一种中药材多指标成分含量的快速测定方法
【专利摘要】本发明提供一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，所述中药材主要包括水蛭和地龙药材。是利用偏最小二乘回归方法建立水蛭或地龙药材的光谱与其多指标成分（水分、可溶性固形物、次黄嘌呤、总糖、多糖、游离氨基酸和多肽）化学值之间的近红外定量分析模型，实现水蛭和地龙药材关键质控指标的快速测定。与游离氨基酸、多肽、糖类的传统测定方法相比，所建立的方法简便、快速、准确。本发明有利于提高水蛭和地龙药材的质量控制水平，从而确保其成品质量的有效与均一。
【专利说明】一种中药材多指标成分含量的快速测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药质量控制【技术领域】，涉及一种以近红外光谱快速测定中药多指标成分含量的快速测定方法，尤其涉及一种水蛭或地龙药材多指标成分含量的快速测定方法。
【背景技术】
[0002]水蛭是一味传统中药，有效成分包括氨基酸、多肽、次黄嘌呤、黄嘌呤、总磷脂、多糖、生物活性物质等。近年来，发现其对心脑血管疾病具有很好的治疗作用，临床上用于脑血栓、冠状动脉粥硬化性心脏病及脑水肿的治疗。
[0003]地龙具有悠久的药用历史，富含多种氨基酸、核酸成分，具有抗血栓、抗癌、增强免疫、抗溃疡、保肝等作用。近几十年对地龙的化学成分和药理作用研究，临床用于咳喘、头痛目赤、咽喉肿痛、小便不通、风湿关节炎、半身不遂等症。
[0004]水蛭和地龙药材是我国常用药材之一，因来源复杂，成分含量差异很大。过去药材的传统投料方式直接影响其成品质量的均一性，甚至导致成品批次间的较大差异，本发明能够科学准确控制药材的投料量。
[0005]近红外光谱分析技术，近年来随化学计量学而迅速发展，已经越来越多被应用于中药研究，包括药材产地鉴别、有效组分含量测定和制药过程的在线检测，实现了快速测定药材的有效成分，杜绝盲目投料，科学控制投料量。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，是一种基于近红外光谱快速测定水蛭和地龙药材多指标成分含量的快速测定方法，可实现快速评价水蛭和地龙药材综合质量。所述中药材包括水蛭和地龙药材。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现:
(O采集水蛭或地龙药材的近红外光谱:将不同产地、不同采收季节的水蛭或地龙药材，置恒温烘箱中除去表面水分，打粉过筛并取适量水蛭或地龙药材粉末置近红外光谱仪的旋转杯中，平铺I cm厚度的药材粉末，保持粉末表面平整，使用近红外积分球漫反射采集光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cnT1，吸光度数据格式为:logl/R，光谱扫描范围为4000?10000 cnT1，将得到的光谱数据分为校正集和验证集两类。
[0008](2)测定水蛭或地龙药材的多指标成分含量:水蛭或地龙药材的多指标成分相同，都包括水分、可溶性固形物、次黄嘌呤、总糖和多糖及游离氨基酸和多肽。采用烘干法测定水分和可溶性固形物，间接碘量法(碘液-硫代硫酸钠滴定法)测定总糖和多糖，高效液相色谱法测定次黄嘌呤、游离氨基酸和多肽。
[0009](a)水分含量的测定:采用《中国药典》一烘干法测得水蛭或地龙药材的水分含量，采集水蛭或地龙药材的近红外光谱后，取适量水蛭或地龙药材粉末于105°C的恒温干燥箱中5 h，在干燥器中冷却20?30 min后称量，再在105°C下干燥I h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg,根据减失的重量，计算样品的水分含量。
[0010](b)可溶性固形物含量的测定:采用烘干法测定水蛭或地龙药材的可溶性固形物含量；精密移取0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),称重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一个小时称重，直至连续两次称重重量差距小于5 mg，最终重量计X2，可溶性固形物(％)= (X2 - X0) / (X1 - X。)X 100%，计算样品的可溶性固形物含量。
[0011](C)次黄嘌呤含量的测定:采用HPLC测定水蛭或地龙药材的次黄嘌呤含量；取适量0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液过滤膜，取滤液进样10 μ I，按如下HPLC色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，用外标法计算样品的次黄嘌呤含量；
次黄嘌呤HPLC色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流动相A:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B:50%甲醇；梯度洗脱步骤:0?5 min为100%A相，5?10 min为100%?99%A相，10?50 min为99%?0%A相，后运行10 min ;检测波长254 nm ;进样量10 μ I ;柱温25 V ;流速I mL/min。
[0012](d)总糖和多糖含量的测定:采用间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭或地龙药材的总糖和单糖，依据硫代硫酸钠的消耗量，先计算碘液的消耗量，再计算样品的总糖和单糖，多糖含量通过总糖含量减去单糖含量得到。
[0013](e)游离氨基酸和多肽含量的测定:采用HPLC柱前衍生方法测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。
