利用qcm传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片的制作方法
【专利摘要】本发明公开了利用QCM传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片。本发明提供了一种制备用于检测病毒的QCM金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片；2）将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的QCM金片。本发明的实验证明，本发明利用石英晶体微天平生物传感器对MCMV的检测进行了研究，通过对两种修饰金片方法11-MUA单独修饰QCM金片和3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片作比较，分析3-MPA和11-MUA共同修饰QCM金片检测灵敏度高、特异性好，且能应用于实际检测的方法。
【专利说明】利用QCM传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种利用QCM传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片。
【背景技术】
[0002]玉米裡绿斑驳病毒(Maziechlorotic mottle virus, MMCMV)是正单链 RNA,其为直径30nm 二十面体，它属于玉米褪绿斑驳病毒属，番茄丛矮病毒科的一员。它严重危害小麦、大麦、高粱、燕麦等多达15-19种禾本科植物的生长。玉米褪绿斑驳病毒广泛分布于阿根延、美国等欧美国家以及非洲的5个国家，由于其分布广泛，传入我国的的风险逐步加大。如果田间发现有病植株后，其可经昆虫介体、种子携带等方式快速传播，诱发大面积玉米发病，玉米叶片会出现褪绿斑驳等症状，从而导致严重的经济损失。
[0003]现阶段玉米褪绿斑驳病毒的主要检测方法有ELISA、实时荧光RT-PCR等。这些传统的方法在检测MMCMV时都有一定的缺陷，ELISA操作复杂，耗时长，检测结果受到实验用品、操作过程等影响；实时荧光RT-PCR易产生污染影响实验结果。随着技术的发展，石英晶体微天平(Quartz Crystal Microbalance, QCM)以其无标记、高灵敏度且快速的优点作为生物传感器越来越多的应用于疫病的检测中。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种制备用于检测病毒的QCM金片的方法。
[0005]本发明提供的方法，包括如下步骤:
[0006]1)用巯基^ 酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片,得到修饰后金片；
[0007]2)将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的QCM金片。
[0008]上述方法中，QCM金片为单侧镀金片，12_X20mm,单侧镀金50nm, BioNavis公司，货号 QSX301-AU-13052。
[0009]步骤I)中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备:将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中；
[0010]步骤I)中，所述浸泡为4°C浸泡12h ；
[0011]步骤2)中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过酰胺键连接。
[0012]上述方法中，
[0013]步骤I)中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:1-1:10，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比具体为1:1、1:5或1:10。
[0014]上述方法中，
[0015]所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:10。
[0016]上述方法中，[0017]所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9mM ；
[0018]所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9mM。
[0019]上述方法中，
[0020]步骤2)中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片按照如下方法制备:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修饰后金片表面的巯基十一酸和3-巯基丙酸的羧基基团；再滴加所述抗病毒抗体，以固定抗体；再将BSA封闭，得到用于检测所述病毒的QCM金片;
[0021]步骤2)中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片具体按照如下方法制备:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液滴于所述修饰后金片表面，常温(25°C)下静置2小时；再滴加所述抗病毒抗体，37°C反应3小时；再滴加浓度为lmg/mL BSA，25°C下静置I小时，得到用于检测所述病毒的QCM金片；
[0022]含有EDC (N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亚胺)和Sulfo-NHS (N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的溶液:用分析天平称取一定量的EDC和Sulfo-NHS溶于100 μ L MES溶液，振荡均匀，使EDC在溶液中的浓度为表2所示，NHS在溶液中的浓度为表2所示。现用现配。
[0023]MES (脂肪酸甲酯磺酸盐)溶液:称取3.90g MES溶于180mLddH20，调节pH至5.0，定容至Ij 200mL。
[0024]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比为4_5:1 ;
[0025]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比具体为5:1。
[0026]上述方法中，
[0027]所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的终浓度为0.075M,且Sulfo-NHS的终浓度为0.015M。
