标或大分子的非共价相互作用（例如蛋白相互作用）而构成的 结构。四级结构的实例可以是通过4个球蛋白亚基构成的结构，形成血红蛋白。本发明实 施方案的结合剂对于任何上述结构而言可以是特异性的。
[0076] 结构-特异性结合剂的实例可包括可与蛋白靶标结合的蛋白-特异性分子。合适 的蛋白-特异性分子的实例可包括抗体和抗体片段、核酸（例如，识别蛋白靶标的适体）、或 蛋白底物（非可催化的）。
[0077] 在某些实施方案中，靶标可包括抗原，结合剂可包括抗体。合适的抗体可包括单克 隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）或抗体片段，只要它们与靶抗原 特异性结合。
[0078] 在某些实施方案中，靶标可包括单克隆抗体。"单克隆抗体"可指得自基本均一抗 体群的抗体，即，包含该群体的单个抗体是相同的，除了以少数量存在的可能天然发生的突 变之外。单克隆抗体可以是高度特异性的，针对单一抗原性位点。此外，与典型地包括针对 不同抗原决定簇（表位）的不同抗体的（多克隆）抗体制剂相反，每种单克隆抗体可以针 对抗原上的单一抗原决定簇。可通过任何已知方法制备单克隆抗体，所述方法例如杂交瘤 方法、重组DNA方法、或可自噬菌体抗体文库分离。
[0079] 在某些实施方案中，生物样品可包括细胞或组织样品，和本文公开的方法可以用 于免疫荧光（IF)。免疫化学可涉及靶抗原与基于抗体的结合剂的结合，以提供组织或细胞 (例如患病的与正常的细胞）的有关信息。适合作为用于本文公开方法的结合剂的抗体 (和相应的疾病/疾病细胞）的实例包括但不限于：抗雌激素受体抗体（乳腺癌）、抗黄体 酮受体抗体（乳腺癌）、抗p53抗体（多种癌症）、抗Her-2/neu抗体（多种癌症）、抗EGFR 抗体（表皮生长因子、多种癌症）、抗组织蛋白酶D抗体（乳腺癌和其它癌症）、抗Bcl-2抗 体（凋亡细胞）、抗E-钙黏蛋白抗体、抗CA125抗体（卵巢癌和其它癌）、抗CA15-3抗体 (乳腺癌）、抗CA19-9抗体（结肠癌）、抗c-erbB-2抗体、抗P-糖蛋白抗体（MDR、多重药物 抗性）、抗CEA抗体（癌胚抗原）、抗成视网膜细胞瘤蛋白（Rb)抗体、抗ras癌蛋白（p21) 抗体、抗Lewis X (也称为CD15)抗体、抗Ki-67抗体（细胞增殖）、抗PCNA(多种癌症） 抗体、抗CD3抗体（T-细胞）、抗CD4抗体（辅助T细胞）、抗CD5抗体（T细胞）、抗CD7抗 体（胸腺细胞、不成熟T细胞、NK杀伤细胞）、抗CD8抗体（抑制T细胞）、抗CD9/p24抗体 (ALL)、抗CDlO (也称为CALLA)抗体（常见急性成淋巴细胞性白血病）、抗CDllc抗体（单 核细胞、粒细胞、AML)、抗CD13抗体（髓单核细胞、AML)、抗CD14抗体（成熟单核细胞、粒 细胞）、抗CD15抗体（霍奇金病）、抗CD19抗体（B细胞）、抗CD20抗体（B细胞）、抗CD22 抗体（B细胞）、抗CD23抗体（活化B细胞、CLL)、抗CD30抗体（活化T细胞和B细胞、霍 奇金病）、抗CD31抗体（血管生成标记）、抗CD33抗体（骨髓细胞、AML)、抗CD34抗体（内 皮干细胞、间质瘤）、抗CD35抗体（树突细胞）、抗CD38抗体（浆细胞、活化T、B和骨髓细 胞）、抗CD41抗体（血小板、巨核细胞）、抗LCA/CD45抗体（白细胞共同抗原）、抗CD45RO 抗体（辅助、诱导T细胞）、抗⑶45RA抗体（B细胞）、抗⑶39、⑶100抗体、抗⑶95/Fas抗 体（细胞凋亡）、抗CD99抗体（尤文氏肉瘤标记、MIC2基因产物）、抗CD106抗体（VCAM-1 ; 活化内皮细胞）、抗泛蛋白抗体（阿尔茨海默病）、抗CD71 (转铁蛋白受体）抗体、抗c-myc (癌蛋白和半抗原）抗体、抗细胞角蛋白（转铁蛋白受体）抗体、抗波形蛋白（内皮细胞） 抗体（B和T细胞）、抗HPV蛋白（人乳头瘤病毒）抗体、抗κ轻链抗体（B细胞）、抗λ轻 链抗体（Β细胞）、抗黑素体（ΗΜΒ45)抗体（黑素瘤）、抗前列腺特异性抗原（PSA)抗体（前 列腺癌）、抗S-100抗体（黑素瘤、salvary、神经胶质细胞）、抗tau抗原抗体（淀粉样蛋白 相关疾病）、抗纤维蛋白抗体（上皮细胞）、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体（肿瘤）、抗 α -连环蛋白（细胞膜）或抗Tn-抗原抗体（结肠癌、腺癌和胰腺癌）。
[0080] 合适的抗体的其它具体实例可包括但不限于：抗增殖细胞核抗原、克隆PClO (Sigma Aldrich、P8825);抗平滑肌 α 肌动蛋白（SmA)、克隆 1Α4 (Sigma、A2547);兔抗 β 连环蛋白（Sigma、C 2206);小鼠抗全细胞角蛋白、克隆PCK-26 (Sigma、C1801);小鼠抗雌 激素受体α、克隆1D5 (DAKO、M 7047) ;β连环蛋白抗体、克隆15B8 (Sigma、C 7738);山羊 抗波形蛋白（Sigma、V4630);循环雄激素受体克隆 AR441 (DAKO、M3562) ;Von Willebrand 因子7、角蛋白5、角蛋白8/18、e-钙黏蛋白、Her2/neu、雌激素受体、p53、黄体酮受体、 β 连环蛋白；驴抗小鼠 （Jackson Immunoresearch, 715-166-150);或驴抗兔（Jackson Immunoresearch, 711-166-152)。
[0081] 无论结合剂和靶标的种类如何，结合剂和靶标之间的结合特异性还可能受到结合 条件的影响（例如，就互补核酸而言的杂交条件）。可通过调节pH、温度或盐浓度的一项或 多项，实现合适的结合条件。
[0082] 如上所述，结合剂可以用荧光团固有标记（在结合剂合成期间连接荧光团）或非 固有标记（在后续步骤期间连接荧光团）。例如对于基于蛋白的结合剂，可通过使用荧光团 标记的氨基酸，制备固有标记的结合剂。在某些实施方案中，以可将荧光团在后期掺入的方 式可以合成结合剂。在某些实施方案中，可使用针对结合剂的合适化学，将结合剂例如蛋白 (例如抗体）或核酸（例如DNA)直接化学标记。
[0083] 在某些实施方案中，可使用结合剂的组合，其可提供更大的特异性或在某些实施 方案中放大信号。因此，在某些实施方案中，可使用结合剂夹心，其中第一结合剂可与靶标 结合并用于提供第二结合，其中第二结合剂可包括或不包括荧光团，其可进一步提供第三 结合（如果需要的话），其中第三结合成员可包括荧光团。
[0084] 结合剂组合的合适实例可包括第一抗体-第二抗体、互补核酸或其它配体-受体 对（例如生物素-链霉抗生物素）。合适的结合剂对的某些具体实例可包括小鼠抗myc， 对于具有c-myc表位的重组表达的蛋白；小鼠抗HisG，对于具有His-Tag表位的重组蛋白； 小鼠抗xpress，对于具有表位-tag的重组蛋白；兔抗山羊，对于山羊IgG第一分子；互补 核酸序列，对于核酸；小鼠抗硫（thio)，对于硫氧还蛋白融合蛋白；兔抗GFP，对于融合蛋 白；jacalin，对于a-D-半乳糖；和蜜二糖，对于碳水化合物-结合蛋白、糖、镍偶联基质 (nickel couple matrix)或月干素。