[0014]游离氨基酸衍生前供试品溶液的制备:精密称取水蛭或地龙药材粉末一定量，用新制的0.9%氯化钠溶液浸提，得0.1 g/mL浸提液，过滤膜备用。
[0015]总氨基酸衍生前供试品溶液的制备:将药材粉末浸提液、含1%苯酚的6 mol/L盐酸和40%氢氧化钠按体积比为1:4:2.4混合；具体:精密移取药材浸提液和含1%苯酚的6mol/L盐酸到水解管，混合，充氮气去除氧气，迅速密封，置110°C恒温干燥器内22小时，精密加入一定体积的40%氢氧化钠,涡旋混匀,过膜待用。
[0016]流动相A液的配制:配制0.01 mol/L三水合醋酸钠溶液I L，精密加入三乙胺180μ I，搅拌混匀，滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20，加四氢呋喃3 mL,混匀。
[0017]流动相B液的配制:配制0.05 mol/L三水合醋酸钠溶液400 mL,滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20，与乙腈-甲醇(V: v=l:1)的混合液混匀，得三水合乙酸钠-乙腈-甲醇(v: V: v=l:2:2)体系。
[0018]硼酸缓冲液:0.2 mol/L硼酸钠溶液用10%氢氧化钠溶液调pH = 10.4。
[0019]衍生试剂:①邻苯二甲醛(OPA)衍生试剂:配制含0.1%3-巯基丙酸(3-MPA)的4g/L邻苯二甲醛100 mL，避光并4°C下保存芴甲氧羰酰氯(FM0C-C1)衍生试剂:配制Ig/L的芴甲氧羰酰氯50 mL ;避光并4°C下保存。
[0020]进样前的衍生操作:首先分别精密移取混合氨基酸对照品溶液和四硼酸氢钠0.1 mL和0.5 mL，混匀，再移取0.1 mL OPA衍生试剂，混匀静置一分钟，然后移取0.1 mLFM0C-C1衍生试剂，同样混勻静置一分钟，进样。
[0021]采用HPLC测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和多肽含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;进样量 10 μ I ;柱温 30°C ;检测波长:0 ?46 min 为 338 nm, 46 ?54.5 min 为 262 nm, 54.5 ?60 min 为 338 nm,梯度洗脱步骤:0?4 min为97%A相，4?10 min为97%?92%A相，10?24 min为92%?70%A 相，24 ?30 min 为 70%A 相，30 ?45 min 为 70% ?40%A 相，45 ?55 min 为 40% ?0%A相，55?60 min为0%?97%A相，后运行10 min。
[0022]按上述的色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。
[0023](3)建立多指标成分的定量分析模型:将步骤(2)所得的水分含量、可溶性固形物含量、次黄嘌呤含量、总糖和多糖含量以及游离氨基酸和多肽含量分别与步骤(I)的近红外光谱数据关联，对于每个指标成分，都对光谱进行不同的预处理并采用不同建模波段，运用偏最小二乘回归方法建立每个指标成分的多个定量分析模型。
[0024](4)确定多指标成分的最佳定量分析模型:最佳定量分析模型通过模型参数确定。模型参数包括相关系数R、验证误差均方根(RMSEP)、校正误差均方根(RMSEC)、验证集相对预测误差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC与RMSEP越接近，则模型的预测值与标准化学值之间的相关性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，则模型的预测精度越高。通过模型参数来评价步骤(3)所建立的每个指标的多个定量分析模型的稳定性和准确性，选择模型参数最佳的近红外定量分析模型检测未知的水蛭或地龙药材的多指标含量。
[0025]本发明利用偏最小二乘回归方法建立水蛭或地龙药材的近红外光谱与其多指标成分(水分、可溶性固形物、次黄嘌呤、总糖、多糖、游离氨基酸和多肽)化学值之间的定量分析模型，实现水蛭和地龙药材关键质控指标的快速测定。传统分析方法虽然较精确，但往往繁琐耗时，比如氨基酸含量测定多数采用HPLC法、毛细管电泳法等，以及糖含量测定一般是采用滴定法、分光光度法等。与之相比，近红外光谱测定氨基酸和糖含量具有明显的无损快速优势，能够实现同时测定多种指标成分含量，而且有助于达到实时在线监测。本发明有利于提高水蛭和地龙药材的质量控制水平，从而确保其成品质量的有效、均一。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]附图1是水蛭药材水分含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0027]附图2是水蛭药材验证集的水分含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0028]附图3是水蛭药材可溶性固形物含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0029]附图4是水蛭药材验证集的可溶性固形物含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0030]附图5是水蛭药材次黄嘌呤含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0031]附图6是水蛭药材验证集的次黄嘌呤含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