[0028]上述方法中，
[0029]所述抗病毒抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述抗病毒抗体具体为单克隆抗体；
[0030]所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
[0031]由上述的方法制备的用于检测病毒的QCM金片；所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
[0032]上述的用于检测病毒的QCM金片在检测病毒中的应用；所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
[0033]本发明的实验证明，本发明利用石英晶体微天平生物传感器对MCMV的检测进行了研究，通过对两种修饰金片方法Il-MUA单独修饰QCM金片和3-MPA和Il-MUA共同修饰QCM金片作比较，分析3-MPA和Il-MUA共同修饰QCM金片检测灵敏度高、特异性好，且能应用于实际检测的方法。另外，Il-MUA价格为7670.52RMB/g,而3-MPA则只需花1.6RMB/g。显然3-MPA和Il-MUA共修饰的QCM金片成本更低。因此该方法制备的金片为MCMV及感染MCMV的植物样品的检测提供了新的、高效的检测技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为I1-MUA修饰的QCM金片的灵敏度
[0035]图2为11-MUA修饰的QCM金片检测MCMV特异性[0036]图3为I1-MUA修饰的QCM金片对植物样品的检测
[0037]图4为3-MPA和11-MUA体积比
[0038]图5为I1-MUA和3-MPA共修饰QCM金片金片检测MCMV的灵敏度
[0039]图6为3-MPA和I1-MUA共修饰的QCM检测MCMV的灵敏度
[0040]图7为3-MPA和11-MUA修饰的QCM检测MCMV特异性[0041 ]图8为3-MPA和I1-MUA共修饰的QCM金片检测实际样品
[0042]图9为I1-MUA修饰的QCM金片的标准曲线
[0043]图10为3-MPA和I1-MUA修饰的QCM检测MCMV的标准曲线
[0044]图11为两种修饰方法灵敏度比较
[0045]图12为3-MPA和I1-MUA共修饰的QCM金片表面厚度变化
[0046]图13为D-F曲线
【具体实施方式】
[0047]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0048]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0049]下述实施例中所用的化学试剂及材料如表1所示:
[0050]表1化学试剂及材料表
[0051]
【权利要求】
1.一种制备用于检测病毒的QCM金片的方法，包括如下步骤: 1)用巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片，得到修饰后金片； 2)将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的QCM金片。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述巯基十一酸和3-巯基丙酸共修饰QCM金片按照如下方法制备:将所述QCM金片浸泡在含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中； 步骤2)中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸和3-巯基丙酸通过酰胺键连接。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于: 步骤I)中，所述含有巯基十一酸和3-巯基丙酸的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:1-1:10，所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比具体为1:1、1:5或1:10。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述巯基十一酸和所述3-巯基丙酸的摩尔浓度比为1:10。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述巯基十一酸在所述溶液中的终浓度为0.9mM ； 所述3-巯基丙酸在所述溶液中的终浓度为9mM。
6.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 步骤2)中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片按照如下方法制备:先用含有EDC和Sulfo-NHS的溶液活化所述修饰后金片表面的巯基十一酸和3-巯基丙酸的羧基基团；再滴加所述抗病毒抗体，以固定抗体；再将BSA封闭，得到用于检测所述病毒的QCM金片; 所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比为4-5:1; 所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC和Sulfo-NHS的摩尔比具体为5:1。
7.根据权利要求6中所述的方法，其特征在于:所述含有EDC和Sulfo-NHS的溶液中的EDC的终浓度为0.075M,且Sulfo-NHS的终浓度为0.015M。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述抗病毒抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述抗病毒抗体具体为单克隆抗体； 所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
9.由权利要求1-8任一所述的方法制备的用于检测病毒的QCM金片；所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
10.权利要求9所述的用于检测病毒的QCM金片在检测病毒中的应用；所述病毒具体为玉米褪绿斑驳病毒。
【文档编号】G01N33/569GK103792352SQ201410049532
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月13日 优先权日:2014年2月13日
【发明者】黄新, 徐江敏 申请人:中国检验检疫科学研究院