[0085] 在某些实施方案中，第一抗体和第二抗体的组合可用作结合剂。第一抗体能够与 靶标的特定区域结合，而第二抗体能够与第一抗体结合。可第二抗体在与第一抗体结合之 前与荧光团连接，或可在后续步骤与荧光团结合。在替代的实施方案中，可使用第一抗体和 特异性结合配体-受体对（例如生物素-链霉抗生物素）。可将第一抗体连接到所述对的 一个成员（例如生物素），而可将其它成员（例如链霉抗生物素）用荧光团标记。第二抗 体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素或生物素可以各自独立地用荧光团标记。
[0086] 在某些实施方案中，本文公开的方法可用于免疫荧光程序，第一抗体可用于与组 织样品中的靶抗原特异性结合。第二抗体可用于与第一抗体特异性结合，从而在第一抗 体和后续试剂（例如荧光团）（如果有的话）之间构成桥连。例如，第一抗体可以是小鼠 IgG(在小鼠中产生的抗体）和相应的第二抗体可以是具有能够与小鼠 IgG中的区域结合的 区域的山羊抗小鼠（在山羊中产生的抗体）。
[0087] 在某些实施方案中，当若干第二抗体可与第一抗体上的表位结合时，可以得到信 号放大。在免疫荧光程序中，第一抗体可以是用于该程序的第一种抗体，而第二抗体可以是 用于该程序的第二种抗体。在某些实施方案中，第一抗体可以是用于IF程序的唯一抗体。
[0088] 产牛牛物样品的第一图像 在本发明的某些实施方案中，所述方法包括产生生物样品的第一图像的步骤。第一图 像通过如下产生：(a)使固体载体上的样品与靶蛋白的第一结合剂接触；(b)所述样品用 提供形态学信息的荧光标记来染色；（c)通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的 信号；和（d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像。在某些实施方 案中，所述方法还包括，在第一步骤中，使所述样品与提供额外的形态学信息的至少一种额 外的结合剂接触；和通过荧光检测来自至少一种额外的结合剂的信号。在某些实施方案中， 步骤（c)还包括通过荧光检测源自诸如红细胞、形成纤维性组织和脂褐质颗粒等结构的内 源荧光信号（也称为自发荧光）。在某些实施方案中，产生第一图像（步骤（d))包括，根据 所检测的荧光信号以较低放大倍数产生所述样品的至少部分的初始图像；根据所述初始图 像选择目标区，和通过荧光检测来自至少第一结合剂和所述荧光标记的信号，以比所述初 始图像更高的分辨率产生第一图像。关于"选择目标区"，其被理解为指（1)使用者根据初 始图像选择目标区；（2)计算机（即执行所述方法的成像系统）根据初始图像、算法和收到 的指令选择目标区；或（3)计算机根据初始图像和算法选择目标区。应当知道，第一图像 不一定指所产生的初始图像。同样，第二图像不照字面含义指通过所述方法的实施方案产 生的所述第二图像。
[0089] 在某些实施方案中，产生生物样品的第一图像的方法包括以下步骤：(a)使固体 载体上的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触；(b)所述样品用提供形态学信息的荧光标 记来染色；（c)通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检测 的第一结合剂和任选地所述荧光标记的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像。因 此，在这样的实施方案中，第一图像可用于识别样品中的靶蛋白，而获取得自荧光标记的信 号，以允许将图像登记下来，如本文中定义。
[0090] 在某些实施方案中，所述初始图像可以是一个或多个明场型图像，其类似于明场 染色方案。因此，初始荧光图像数据可用于经由算法而产生模拟的（虚拟的/分子的）苏 木精和伊红（H&E)图像。或者，模拟的（虚拟的/分子的）3, 3'-二氨基联苯胺（DAB)图 像可经由类似算法而产生。将荧光图像数据转化为明场型图像的详细方法描述于下文，标 题为"图像采集和分析"。明场型图像随后用于选择目标区。
[0091] 在某些实施方案中，生物样品可包括全细胞、组织样品或微阵列。在某些实施方案 中，生物样品可包括组织样品。所述组织样品可通过多种程序而获得，包括但不限于手术切 除、吸引术或活检。所述组织可以是新鲜或冷冻的。在某些实施方案中，所述组织样品可以 是固定的和包埋在石蜡中。所述组织样品可以是固定的或通过常规方法而另外保存的；可 以按照对组织进行组织染色或其它分析的目的来确定固定剂的选择。固定的长度可以取决 于组织样品的大小和所用的固定剂。例如，中性缓冲的福尔马林、Bouin氏或低聚甲醛，可 用于固定或保存组织样品。
[0092] 在某些实施方案中，所述组织样品可以首先被固定，然后通过一系列递增的乙醇 而脱水、浸润和用石蜡或其它切片介质包埋，使得可以将所述组织样品切片。在替代实施方 案中，可将组织样品切片并随后将其固定。在某些实施方案中，所述组织样品可以在石蜡中 包埋和处理。可以使用的石赌的实例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuecan。一 旦将组织样品包埋后，可通过切片机将样品切片，其厚度范围可为大约3微米至大约5微 米。切片后，可使用粘合剂将切片贴在玻片上。玻片粘合剂的实例可以包括但不限于硅烷、 明胶、聚-L-赖氨酸。在某些实施方案中，如果将石蜡用作包埋材料，可将组织切片去石蜡 化和在水中再水合。通过例如使用有机试剂（例如二甲苯或逐步递减的一系列乙醇）可将 组织切片去石蜡化。
[0093] 在某些实施方案中，除了上述样品制备程序之外，可在免疫荧光测定之前、期间或 之后将组织切片经过进一步处理。例如，在某些实施方案中，可将组织切片经过表位（即抗 原）恢复方法，例如，在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品。在某些实施方案中，可将组织切 片任选经过封闭步骤以尽可能降低任何非特异性结合。
[0094] 样品制备之后，可将样品与结合剂溶液（例如，免疫荧光程序中的标记的抗体溶 液）在适于结合剂与靶蛋白（例如，免疫荧光程序中的抗原）结合的条件下接触足够的时 间。在某些实施方案中，在接触步骤中可将生物样品与超过一种结合剂接触。多种结合剂 可能够结合生物样品中的不同的靶蛋白。例如，生物样品可包括2种靶蛋白：靶1和靶2， 并且2组结合剂可用于这种情况：结合剂1 (能够结合靶1)和结合剂2 (能够结合靶2)。 可将多种结合剂与生物样品同时接触（例如作为单一的混合物）。