0032]附图7是水蛭药材总糖含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0033]附图8是水蛭药材验证集的总糖含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0034]附图9是水蛭药材多糖含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0035]附图10是水蛭药材验证集的多糖含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0036]附图11是水蛭药材游离氨基酸含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0037]附图12是水蛭药材验证集的游离氨基酸含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0038]附图13是水蛭药材多肽含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0039]附图14是水蛭药材验证集的多肽含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。[0040]附图15是地龙药材水分含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0041]附图16是地龙药材验证集的水分含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0042]附图17是地龙药材可溶性固形物含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0043]附图18是地龙药材验证集的可溶性固形物含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0044]附图19是地龙药材次黄嘌呤含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0045]附图20是地龙药材验证集的次黄嘌呤含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0046]附图21是地龙药材总糖含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0047]附图22是地龙药材验证集的总糖含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0048]附图23是地龙药材多糖含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0049]附图24是地龙药材验证集的多糖含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0050]附图25是地龙药材游离氨基酸含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0051]附图26是地龙药材验证集的游离氨基酸含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0052]附图27是地龙药材多肽含量实测值与近红外预测值的相关图。
[0053]附图28是地龙药材验证集的多肽含量实测值与近红外预测值的趋势对照图。
[0054]实施例1水蛭药材多指标成分含量快速测定 (I)水蛭药材的近红外漫反射光谱的采集
收集不同产地、不同采收季节的水蛭药材有6份样品，每份按“头、尾、身”分为3份，每份“身”再分成5份，共有水蛭样品42个。
[0055]将42份水蛭药材过80目筛，放入旋转杯中，平铺I cm厚度的药材粉末，使用近红外积分球漫反射采集光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm—1，吸光度数据格式为:logl/R，光谱扫描范围为4000?10000 cm—1，得光谱数据。
[0056](2)测定水蛭药材的多指标成分含量
(a)水分含量的测定:采用《中国药典》——烘干法测得水蛭药材的水分含量。取近红外光谱采集后的水蛭药材粉末置于105°C的恒温干燥箱中5 h，在干燥器中冷却至室温后称量，再在105°C下干燥I h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg，根据减失的重量，计算水蛭样品的含水量。
[0057](b)可溶性固形物含量的测定:在近红外光谱采集后，精密称取0.5 g水蛭药材粉末，精密移取现配的0.9%氯化钠5 mL浸提24 h，离心，精密移取浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),称重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一个小时称重，直至连续两次称重重量差距小于5 mg，最终重量计X2，可溶性固形物(％) = (X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%。
[0058](c)次黄嘌呤含量的测定:采用HPLC法测定水蛭药材的次黄嘌呤含量。