[0095] 除了使所述样品与一种或多种靶标的一种或多种结合剂接触之外，所述样品也可 用提供形态学信息的至少一种额外的结合剂染色。在一个实施方案中，提供形态学信息的 结合剂可以与靶标的结合剂同时包括在内。在其它实施方案中，它们可用于在结合剂-靶 反应后使所述样品染色。
[0096] 所述形态学信息包括但不限于组织形态学信息，例如组织类型和来源、某些细胞 来源的有关信息、细胞的亚细胞结构（例如膜、细胞质或核）的有关信息、细胞分化状态、细 胞周期阶段、细胞代谢状态、细胞坏死或细胞凋亡的有关信息、细胞类型、和肿瘤、正常区和 基质区。例如，形态学信息可包括上皮起源的细胞的细胞质位置的有关信息或它可以指示 肿瘤的不良分化或坏死区的位置。
[0097] 可通过与生物样品中的特异性靶标结合的至少一种额外的结合剂来提供形态学 信息。在某些实施方案中，至少一种额外的结合剂是与以下靶蛋白（但不限于此）结合的 抗体： 细胞角蛋白： 上皮细胞的标记 全-钙黏蛋白： 细胞膜的标记 Na+K+ATP酶 细胞膜的标记 平滑肌肌动蛋白： 平滑肌细胞、肌成纤维细胞和肌上皮细胞 CD31 血管的标记 核糖体蛋白S6: 细胞质的标记 Glut 1 低氧的标记 Κ?67 增殖细胞的标记 胶原IV 基质 提供形态学信息的其它靶标还可包括角蛋白15、19、E-钙黏蛋白、Claudin 1、EPCAM、 纤连蛋白和波形蛋白。
[0098] 组织的内源荧光（自发荧光）可用于提供处于研宄中的样品中的额外的形态学信 息，包括但不限于红细胞、脂褐质颗粒和形成纤维性组织。
[0099] 作为实例，至少一种额外的结合剂可包括全-细胞角蛋白抗体（例如，在一个反应 中允许更大覆盖细胞角蛋白同种型的细胞角蛋白抗体合剂）。细胞角蛋白是细胞骨架的一 部分并位于上皮的细胞的细胞质中。因此，这些抗体使上皮细胞的细胞质染色。在肿瘤样 品中，这些抗体使肿瘤的上皮细胞、而不是基质或其它支持组织/区染色。因此，至少一种 额外的结合剂例如全-细胞角蛋白标记的使用允许选择肿瘤的上皮细胞区，用于进一步分 析。
[0100] 优选地，所述结合剂用荧光团标记。当检测超过一种靶标时，每种靶标的结合剂优 选用具有不同的发射波长的不同的荧光团标记，使得可以独立地检测信号并且基本上不会 重叠。还优选地，提供形态学信息的结合剂还用与其它结合剂不同的荧光团标记，使得它们 也具有不同的发射波长。
[0101] 为结合作用提供足够时间后，可将样品与洗涤溶液（例如合适的缓冲溶液）接触 以洗去任何未结合的探针。根据所用的探针浓度和种类，可将生物样品经过多个洗涤步骤， 用各步骤中使用相同或不同的洗涤溶液。
[0102] 在结合剂与靶蛋白和任选的形态学标记之间反应之后，所述样品进一步用提供额 外形态学信息的荧光标记染色。术语"荧光标记"是指使组织或其它生物样品的特定部分 例如某种亚细胞形态学选择性染色的荧光团。合适的荧光标记（以及它们的靶细胞、亚细 胞区室或细胞组分，如果合适的话）的实例可包括但不限于：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)(核酸）、伊红（碱性细胞组分、细胞质）、Hoechst 33258和Hoechst 33342 (两 种双苯酰亚胺）（核酸）、碘化丙啶（核酸）、奎纳克林（核酸）、荧光素-鬼笔环肽（肌动 蛋白纤维）、色霉素 A 3 (核酸）、吖啶黄-福尔根反应（核酸）、金胺0-福尔根反应（核 酸）、溴化乙锭（核酸）。尼氏染色（神经元）、高亲和力DNA荧光团例如P0P0、B0B0、YOYO 和TOTO和其它，和融合到DNA结合蛋白（例如组蛋白）的绿色荧光蛋白、ACMA和吖啶橙。 优选地，所述荧光标记使细胞核染色。更优选地，所述荧光标记包括4'，6-二脒基-2-苯基 吲哚（DAPI)。
[0103] 可用于生物样品的结合剂和荧光标记的总数可以取决于通过来自所用的荧光团 的光谱可分辨的荧光信号可得到的光谱分辨率。光谱可分辨的，对于多个荧光团，意指荧光 团的荧光发射波段是足以区分的，也就是说，足够的非重叠的，使得基于通过使用标准光检 测系统的各个荧光团所产生的荧光信号，可以区分各个荧光团。在某些实施方案中，在每轮 检测中通过检测系统，生物样品可以与10个或小于10个荧光团反应。在其它实施方案中， 在每轮检测中通过检测系统，生物样品可以与6个或小于6个荧光团反应。
[0104] 可使用检测系统，检测来自结合剂-标记的荧光团、荧光标记和样品的自发荧光 的信号。检测系统可包括荧光检测系统。在某些实施方案中，可检测信号强度、信号波长、 信号位置、信号频率或信号变化。在某些实施方案中，可以观察、测量和记录一种或多种前 述信号特征。在某些实施方案中，可使用荧光检测系统检测荧光波长或荧光强度。在某些 实施方案中，可在原位观察信号，也就是说，可以直接观察来自通过结合剂与生物样品中的 靶标结合的荧光团的信号。
[0105] 在某些实施方案中，观察信号可包括捕获生物样品的图像。在某些实施方案中，依 据本文公开的方法，与成像装置连接的显微镜可以用作检测系统。在某些实施方案中，可以 激发荧光团并且可以观察所得荧光信号并以数字信号（例如数字化图像）的形式进行记 录。对于在样品中结合的不同的荧光团，和对于样品的自发荧光，可以使用合适的荧光滤镜 重复同样的程序。
[0106] 有关荧光检测的方法和系统以及产生样品的第一图像的方法和系统的额外详情 在下文提供，标题为"图像采集和分析"。
[0107] 在某些实施方案中，在根据所检测的荧光信号产生生物样品的第一图像之后，改 变来自结合剂的荧光信号。然后，根据上述方法获得一个或多个额外图像。也就是说，每 个额外图像是通过以下产生：(a)使固体载体上的所述样品与不同靶蛋白的结合剂接触； (b)所述样品用提供额外的形态学信息的荧光标记来染色；（C)通过荧光检测来自所述结 合剂和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检测的荧光信号产生所述样品的图像。
[0108] 可将化学试剂施加到生物样品以改变荧光信号。在某些实施方案中，信号改变可 包括信号特征的一种或多种改变，例如，信号强度下降、信号峰的移位、共振频率的变化、或 切割（去除）信号发生体导致信号去除。这样的化学试剂是本领域技术人员已知的，例如 参见美国专利号7629125。
[0109] 在某些实施方案中，化学试剂可以呈溶液的形式，可使生物样品与化学试剂溶液 接触预定量的时间。化学试剂溶液的浓度和接触时间可取决于想要的信号改变的类型。在 某些实施方案中，可以选择化学试剂的接触条件，使得结合剂、靶标、生物样品以及结合剂 与靶标之间的结合可以不受影响。在某些实施方案中，化学试剂可以仅影响荧光团并且化 学试剂可以不影响靶标/结合剂结合或结合剂的完整性。因此举例来说，结合剂可包括第 一抗体或第一抗体/第二抗体的组合。化学试剂可以仅影响荧光团，并且第一抗体或第一 抗体/第二抗体的组合可以基本上不受影响。在某些实施方案中，在样品与化学试剂接触 之后，结合剂（例如第一抗体或第一抗体/第二抗体的组合）可以仍然结合到生物样品中 的靶标上。在某些实施方案中，在样品与化学试剂接触之后，结合剂可以仍然结合到生物样 品中的靶标上，并且结合剂的完整性可以仍然基本上不受影响（例如，在化学试剂存在时， 抗体可以基本上不变性或洗脱）。