[0059]对照品溶液的制备:精密称取次黄嘌呤对照品0.0101 g，置100 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0060]供试品溶液的制备:精密称取水蛭药材粉末0.5 g于10 mL试管中用5 mL移液管移取5 mL新制的0.9%生理盐水，封口膜密封，放置24 h，以3000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μπι滤膜备用。取滤液进样10 μ I，按如下色谱条件，用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品中次黄嘌呤的含量。
[0061]采用HPLC测定水蛭药材的次黄嘌呤含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流动相A:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B:50%甲醇；梯度洗脱步骤:0?5 min为100%A相，5?10 min为100%?99%A相，10?50 min为99%?0%A相，后运行10 min ;检测波长254 nm ;进样量10 μ I ;柱温25 V ;流速I mL/min。
[0062](d)总糖和多糖含量的测定:采用间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭药材的总糖和多肽含量。间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭药材的总糖和单糖含量，依据硫代硫酸钠消耗量，先计算碘液的消耗量，再计算水蛭药材的总糖和单糖含量，然后通过总糖含量减去单糖含量计算多糖含量，最后将总糖含量和多糖含量分别与近红外光谱数据相结合，用偏最小二乘回归方法建立定量分析模型。
[0063]自制试剂:0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液，10%稀盐酸，10%稀硫酸，0.5%酚酞指示剂，0.5%淀粉指示剂，0.1 mol/L碘液。硫代硫酸钠溶液和碘液标定结果:硫代硫酸钠溶液浓度为 0.010408 mol/L ;碘液浓度为 0.009373 mol/L。
[0064]取每个样品提取液0.2 mL两份，一份作为总糖含量测定的样品备用，另一份作为单糖含量测定的样品备用；每个用于总糖含量测定的样品都先经酸水解45 min后，再碱调到中性，然后同单糖含量测定一致操作。单糖含量通过碘液-硫代硫酸钠滴定法测定。
[0065](e)游离氨基酸和多肽含量的测定
混合氣基酸对照品溶液的制备:精密称取一定量的氣基酸标准品置于100 mL掠色容量瓶中，用0.1 mol/L氯化氢溶解并定容至刻度线。
[0066]游离氨基酸衍生前供试品溶液的制备:每个样品经近红外光谱扫描后精密称取0.3 g，再精密移取3 mL刚配制的0.9%氯化钠溶液，震摇一分钟，静置提取24 h后离心，取上清液滤膜待用。
[0067]总氨基酸衍生前供试品溶液的制备:精密移取上述上清液0.5 mL和1%苯酚的6mol/L盐酸2 mL到水解管，混合，充氮气一分钟，迅速密封，置110°C恒温干燥器内22小时，取出，放冷，精密加入40%氢氧化钠1.2 mL,涡旋混匀，过膜待用。
[0068]流动相A液的配制:精密称取1.36 g三水合醋酸钠溶解于I L水中，搅拌精密加入三乙胺180 μ I，混匀，滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20，加四氢呋喃3 mL，混匀。
[0069]流动相B液的配制:精密称取2.72 g三水合醋酸钠溶解于400 mL水中，搅拌，滴加2%冰醋酸，调pH= 7.20，过膜量取200 mL加至乙腈-甲醇(v: v=l:1)的混合液800 mL,混匀；
硼酸缓冲液:0.2 mol/L硼酸钠溶液用10%氢氧化钠溶液调pH = 10.4。
[0070]衍生试剂:①OPA衍生试剂:精密称取0.4 g邻苯二甲醛置100 mL棕色容量瓶，精密加入400 μ I的3-ΜΡΑ用少量乙腈溶解后定容，摇匀，避光并4°C下保存。②FM0C-C1衍生试剂:精密称量0.05 g FM0C-C1置50 mL棕色容量瓶中加乙腈溶解并定容；避光并4°C下保存。
[0071]进样前的衍生操作:首先分别精密移取混合氨基酸对照品溶液和四硼酸氢钠0.1 mL和0.5 mL，混匀，再移取0.1 mL OPA衍生试剂，混匀静置一分钟，然后移取0.1 mLFM0C-C1衍生试剂，同样混勻静置一分钟,最后进样10 μ ι。
[0072]采用HPLC测定水蛭药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;进样量 10 μ I ;柱温 30°C ;检测波长:0 ?46 min 为 338 nm, 46 ?54.5 min 为 262 nm, 54.5 ?60 min 为 338 nm,梯度洗脱步骤:0?4 min为97%A相，4-10 min为97%?92%A相，10?24 min为92%?70%A 相，24 ?30 min 为 70%A 相，30 ?45 min 为 70% ?40%A 相，45 ?55 min 为 40% ?0%A相，55?60 min为0%?97%A相，后运行10 min。
[0073]按上述的色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，用外标法计算水蛭药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。
[0074](3)建立水蛭药材多指标成分的定量分析模型
将所得的水分含量、可溶性固形物含量、次黄嘌呤含量、总糖和多糖含量以及游离氨基酸和多肽含量分别与近红外光谱数据关联，对于每个指标成分，都对光谱进行不同的预处理并采用不同建模波段，运用偏最小二乘回归方法建立每个指标成分的多个定量分析模型。
[0075](4)确定水蛭药材的多指标成分的最佳定量分析模型