[0110] 在某些实施方案中，所述样品与化学试剂接触之后可以观察信号的特征，以确定 信号改变的有效性。例如，在与化学试剂接触之前和与化学试剂接触之后可观察来自荧光 信号发生体的荧光强度。在某些实施方案中，信号强度下降预定量可指信号改变。在某些 实施方案中，信号的改变可指信号强度下降量范围大于大约50%。在某些实施方案中，信号 的改变可指信号强度下降量范围大于大约60%。在某些实施方案中，信号的改变可指信号强 度下降量范围大于大约80%。在某些实施方案中，信号改变可通过氧化、剥离（stripping)、 光褪色或其混合而完成。在一个优选的实施方案中，所述化学试剂选自氢氧化钠、过氧化氢 或高碘酸钠。在另一个实施方案中，信号改变可通过使样品与光和/或化学试剂接触而完 成，更充分描述于2011年12月23日申请的标题为"PHOTOACTIVATED CHEMICAL BLEACHING OF DYES FOR USE IN SEQUENTIAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES (染料的光活化化学 褪色，用于生物样品的序贯分析）"的美国专利申请序列号13/336409,其通过引用以其整 体结合到本文中。
[0111] 产牛牛物样品的第二图像 在本发明的某些实施方案中，所述方法包括产生所述生物样品的第二图像的步骤。获 得第一图像之后产生第二图像。第二图像通过如下产生：(a)使所述样品与至少一种靶核 酸序列的每一个的探针接触因此使所述探针与所述核酸序列杂交；(b)任选地，所述样品 使用用于产生第一图像的所述荧光标记来染色；(c)通过荧光检测来自所述靶核酸序列的 每一个的探针和所述荧光标记的信号；和（d)根据所检测的一种或多种荧光信号产生所 述样品的第二图像。
[0112] 在某些实施方案中，在产生第二图像的步骤之前，所述方法包括用蛋白酶消化所 述样品。蛋白酶消化对肽结合的破坏直接影响信号质量，因为它使探针容易接近靶核酸并 减少完整蛋白所产生的自发荧光。蛋白酶消化还用于从一种或多种靶蛋白上去除结合剂和 因此除去第一图像相关的免疫荧光信号。用于蛋白酶消化的示例性的蛋白酶是丝氨酸蛋白 酶，例如蛋白酶K。另一示例性的蛋白酶是羧基蛋白酶，例如胃蛋白酶。
[0113] 在某些实施方案中，在得到第一图像之后和产生第二图像的步骤之前，所述方法 包括改变来自第一结合剂的荧光信号。在某些实施方案中，信号改变可通过氧化、剥离、光 褪色或其混合而完成。在一个优选的实施方案中，所述化学试剂选自氢氧化钠、过氧化氢或 高碘酸钠。
[0114] 所述靶核酸序列和所述探针详述如上。优选地，所述探针是荧光标记的。
[0115] 在某些实施方案中，所述靶核酸序列包含染色体水平上的基因组变化。在某些实 施方案中，所述基因组变化是染色体异常。示例性的染色体异常包括染色体易位、染色体缺 失、染色体插入和染色体倒位、以及基因扩增事件。在其它实施方案中，所述靶核酸序列包 含在单个基因水平上的基因组变化，例如单核苷酸多态性、小缺失、插入、以及点突变。
[0116] 在某些实施方案中，所述探针杂交到生物样品中的靶核酸序列的互补链。探针和 靶核酸序列在合适的杂交条件下可以形成杂合体。杂交领域普通技术人员将会知道常用于 利用或控制杂交严格性的因素，包括甲酰胺浓度（或其它化学变性剂）、盐浓度（即离子强 度）、杂交温度、去垢剂浓度、PH和离液剂的存在或不存在。封闭探针也可用作手段以改进 辨别力，超过仅通过严格性因素的优化而可能达到的限制。可通过众所周知的技术找到形 成杂交组合的最佳严格性，所述技术是固定若干前述严格性因素，然后确定改变单一严格 性因素的作用。可以调整相同的严格性因素，从而控制PNA或LNA与核酸杂交的严格性，除 了 PNA杂交是完全独立于离子强度之外。用于测定的优化的或合适的严格性可以经实验确 定，即通过检查每个严格性因素，直到达到所需的辨别力程度。
[0117] 检测核酸序列的方法例如杂交是众所周知的。在某些实施方案中，通过FISH (或 FISH的变体例如IQ-FISH)、聚合酶链式反应（PCR)(或PCR的变体例如原位PCR)、RCA (滚 环扩增）或PRINS (引物原位标记）检测特定核酸序列。在示例性的实施方案中，通过FISH 检测特定核酸序列。因此，使生物样品中的靶核酸序列变性和与变性的荧光标记的探针原 位杂交。在某些优选的实施方案中，当通过FISH分析靶核酸序列时，使用染色体特异性探 针，例如对于所述染色体的着丝粒探针，以及对于靶核酸序列的探针。来自染色体特异性探 针的信号显示靶核酸序列是否在所述染色体上。优选地，染色体特异性探针用荧光团标记， 其产生不同于靶核酸序列的探针的信号。
[0118] 杂交反应之后，所述样品任选用提供额外的形态学信息荧光标记来染色。所述荧 光标记与获得第一图像所用的荧光标记优选是相同的。或者，所述荧光标记是不同的，但染 色与用于获得第一图像相同的亚细胞区室。在某些实施方案中，来自第一图像的染色的荧 光信号被充分保留，所以该步骤是任选的。在其它实施方案中，来自第一图像的染色的荧光 信号已经褪色并且所述样品按本文所提供的那样被染色。
[0119] 在某些实施方案中，优选所述荧光标记使细胞核染色。因此染色有助于聚焦FISH 信号。通过获得聚焦的核，可通过成像聚焦的核上下的若干焦平面捕捉FISH信号。染色还 有助于统计FISH信号。因为FISH信号可能是分散在核中，所以使用单一焦平面进行点计 数可导致遗漏的计数。然而，通过捕获每个视野内的若干Z-堆栈，提供更多数据以尽可能 接近地产生细胞核的三维视野。因此提供的是统计FISH信号的更准确的方法。
[0120] 用染色相同的亚细胞区室的相同的一种或多种荧光标记使生物样品染色，还用于 提供用于重叠第一图像和第二图像的参考点。因此，它有助于产生合成图像。第一和第二 图像重叠的有关详情，参见以下部分"图像采集和分析"。
[0121] 在一个优选的实施方案中，所述生物样品是FFPE组织样品，第一结合剂是HER2的 抗体，任选的一种或多种额外的结合剂是全-细胞角蛋白抗体合剂，所述荧光标记是DAPI， 所述靶核酸序列是HER2。
[0122] 使用如上所述的检测系统可检测来自探针-标记的荧光团和荧光标记的信号。荧 光检测的方法和系统以及产生样品的第二图像的方法和系统的有关额外详情在下文提供， 标题为"图像采集和分析"。
[0123] 在某些实施方案中，在根据所检测的荧光信号产生生物样品的第二图像之后，通 过例如氧化、剥离、光褪色或其混合，改变来自所述靶核酸序列的每一个的探针的荧光信 号。然后，按照本文的上述方法获得一个或多个额外图像。也就是说，每个额外图像通过以 下产生：（1)使所述样品与至少一种额外的靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所述探 针与所述序列杂交；(2)任选地，所述样品用所述荧光标记来染色；（3)通过荧光检测来 自额外的序列的每一个的探针和所述荧光标记的信号；和（4)根据所检测的荧光信号产 生所述样品的图像。
[0124] 图像采集和分析 在某些实施方案中，提供单个生物样品的图像的方法包括产生所述生物样品的第一图 像和产生所述生物样品的第二图像。这些第一和第二图像通过以下产生：（1)荧光检测来 自所述生物样品的信号，和（2)分别根据所检测的荧光信号产生所述样品的第一和第二图 像。优选使用荧光显微镜进行这些步骤并对接触和染色步骤中所用的每种荧光团重复这些 步骤。因此，激发每种荧光团并使用标准仪器例如CCD相机或荧光扫描器在其波长处测量 其荧光发射。任选地，还测量生物样品的自发荧光并且考虑其对某些荧光团测量的影响。例 如，算法可用于扣除一个或多个发射波长的背景自发荧光。
[0125] 在某些实施方案中，以高分辨率同时得到全部生物样品的第一图像和第二图 像。因此，在其发射波长，以高分辨率测定来自每个荧光团的发射。对于高分辨率，是指在 20X-100X的分辨率获得图像，其对应于数值孔径0. 5-1. 4,支持像素尺寸为75-375 nm。优 选地，在40X获得图像，数值孔径为大约0. 85和像素尺寸为大约170 nm。在40X的图像捕 获是优选的，因为分辨率足够高以捕获FISH信号，同时捕获与60x或IOOx相比相对大的 FOV' S0
[0126] 在其它实施方案中，所述生物样品可能不占据固体载体的全部表面，或整个生物 样品的高分辨率图像可能并非必要。因此，在获得第一图像时，所述固体载体的整个表面可 以先在低分辨率例如在2X进行扫描。然后将图像分析算法用于低分辨率图像和测定含有 生物样品的区域。捕获标记生物样品边界的坐标并用于指导后续的更高分辨率扫描。对来 自一个荧光团的发射的测量可能足以获得样品边界的坐标。
[0127] 因此，含有生物样品的区域可通过计算机实现的方法而检测，包括：使用至少一个 处理器获得所述生物样品的图像；使用（a)最大后验边际概率（MPM)方法和马尔可夫随机 场（MRF)，或者（b)最大后验（MAP)估计和马尔可夫随机场（MRF)，用所述处理器将所述图 像分割为多个区域；和将多个区域分为背景区和组织区以形成二元掩模（binary mask)。所 述方法hai可包括将主动轮廓方法用于二元掩模以精制生物样品边界。
[0128] 在再其它的实施方案中，整个生物样品的更高分辨率图像可能并非必要。然而，仅 对于样品所选择的目标区（regions of interest，ROI)而言需要更高分辨率图像。因此， 在产生第一图像时，使生物样品先以能够ROI选择的较低分辨率（例如与更高分辨率相比 为在10X)成像。任选地，在较低分辨率的成像包括对在接触和染色步骤中使用的每种荧光 团扫描。可根据预定标准（例如样品完整性、表型例如肿瘤或正常、肌肉或管组织等）选择 一个或多个ROI。在某些实施方案中，至少部分地根据自第一结合剂所测的一种或多种靶蛋 白的蛋白表达水平而选择ROI。因此，对于与第一阈值相比的较低靶蛋白表达水平，可选择 某些R0I，而由于与第二阈值（其可以不同于第一阈值）相比的更高蛋白表达水平，可选择 其它ROI。ROI的坐标用于将更高分辨率扫描引导到仅R0I。在某些实施方案中，以与对于 ROI的第一图像而获得图像相同的更高分辨率获得仅对于ROI的第二图像。
[0129] 如上所述，在某些实施方案中，首先将初始图像（即较低分辨率图像）转化为一个 或多个明场型图像，其类似于明场染色方案。因此，初始荧光图像数据可用于经由算法而产 生模拟的（虚拟的/分子的）苏木精和伊红（H&E)图像。或者，经由类似算法可以产生模 拟的（虚拟的/分子的）3, 3'-二氨基联苯胺（DAB)图像。将荧光图像数据转化为明场型 图像的详细方法描述于下文。然后至少部分地根据形态学信息，将明场型图像用于目标区 的选择。
[0130] 在某些实施方案中，因为显微镜视野（field of view，F0V)的局限，用一次扫描可 能无法获得全部生物样品或样品内所选ROI的图像。也就是说，有待成像的区域可能大于 显微镜FOV可以捕获的区域。在这类情况下，所需图像可通过捕获跨越玻片或所选的ROI 的多个FOV而获得。FOV的这些原始图像经校正以为视场改变作出调整，并且随后可以根据 算法拼接在一起，所述算法将单个FOV排列成整个玻片或ROI的单幅图像。这样的图像拼 接算法是本领域技术人员众所周知的，参见美国专利号6, 674, 884。单色相机常用于荧光成 像，因其具有更高灵敏度以及通过使用合适的激发和发射滤镜和双色镜而捕获预定的波长 的能力。因此，产生单个通道的灰度图像。各荧光通道的灰度数字图像可以是伪彩色的并 经合并而填充所需图像。
[0131] 在一个优选的实施方案中，产生第一图像包括（1)任选地产生整个固体载体的较 低分辨率图像和将所述样品放在所述固体载体上；(2)产生所述样品的中等分辨率图像； (3)根据预定标准识别目标区（ROI);和对于每个ROI产生更高分辨率图像。所产生的第 二图像是在第一图像产生期间所选的每个ROI的较高分辨率图像。在这些实施方案中，术 语较低、中等和较高不限于某些放大倍数。而是，它们彼此相对。在最优选的实施方案中， 低分辨率图像是2X图像；中等分辨率图像是IOX图像，高分辨率图像是40X图像。
[0132] 在某些实施方案中，通过计算机辅助方式将图像增强至更清楚表明靶蛋白或靶核 酸的特征可能是合乎需要的。因此，一个实例创建RGB颜色混合热图（heatmap)图像，其中 将靶蛋白表达水平映射到参考颜色查询表。该查询表的一个实例将低水平强度映射到蓝色 阴影，将中等强度映射到黄色阴影，高强度映射到红色阴影，以便更容易地鉴定具有不同染 色强度水平的区域。在另一实例中，对第一图像创建颜色混合的合成图像，以更好地显示靶 蛋白、形态学结合剂以及所述荧光标记之间的空间关系。例如，靶蛋白结合剂被染成黄色和 形态学结合剂被染成蓝色，因此其中靶蛋白在形态学结合剂标记区中表达的区域，染色将 出现绿色，以便容易和特异性地鉴定。在再一实例中，可以创建特定荧光团通道的伪彩色图 像。例如目标基因的FISH信号染为红色和相同染色体的另一区域染为绿色，使得在给定细 胞或组织区中容易区分两类信号的相对量。
[0133] 在某些实施方案中，优选至少部分地根据来自荧光标记所测的信号的某些图像， 将第一和第二图像排列。优选地，将第一和第二图像重叠并进一步创建合成图像。合成图 像允许在细胞-细胞基础上直接比较得自第一图像和第二图像的结果。