最佳定量分析模型通过模型评价参数确定。模型评价参数包括相关系数R、验证误差均方根(RMSEP)、校正误差均方根(RMSEC)、验证集相对预测误差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC与RMSEP越接近，则模型的预测值与标准化学值之间的相关性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，则模型的预测精度越高。
[0076](a)水蛭药材水分含量的最佳定量分析模型
水蛭药材水分含量的最佳定量分析模型见附图1和附图2。采用一阶导数和Savitzky-Golay filter 处理，R 为 0.8704，建模波段为 4987.01 ?4794.17 cnT1，因子数3，RMSEC 为 0.15，RMSEP 为 0.13，RSEP 为 0.34%。
[0077](b)水蛭药材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型
水蛭药材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型见附图3和附图4。采用原始光谱和 Savitzky-Golay filter 处理，R 为 0.9866，建模波段为 5415.13 ?5391.99 cnT1 和7119.90 ?5997.53 cnT1，因子数 5，RMSEC % 0.60, RMSEP % 0.75, RSEP 为 0.24%。
[0078](c)水蛭药材次黄嘌呤含量的最佳定量分析模型
水蛭药材次黄嘌呤含量的最佳定量分析模型见附图5和附图6采用一阶导数和Norris derivative filter 处理，R 为 0.9164,建模波段为 4489.47 ?4346.76 cm 1 和5928.11 ?5804.68 cnT1，因子数 4，RMSEC 为 0.12，RMSEP 为 0.10，RSEP 为 0.46%。
[0079](d)水蛭药材总糖和多糖含量的最佳定量分析模型
水蛭药材总糖的最佳定量分析模型见附图7和附图8，采用原始光谱无光滑处理，R为0.8577，建模波段为 7131.47 ?5098.87 cnT1，因子数 10，RMSEC 为 1.99，RMSEP 为 3.14，RSEP为2.60% ;水蛭药材多糖的最佳定量分析模型见附图9和附图10，采用原始光谱无光滑处理，R 为 0.7376，建模波段为 7370.60 ?5445.99 cnT1，因子数 7，RMSEC 为 2.24，RMSEP% 2.33, RSEP 为 26.91%。
[0080](e)水蛭药材游离氨基酸和多肽含量的最佳定量分析模型
水蛭药材游离氨基酸的最佳定量分析模型见附图11和附图12，采用一阶导数和Savitzky-Golay filter 处理，R 为 0.7557，建模波段为 9885.32 ?9083.00 cnT1，因子数6，RMSEC为1.90，RMSEP为2.33，RSEP为2.36%。水蛭药材多肽的最佳定量分析模型见附图13和附图14，采用一阶导数和Savitzky-Golay filter处理，R为0.7222，建模波段为9999.00 ?9300.00 cnT1 和 7400.00 ?7300.00 cnT1，因子数 5，RMSEC 为 4.72，RMSEP 为
4.55，RSEP 为 7.87%。
[0081]实施例2地龙药材多指标成分含量快速测定
(I)地龙药材的近红外漫反射光谱的采集
收集不同产地、不同采收季节的地龙药材有7份样品，每份按“头、尾、身”分为3份，每份“身”再分成5份，共有地龙样品49个。
[0082]将49份地龙药材过80目筛，放入旋转杯中，平铺I cm厚度的药材粉末，使用近红外积分球漫反射采集光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm—1，吸光度数据格式为:logl/R，光谱扫描范围为4000?10000 cm—1，得光谱数据。
[0083](2)测定地龙药材的多指标成分含量
(a)水分含量的测定:采用《中国药典》——烘干法测得地龙药材的水分含量。取近红外光谱采集后的地龙药材粉末置于105°C的恒温干燥箱中5 h，在干燥器中冷却至室温后称量，再在105°C下干燥I h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg，根据减失的重量，计算地龙样品的含水量。
[0084](b)可溶性固形物含量的测定:在近红外光谱采集后，精密称取0.5 g药材粉末，精密移取现配的0.9%氯化钠5 mL浸提24 h，离心，精密移取浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),称重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一个小时称重，直至连续两次称重重量差距小于5 mg，最终重量计X2，可溶性固形物(％) = (X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%。
[0085](C)次黄嘌呤含量的测定
对照品溶液的制备:精密称取次黄嘌呤对照品0.0101 g，置100 mL容量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
[0086]供试品溶液的制备:精密称取地龙药材0.5 g于10 mL试管中(各平行5份)用5mL移液管移取5 mL新制的0.9%生理盐水，封口膜密封，放置24 h，以3000 r/min离心10min,取上清液过0.45 μ m滤膜，进样10 μ 1，按色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，用外标法计算样品中次黄嘌呤的含量。
[0087]采用HPLC测定地龙药材的次黄嘌呤含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mmX250 mm, 5 μ m);流动相A:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B:50%甲醇；梯度洗脱步骤:0?5 min为100%A相，5?10 min为100%?99%A相，10?50 min为99%?0%A相，后运行10 min ;检测波长254 nm ;进样量10 μ I ;柱温25 V ;流速I mL/min。
[0088](d)总糖和多糖含量的测定:采用间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭药材的总糖和多肽含量。间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定地龙药材的总糖和单糖含量，依据硫代硫酸钠消耗量，先计算碘液的消耗量，再计算地龙药材的总糖和单糖含量，然后将总糖含量减去单糖含量计算多糖含量，最后将总糖含量和多糖含量分别与近红外光谱数据相结合，用偏最小二乘回归方法建立定量分析模型。
[0089]自制试剂:0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液，10%稀盐酸，10%稀硫酸，0.5%酚酞指示剂，0.5%淀粉指示剂，0.1 mol/L碘液。硫代硫酸钠溶液和碘液标定结果:硫代硫酸钠溶液浓度为 0.010408 mol/L ;碘液浓度为 0.009373 mol/L。
[0090]取每个样品提取液0.2 mL两份，一份作为样品总糖含量测定备用，另一份作为样品单糖含量测定备用；每个用于测定总糖含量到的样品都先经酸水解45 min后，再碱调到中性，然后同单糖含量测定一致操作。单糖含量通过碘液-硫代硫酸钠滴定法测定。
[0091](e)游离氨基酸和多肽含量的测定
混合氣基酸对照品溶液的制备:精密称取一定量的氣基酸标准品置于100 mL掠色容量瓶中，用0.1 mol/L氯化氢溶解并定容至刻度线。
[0092]游离氨基酸衍生前供试品溶液的制备:每个样品经近红外光谱扫描后精密称取0.3 g，再精密移取3 mL刚配制的0.9%氯化钠溶液，震摇一分钟，静置提取24 h后离心，取上清液滤膜待用。
[0093]总氨基酸衍生前供试品溶液的制备:精密移取上述上清液0.5 mL和1%苯酚的6mol/L盐酸2 mL到水解管，混合，充氮气一分钟，迅速密封，置110°C恒温干燥器内22小时，取出，放冷，精密加入40%氢氧化钠1.2 mL,涡旋混匀，过膜待用。
[0094]流动相A液的配制:精密称取1.36 g三水合醋酸钠溶解于I L水中，搅拌精密加入三乙胺180 μ I，混匀，滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20，加四氢呋喃3 mL，混匀。
[0095]流动相B液的配制:精密称取2.72 g三水合醋酸钠溶解于400 mL水中，搅拌，滴加2%冰醋酸，调pH= 7.20，过膜量取200 mL加至乙腈-甲醇(v: v=l:1)的混合液800 mL,混匀；
硼酸缓冲液:0.2 mol/L硼酸钠溶液用10%氢氧化钠溶液调pH = 10.4。
[0096]衍生试剂:①OPA衍生试剂:精密称取0.4 g邻苯二甲醛置100 mL棕色容量瓶，精密加入400 μ I的3-ΜΡΑ用少量乙腈溶解后定容，摇匀，避光并4°C下保存。②FMOC-Cl衍生试剂:精密称量0.05 g FMOC-Cl置50 mL棕色容量瓶中加乙腈溶解并定容；避光并4°C下保存。
[0097]进样前的衍生操作:首先分别精密移取混合氨基酸对照品溶液和四硼酸氢钠
0.1 mL和0.5 mL，混匀，再移取0.1 mL OPA衍生试剂，混匀静置一分钟，然后移取0.1 mLFMOC-Cl衍生试剂，同样混勻静置一分钟,最后进样10 μ ι。
[0098]采用HPLC测定地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;进样量 10 μ I ;柱温 30°C ;检测波长:0 ?46 min 为 338 nm, 46 ?54.5 min 为 262 nm, 54.5 ?60 min 为 338 nm,梯度洗脱步骤:0?4 min为97%A相，4-10 min为97%?92%A相，10?24 min为92%?70%A 相，24 ?30 min 为 70%A 相，30 ?45 min 为 70% ?40%A 相，45 ?55 min 为 40% ?0%A相，55?60 min为0%?97%A相，后运行10 min。
[0099]按上述的色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，用外标法计算地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。
[0100](3)建立地龙药材的多指标成分的定量分析模型
将烘干法测得的水分含量、烘干法测得的可溶性固形物含量、HPLC测定的次黄嘌呤含量、碘液-硫代硫酸钠滴定法测定的总糖和多糖以及HPLC柱前衍生测定的游离氨基酸和多肽含量分别与地龙药材的近红外光谱数据关联，对于每个指标成分，都对光谱进行不同的预处理并采用不同建模波段，运用偏最小二乘回归方法建立每个指标成分的多个定量分析模型。
[0101](4)确定地龙药材的多指标成分的最佳定量分析模型 最佳定量分析模型通过模型评价参数确定。模型评价参数包括相关系数R、验证误差均方根(RMSEP)、校正误差均方根(RMSEC)、验证集相对预测误差(RSEP)。若R越接近1，RMSEC与RMSEP越接近，则模型的预测值与标准化学值之间的相关性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，则模型的预测精度越高。