[0134] 合成图像可不包括第一或第二图像的全部图像，或在第一图像或第二图像的产生 中所获得的全部信号。得自荧光标记的图像可含有任何形态学信息，和可包括生物样品的 特定亚细胞组分例如细胞核的图像。因此，算法获得来自第一和第二图像中的形态学信息 (例如亚细胞组分）的坐标，并使用这些坐标以排列第一和第二图像。在一个优选的实施方 案中，用于排列图像的形态学信息是在细胞水平上。在更优选的实施方案中，用于排列图像 的形态学信息是亚细胞水平上。在最优选的实施方案中，用于排列图像的形态学信息来自 细胞核的荧光信号。
[0135] 合成图像可不包括第一或第二图像的全部，或在第一图像或第二图像的产生中所 获得的全部信号。因为玻片位置和显微镜镜台的移动，第二图像相对于第一图像可旋转或 平移，并且该旋转和平移必须被校正，以便在产生合成图像之前排列或登记这两个图像。
[0136] 为了登记图像，在第一图像和第二图像中优选使用相同的形态学标记。这类标记 的一个实例是DAPI，其标记细胞核并在随后的漂白、染色和其它处理期间停留在样品中。 得自所述荧光标记的图像提供了在两个图像中的有关特定亚细胞区室的形态学信息，并且 所述亚细胞区室的相对位置在两个图像中基本上保持不变。因此，算法可以使用该空间信 息以建立第一图像和第二图像之间的坐标变换，即通过（a)计算这两个图像的傅里叶变 换；(b)将振幅分量傅里叶变换转换为对数极坐标，创建这两个图像的每一个的平移不变 标记；（c)将第二傅里叶变换用于这两个标记；（d)计算这两个标记之间的相关函数；（e) 对所述相关函数作反傅里叶变换，解决这两个图像间的旋转和缩放；（f)将旋转和缩放用 于第二图像，使得这两个图像都被同等地旋转和缩放；（g)计算同等缩放的图像间的交叉 乘方（cross-power)相关函数；和（h)对交叉乘方相关作反傅里叶变换，得到第一和第二 图像间的平移。然后将平移、旋转和缩放用于产生同等排列的（登记的）图像，用于合成。 交叉乘方相关优选是常规积-矩相关，因为它对两个图像间的强度差异和对跨越显微镜视 野的缓慢变化的强度差异不敏感。
[0137] 在某些实施方案中，第一和第二图像以及所创建的任何合成图像用于表征靶蛋白 的表达以及靶核酸序列。因此，可以通过将信号强度值（例如荧光强度）与生物样品中的靶 标量关联而分析蛋白表达水平。可使用标定标准确定靶标量和信号强度间的关系。在某些 实施方案中，可使用一种或多种对照样品。通过观察样品（目标生物样品与对照）中的信 号的存在或不存在，可以获得生物样品的相关信息。例如通过将患病的组织样品与正常组 织样品比较，可以获得患病的组织样品中存在的靶标的相关信息。同样，通过比较样品（即 目标样品和一种或多种对照）间的信号强度，可以获得样品中的靶标表达的相关信息。
[0138] 可以通过靶核酸序列的存在、不存在、表达或扩增水平对其进行分析。对于目标 DNA序列的分析，所述分析可集中在细胞核内的信号上。因此，当目标DNA序列通过FISH而 检测时，优选首先分别分割一些细胞核，至少部分地根据得自所述荧光标记的图像（例如 DAPI染色）。在每个核内，对靶核酸序列的FISH点和任选相应的染色体的FISH点（自染 色体特异性探针）进行定位。进一步分析FISH点。例如，计算所述点的比例，以评价靶基 因扩增或重排状态。
[0139] 可以进一步比较蛋白表达数据和核酸分析数据以提供合并数据集。
[0140] 本文公开的方法可以在生物学和医学中在分析、诊断和治疗应用中找到用途。根 据本文所述的方法，可将对患者的细胞或组织样品的分析用于诊断（例如，识别患有特定 疾病、暴露给特定毒素或对特定治疗或器官移植反应良好的患者）和预后（例如，识别可能 发展特定疾病、对特定治疗反应良好或可接受特定器官移植的患者）。本文公开的方法可以 便于准确和可靠地分析来自同一生物样品的多个靶标（例如疾病标记）。
[0141] 在某些实施方案中，将第一和/或第二荧光图像转化为明场型图像，其类似于明 场染色方案。因此，从提供形态学信息的一种或多种额外的结合剂、荧光标记以及生物样品 的任何自发荧光中检测到的荧光信号，可用于经由算法产生模拟的（虚拟的/分子的）苏 木精和伊红（H&E)图像。或者，模拟的（虚拟的/分子的）3, 3'-二氨基联苯胺（DAB)图 像可经由类似算法而产生。在某些实施方案中，所述虚拟H&E图像包括来自荧光标记（例 如DAPI)、提供额外的形态学信息的至少一种额外的结合剂（例如抗全细胞角蛋白抗体）和 自发荧光的信号。在某些实施方案中，所述虚拟DAB图像包括来自荧光标记和靶蛋白的结 合剂（抗HER2抗体）的信号。
[0142] 将荧光图像转化为伪明场图像的方法是已知的。也已知的是根据荧光图像创建明 场图像的方法，其中鉴定了生物样品的结构特征和详情，如同直接根据指定的明场染色方 案获得图像一样。美国专利申请12/569396。在本发明的某些实施方案中，使用类似于生 物样品的明场染色方案的产生明场型图像的改进方法，如更充分描述于K. Kenny的标题为 αSYSTEM AND METHODS FOR GENERATING A BRIGHTFIELD IMAGE USING FLUORESCENT IMAGES (使用荧光图像产生明场图像的系统和方法）"和2011年8月7日申请的美国专利申请序 列号13/211725,其通过引用以其整体结合到本文中。所述方法涉及使用自生物样品的明场 图像获得的或使用预选或所需的颜色定义的标定函数。可由操作员选择预选的或所需的颜 色，所述操作员可以是熟悉标准生物染色方案的病理学家或显微镜工作者。标定函数使用 称为"消光系数"的3个参数a[红色]、a[绿色]、a[蓝色]，评价将荧光图像映射到明场 色空间的强度变换。
[0143] 可通过制备用可见染料例如苏木精、伊红或二氨基联苯胺（DAB)标记的在目标生 物标记中具有宽范围染色强度的一种或多种生物标本，得到评价的参数。然后，所述样品可 在明场中成像，并且可以计算红色、绿色和蓝色像素强度水平的分布；将像素强度水平标准 化至区间[0，1]。识别具有最小平均值（log强度）的颜色。不失一般性，可以假定一种特 定颜色。例如，如果颜色是绿色，则计算（log红色/log绿色）和（log蓝色/log绿色）的 平均值，和3个值（平均[log红色/log绿色]、1、平均[log蓝色/ log绿色])用作消 光系数。
[0144] 或者，可以得到消光系数，不用参考真实明场染料。而是，设计者可以选择应该用 于中等强度染色的颜色。如果该颜色在线性颜色模型中是（R，G，B)，其中通道R、G和B被 标准化至区间[0, 1]，则消光系数是简单的（log R，log G，log B)。该方法允许所述方法 使用自然界中不存在的染料模拟明场染色。
[0145] 然后可通过以下两种方法建立焚光图像中的点的对应（correspondence):基于 强度和基于特征的方法。
[0146] 在基于特征的方法中，对于荧光图像和明场图像二者，可以得到核、上皮、基质或 任何类型的胞外基质材料的图像。可使用手工处理或自动化选择基于特征的结构。在来自 这两种形式的图像中选择相应的结构。对于荧光图像，可使用具有调准到给定的生物标记 的合适激发能源并具有合适收集发射光的滤镜的荧光显微镜来捕获图像。然后可获得样品 的明场图像，随后可将其分割为红色（R)、绿色（G)和蓝色（B)通道并测定基于特征的结构 的颜色和强度。