[0102](a)地龙药材水分含量的最佳定量分析模型
地龙药材水分含量的最佳定量分析模型见附图15和附图16，采用原始光谱和Savitzky-Golay filter 处理，R 为 0.9372，建模波段为 7054.33 ?4582.04 cnT1，因子数6，RMSEC 为 0.16，RMSEP % 0.41, RSEP 为 2.17%。
[0103](b)地龙药材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型
地龙药材可溶性固形物含量的最佳定量分析模型见附图17和附图18，采用一阶导数和 Norris derivative filter 处理，R 为 0.9663，建模波段为 9900.75 ?7262.61 cnT1，因子数 5，RMSEC 为 0.64，RMSEP 为 0.90，RSEP 为 0.59%。
[0104](c)地龙药材次黄嘌呤含量的最佳定量分析模型
地龙药材次黄嘌呤含量的最佳定量分析模型见附图19和附图20，采用原始光谱和 Savitzky-Golay filter 处理，R 为 0.9296，建模波段为 4516.47 ?4273.48 cnT1 和7062.04 ?4574.32 cnT1，因子数 5，RMSEC 为 0.24，RMSEP 为 0.19，RSEP 为 5.52%。
[0105]Cd)地龙药材总糖和多糖含量的最佳定量分析模型
地龙药材总糖的最佳定量分析模型见附图21和附图22，采用原始光谱无光滑处理，R为 0.9557，建模波段为 4724.74 ?4192.49 cnT1，因子数 10，RMSEC 为 1.33, RMSEP % 1.36,RSEP为0.29% ;地龙药材多糖的最佳定量分析模型见附图23和附图24，采用原始光谱无光滑处理，R 为 0.8321，建模波段为 4724.74 ?4192.49 cm—1，因子数 7，RMSEC 为 1.14, RMSEP为 1.39，RSEP 为 12.12%。
[0106](e)地龙药材游离氨基酸和多肽含量的最佳定量分析模型
地龙药材游离氨基酸的最佳定量分析模型见附图25和附图26，采用二阶导数和Norris derivative filter 处理，R 为 0.7557，建模波段为 4277.34 ?4057.49 cnT1 和7400.00 ?7100.00 cnT1，因子数 9，RMSEC 为 3.37，RMSEP 为 2.60，RSEP 为 0.75% ;地龙药材多肽的最佳定量分析模型见附图27和附图28,采用一阶导数和Savitzky-Golay filter处理，R 为 0.8008，建模波段为 7500.00 ?7300.00 cnT1 和 5800.00 ?5700.00 cnT1，因子数 4，RMSEC 为 3.35，RMSEP 为 3.58，RSEP 为 10.69%。
【权利要求】
1.一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，所述中药材是水蛭或地龙药材，通过以下步骤实现: (1)采集水蛭或地龙药材的近红外光谱:将不同产地、不同采收季节的水蛭或地龙药材，置恒温烘箱中除去表面水分，打粉过筛；取适量水蛭或地龙药材粉末置近红外光谱仪的旋转杯中，保持粉末表面平整，采集近红外漫反射光谱，将得到的光谱数据分为校正集和验证集两类； (2)测定水蛭或地龙药材的多指标成分含量:所述的多指标成分为水分、可溶性固形物、次黄嘌呤、总糖和多糖以及游离氨基酸和多肽；采用烘干法测定水分含量和可溶性固形物含量，高效液相色谱法测定次黄嘌呤含量，高效液相色谱柱前衍生法测定游离氨基酸和多肽含量，碘液-硫代硫酸钠滴定法测定总糖和多糖含量； (3)建立多指标成分的定量分析模型:将步骤(2)所测定的水蛭或地龙药材的水分含量、可溶性固形物含量、次黄嘌呤含量、总糖和多糖含量以及游离氨基酸和多肽含量分别与步骤(1)水蛭或地龙的近红外光谱数据关联，对于每个指标成分，都对光谱进行不同的预处理并采用不同建模波段，运用偏最小二乘回归方法建立每个指标成分的多个定量分析模型； (4)确定多指标成分的最佳定量分析模型:最佳定量分析模型通过模型参数确定，模型参数包括相关系数(R)、验证误差均方根(RMSEP)、校正误差均方根(RMSEC)、验证集相对预测误差(RSEP);若R越接近1，RMSEC与RMSEP越接近，则模型的预测值与标准化学值之间的相关性好，RMSEC, RMSEP, RSEP值越小，则模型的预测精度越高；通过模型参数来评价步骤(3)所建立的每个指标的多个定量分析模型的稳定性和准确性，选择模型参数最佳的近红外定量分析模型来检测未知的水蛭或地龙药材的多指标含量。
2.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，步骤(1)采集水蛭或地龙药材的近红外光谱使用近红外积分球漫反射采集光谱，以空气为参比，扫描次数为32，`分辨率为8 cnT1，吸光度数据格式为:logl/R，光谱扫描范围为4000~10000 cm 1O
3.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，步骤(2)中 Ca)水分含量的测定:采用《中国药典》——烘干法测得水蛭和地龙药材的水分含量； (b)可溶性固形物含量的测定:采用烘干法测定水蛭和地龙药材的可溶性固形物含量；精密移取0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶(Xtl),称重(X1)，置105°C烘箱中，每隔一个小时称重，直至连续两次称重重量差距小于5 mg，最终重量计X2，可溶性固形物(％) =(X2 - X0) / (X1 - X0) X 100%，计算样品的可溶性固形物含量； (c)次黄嘌呤含量的测定:采用HPLC测定水蛭和地龙药材的次黄嘌呤含量； 取适量0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液过0.45 μ m滤膜，取滤液进样10 μ 1，按如下色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品的次黄嘌呤含量； 次黄嘌呤HPLC色谱条件:色谱柱Eclipse 乂08_(:18柱，4.6 mmX250 mm, 5 μ m,;流动相A:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B:50%甲醇；梯度洗脱步骤:0~5 min为100%A相，5~10 min为100%~99%A相，10~50 min为99%~0%A相，后运行10 min ;检测波长254 nm ;进样量10 μ I ;柱温25 V ;流速I mL/min ；(d)总糖和多糖含量的测定:采用间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭或地龙药材的总糖和单糖，依据硫代硫酸钠的消耗量，先计算碘液的消耗量，再计算样品的总糖和单糖，多糖含量通过总糖含量减去单糖含量而得到； (e)游离氨基酸和多肽含量的测定:采用HPLC柱前衍生化方法测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，再将总氨基酸含量减去游离氨基酸含量计算多肽含量； 游离氨基酸衍生前供试品溶液的制备:精密称取水蛭或地龙药材粉末一定量，用新制的0.9%氯化钠溶液浸提，得0.1 g/mL浸提液，每I ml浸提液含0.1 g水蛭或地龙药材粉末，过滤膜备用； 总氨基酸衍生前供试品溶液的制备:将药材粉末浸提液、含1%苯酚的6 mol/L盐酸和40%氢氧化钠按体积比为1:4:2.4混合；具体操作:精密移取药材浸提液和含1%苯酚的6mol/L盐酸到水解管，混合，充氮气去除氧气，迅速密封，置110°C恒温干燥器内22小时，精密加入一定体积的40%氢氧化钠,涡旋混匀,过膜待用； 流动相A液的配制:配制0.01 mol/L三水合醋酸钠溶液I L，精密加入三乙胺180 μ I,搅拌混匀，滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20，加四氢呋喃3 mL，混匀； 流动相B液的配制:配制0.05 mol/L三水合醋酸钠溶液400 mL,滴加2%冰醋酸，调pH = 7.20,与体积比1:1的乙腈-甲醇混合液混匀，得体积比1:2:2的三水合乙酸钠-乙腈-甲醇体系； 硼酸缓冲液:0.2 mol/L硼酸钠溶液用10%氢氧化钠溶液调pH =10.4； 衍生试剂:①邻苯二甲醛衍生试剂:配制含0.1%巯基丙酸的4 g/L邻苯二甲醛100mL，避光并4°C下保存；②芴甲氧羰酰氯衍生试剂:配制I g/L的芴甲氧羰酰氯50 mL，避光并4°C下保存；` 进样前的衍生操作:首先分别精密移取混合氨基酸对照品溶液和四硼酸氢钠0.1 mL和0.5 mL，混匀，再移取0.1 mL OPA衍生试剂，混匀静置一分钟，然后移取0.1 mL芴甲氧羰酰氯衍生试剂，同样混匀静置一分钟，进样； 采用HPLC测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，色谱条件:色谱柱Eclipse XDB-C18 柱(4.6 mmX 250 mm, 5 μ m);流速 1.0 mL/min ;进样量 10 μ I ;柱温 30°C ;检测波长:0 ~46 min 为 338 nm, 46 ~54.5 min 为 262 nm, 54.5 ~60 min 为 338 nm,梯度洗脱步骤:0~4 min为97%A相，4~10 min为97%~92%A相，10~24 min为92%~70%A 相，24 ~30 min 为 70%A 相，30 ~45 min 为 70% ~40%A 相，45 ~55 min 为 40% ~0%A相，55~60 min为0%~97%A相，后运行10 min ； 按上述的色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。
4.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，所述水蛭或地龙药材的游离氨基酸和多肽含量测定的HPLC色谱条件:色谱柱EclipseXDB-C18 柱，4.6 mmX250 mm, 5 μ m, ；Aff1:0.01 mol/L醋酸钠缓冲液体系；Bff1:体积比为2:2:1的甲醇-乙腈-醋酸钠缓冲液体系；流速1.0 mL/min ;进样量10 μ I ;柱温30 V ；检测波长:0 ~46 min 为 338 nm, 46 ~54.5 min 为 262 nm, 54.5 ~60 min 为 338 nm,梯度洗脱步骤:0~4 min为97%A相，4~10 min为97%~92%A相，10~24 min为92%~70%A 相，24 ~30 min 为 70%A 相，30 ~45 min 为 70% ~40%A 相，45 ~55 min 为 40% ~0%A相， 55~60 min 为0%~97%A相，后运行10 min。
【文档编号】G01N21/359GK103884676SQ201410068578
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】吴永江, 刘雪松, 吴春艳, 栾连军, 金叶, 李页瑞, 李振国, 倪开岭, 黄靖梅 申请人:浙江大学, 牡丹江友搏药业股份有限公司