[0147] 在基于强度的方法中，可用电、磁、光或机械传感器控制显微镜下的样品区的位 置，使得样品区可被重复定位于接近相同位置，用于下个图像采集。基于强度的登记通常可 用于广泛类型的生物标记。通常，被固定或以其它方式在基质（例如但不限于TMA、玻片、孔 或栅格）上提供的生物样品，用分子生物标记来标记，并通过荧光显微镜成像。
[0148] 在基于强度的方法或基于特征的方法中，从荧光图像向明场色空间的变换使用非 线性变换方程中估计的映射参数。非线性变换方程可使用红色、绿色、蓝色值或色空间（R， G，B)来表示，并且变换可表示为下式： R = 255 exp (- a[Dyel]*z[Dyel] - a[Dye2]z[Dye2]-...) G = 255 exp (- b [Dyel]*z[Dyel] - b [Dye2]z [Dye2]-...) B = 255 exp (- c [Dyel]*z [Dyel] - c [Dye2]z [Dye2]-...) 在式中，标量z[Dyel]，z[Dye2]，...是在给定像素位置上观察到的荧光染料数量。 3个值（a[Dyen], b[Dyen], c[Dyen])是乘以在使用预选的或所需的颜色所定义的虚拟染 色中的第η个染料的消光系数的常数。选择该常数，使得输出颜色值（R，G，B)显示图像 中的对比的可读范围。R、G和B是在明场型图像中的所得的红色、绿色和蓝色像素值；ζ是 在给定像素位置上观察到的荧光染料数量的缩放系数；和a、b和c是对应于明场色空间的 消光系数；和其中3个值a[Dyen]、b [Dyen]、c [Dyen]，是乘以在使用预选的或所需的颜色所 定义的虚拟染色中的第η个染料的消光系数的常数。
[0149] 优选地，对于ζ [Dyel]，ζ [Dye2]，...找到0. 995分位数，并选择常数，使得： min (exp (-a[Dyen]*z[Dyen]), exp (~b[Dyen]*z[Dyen]), exp(~c[Dyen]*z[Dyen]))= 1/255。
[0150] 这导致输出颜色的动态范围几乎填充8位图像的可能的动态范围，并产生强烈对 比。
[0151] 在其合成后，锐化变换可用于虚拟染色图像。在一个实施方案中，所述锐化变换可 作为线性卷积过滤而执行，其内核是矩阵：
【权利要求】
1. 提供单个生物样品的合成图像的方法，包括以下步骤： (1) 产生所述生物样品的第一图像，包括以下步骤： a. 使固体载体上的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触； b. 所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染色； c. 通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的信号； d. 根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像；和然后 (2) 产生所述生物样品的第二图像，包括以下步骤： a. 使来自步骤（1)的同一样品与至少一种靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所 述探针与所述靶核酸序列杂交； b. 任选地，所述样品用所述荧光标记来染色； c. 通过荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的探针和所述荧光标记的信号；和 d. 根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第二图像；和 (3) 产生提供所述靶蛋白和所述靶核酸的相对位置的合成图像。
2. 权利要求1的方法，其中所述合成图像的产生包括使用在第一图像的产生和第二图 像的产生中所得的信号信息以产生所述合成图像。
3. 权利要求1的方法，其中所述合成图像的产生包括登记来自步骤1中所得的荧光标 记的信号位置以及来自步骤2中所得的荧光标记的信号位置。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤（I) (d)包括： (i) 根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的初始图像；和 (ii) 根据所述初始图像选择目标区，和通过荧光检测来自至少第一结合剂和所述荧光 标记的信号，以比所述初始图像更高的分辨率产生第一图像。
5. 权利要求4的方法，其中通过合并来自更高分辨率图像和第二图像的信号信息而产 生所述合成图像。
6. 权利要求4-5中任一项的方法，包括登记来自更高分辨率图像中的荧光标记的信号 位置以及来自第二图像中的荧光标记的信号位置。
7. 前述权利要求中任一项的方法，其中在产生第一图像中的检测步骤或在产生第二图 像中的检测步骤进一步包括检测所述生物样品的自发荧光。
8. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述合成图像的产生包括登记来自步骤1中所 得的荧光标记的信号位置以及来自步骤2中所得的荧光标记的信号位置。
9. 前述权利要求中任一项的方法，其中产生第一图像的步骤进一步包括：在产生所述 样品的图像之前，产生全部固体载体的较低分辨率图像和将所述样品放在所述固体载体 上。
10. 前述权利要求中任一项的方法，其中产生第一图像和/或产生第二图像包括产生 明场型图像，其类似于明场染色。
11. 权利要求11的方法，其中所述明场型图像类似于模拟的H&E图像。
12. 权利要求11的方法，其中所述明场型图像类似于模拟的DAB图像。
13. 权利要求10-12中任一项的方法，其中至少部分地根据来自第一图像的明场型图 像的形态学信息而选择目标区。
14. 前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在接触步骤（I) (a)之前的抗原恢复步 骤。
15. 前述权利要求中任一项的方法，在步骤（I) (a)中进一步包括第一结合剂与所述靶 蛋白的物理结合。
16. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述结合剂是对所述靶蛋白具有特异性的抗 体。
17. 权利要求16的方法，其中所述抗体用荧光团标记。
18. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述革巴蛋白选自细胞角蛋白、cyclin Dl、 cyclin Bl、Ki67、ER、AR、PI3K、cMET、EGFR、cMyc、PTEN、MAPK、EGFR 和 HER2。
19. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（I) (a)中，使所述样品还与提供额外 的形态学信息的至少一种额外的结合剂接触；和在步骤（I) (c)中，还通过荧光检测来自至 少一种额外的结合剂的信号。
20. 权利要求19的方法，其中所述至少一种额外的结合剂包括针对以下的抗体：角蛋 白 15、19、E-钙黏蛋白、Na+K+ATP 酶、Claudin 1、胶原 IV、EPCAM、纤连蛋白、glut 1、SMA、波 形蛋白、平滑肌肌动蛋白、CD31和全-细胞角蛋白。
21. 权利要求19的方法，其中所述额外的形态学信息包括组织来源、细胞来源、肿瘤、 正常区和基质区、细胞类型和亚细胞结构例如细胞膜、细胞质、细胞核。
22. 权利要求19的方法，其中所述额外形态学信息包括上皮起源的细胞的细胞质位置 的有关?目息。
23. 权利要求19-22中任一项的方法，在步骤（I) (a)中进一步包括第一结合剂与所 述蛋白的物理结合，以及至少一种额外的结合剂与位于所述样品的特定区室内的蛋白的结 合。
24. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述荧光标记包括4'，6-二脒基-2-苯基吲 哚（DAPI)、伊红、Hoechst 33258和Hoechst 33342 (两种双苯酰亚胺）、碘化丙啶、奎纳克 林、荧光素-鬼笔环肽、色霉素 A 3、吖啶黄-福尔根反应、金胺0-福尔根反应和溴化乙锭。
25. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述荧光标记使细胞核染色。
26. 前述权利要求中任一项的方法，进一步包括在步骤（2) (a)之前用蛋白酶消化所述 样品。
27. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（2) (a)中，所述杂交反应选自FISH、 IQ-FISH、原位PCR、滚环扩增和引物原位标记。
28. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述杂交反应是FISH，和所述反应进一步包 括识别目标核酸序列所在的染色体的每一条的探针。
29. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针包括核酸探针、肽核酸探针、锁核酸 探针、mRNA探针、miRNA探针或siRNA探针。
30. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述探针被荧光标记。
31. 前述权利要求中任一项的方法，其中所述靶核酸包括以下的核酸序列：EGFR、 T0P2A、cMyc、ALK、FGFRl 和 HER2。
32. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（I) (d)之后，来自第一结合剂的荧光 信号被改变。
33. 权利要求32的方法，其中所述荧光信号通过化学试剂而改变。
34. 权利要求32的方法，其中步骤（I) (a)至（I) (d)用针对不同蛋白的另一结合剂来 重复进行。
35. 前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤（2) (d)之后，来自所述探针的荧光信 号通过氧化、剥离、光褪色或其混合而改变，和步骤（2) (a)至（2) (d)用针对额外的目标核 酸序列的探针来重复进行。
36. 分析生物样品的方法，包括提供权利要求1的生物样品的合成图像，和根据所述合 成图像分析蛋白表达和目标核酸序列。
37. 权利要求36的方法，其中所述样品包括细胞或组织样品。
38. 权利要求36-37中任一项的方法，其中所述样品包括福尔马林固定的、石蜡包埋的 (FFPE)组织样品。
39. 权利要求36-38中任一项的方法，其中在步骤（I) (a)中，使所述样品还与提供额外 的形态学信息的至少一种额外的结合剂接触；和在步骤（I) (c)中，还通过荧光检测来自至 少一种额外的结合剂的信号。
40. 权利要求36-39中任一项的方法，进一步包括通过将来自第一结合剂的荧光信号 映射到参考颜色查询表，创建靶蛋白表达水平的RGB颜色混合热图图像。
41. 权利要求39的方法，进一步包括对于第一图像创建颜色混合的合成图像，所述合 成图像包括所述靶蛋白、至少一种额外的结合剂所代表的形态学信息和所述荧光标记的图 像。
42. 权利要求36-41中任一项的方法，其中所述样品是FFPE组织样品，第一结合剂是 HER2的抗体，一种或多种额外的结合剂是全-细胞角蛋白抗体合剂，所述荧光标记是DAPI， 所述目标核酸序列是HER2。
43. 试剂盒，包括用于在同一生物样品上荧光检测蛋白以及荧光检测靶核酸序列的组 分。
44. 系统，包括用于在同一生物样品上进行荧光检测蛋白以及靶核酸序列的工具。
45. 产生单个生物样品的第一和第二图像的方法，包括以下步骤： (1) 产生所述生物样品的第一图像，包括以下步骤： a. 使固体载体上的所述样品与靶蛋白的第一结合剂接触； b. 所述样品用提供形态学信息的荧光标记来染色； c. 通过荧光检测来自第一结合剂和所述荧光标记的信号； d. 根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第一图像；和然后 (2) 产生所述生物样品的第二图像，包括以下步骤： a. 使来自步骤（1)的同一样品与至少一种靶核酸序列的每一个的探针接触因此使所 述探针与所述靶核酸序列杂交； b. 任选地，所述样品用所述荧光标记来染色； c. 通过荧光检测来自所述靶核酸序列的每一个的探针和所述荧光标记的信号；和 d. 根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的第二图像。
46. 权利要求45的方法，其中产生第一图像包括，在通过荧光检测来自第一结合剂和 所述荧光标记的信号后， (i)根据所检测的荧光信号产生所述样品的至少部分的初始图像；和 (i i)根据所述初始图像选择目标区，和通过荧光检测来自至少第一结合剂和所述荧光 标记的信号，以比所述初始图像更高的分辨率产生第一图像。
【文档编号】G01N33/574GK104520713SQ201380017702
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年3月21日 优先权日:2012年3月30日
【发明者】E. 塞波 A., 金蒂 F., B. 肯尼 K., L. 亨德森 D., J. 格德斯 M., I. 拉里拉莫雷诺 A., 刘 X., D. 科文 A., E. 青格列维奇 S., 哈 T., R. 军 N., 基什图巴耶夫 A., A. 霍尔曼－休格利 D., 李 Y. 申请人:克拉里安特诊断服务公司