动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种快速测定动物源性食品中莱克多巴胺含量的方法，用莱克多巴胺标准储备液配制九种莱克多巴胺标准溶液，分别与抗体溶液等体积混合，干燥孵育，加入到酶标板中，干燥孵育，洗板，拍干，酶标板内加入二抗溶液，反应结束后洗板，拍干；加显色液，干燥孵育，充分显色。加入硫酸终止液，用酶标仪波测定每孔吸光值，绘制系列莱克多巴胺标准液的工作曲线。将待测定纯瘦肉制成样品制备液，处理后，测定每孔吸光值，同时作空白实验；计算待测动物源性食品中莱克多巴胺含量。该快速测定方法能提高灵敏度、节省能源，稳定性、重现性较好，回收率较高，能满足实验室的检测要求。
【专利说明】动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品安全检测【技术领域】，涉及一种测定动物源性制品中β肾上腺受体激动剂含量的方法，特别涉及一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法。
【背景技术】
[0002]莱克多巴胺是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。它可以加快畜禽生长速度，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率。人们食用了残留莱克多巴胺的动物组织后会出现中毒症状，对患高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，严重的可能危及生命。对此药物在养殖业的使用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。自2011年12月5日起在我国境内禁止生产、销售和使用莱克多巴胺。
[0003]因此，国家食品安全领域强制执行检测动物源性制品中莱克多巴胺的含量。现有测定动物源性制品中莱克多巴胺方法有液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫间接竞争法、胶体金法等。其中的酶联免疫间接竞争法:1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题,它是一种特殊的试剂分析方法,是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。其中心就是让抗体与酶复合物结合，然后根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但用酶联免疫间接竞争法测定动物源性制品中莱克多巴胺的含量时，存在样品处理时间较长、灵敏度低、检出限较高、检测成本较高的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种样品处理时间短、灵敏度更高、检出限更和检测成本低的动物源性制品中莱克多巴胺含量的测定方法，能快速测定动物源性制品中莱克多巴胺的含量。
[0005]为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法，具体按以下步骤进行:
步骤1:精确称取氯化钠4.0OOOg、十二水合磷酸氢二钠1.4500g、氯化钾0.1OOOg和磷酸二氢钾0.lOOOg，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到磷酸盐缓冲液(PBS)，该磷酸盐缓冲液的PH值为7.4，磷酸盐缓冲液过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下；
分别精确称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL,得到碳酸盐缓冲液(CBS)，该碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，碳酸盐缓冲液过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下；
分别精确称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到底物缓冲液，该底物缓冲液的pH值为5.0,底物缓冲液过
0.22 μ m微孔滤I旲除囷，并保存在4 C下；
步骤2:精确称取牛血清白蛋白(BSA)lg，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得到BSA封闭液，BSA封闭液过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下；
取500mL步骤I中的磷酸盐缓冲液，加入250 μ L吐温-20，得到PBST洗液，PBST洗液过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下；
精确称取3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB) 0.0lOOg，溶于2mL 二甲基亚砜中，得到TMB底物液，TMB底物液过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下；
量取20.0OmL小牛血清、5.0Og蔗糖、1.0Og牛血清白蛋白和0.0lg叠氮化钠，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得到抗体稀释液，并保存在4°C下；
称取5.0Og鹿糖和1.0Og牛血清白蛋白，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得到二抗稀释液，并保存在4°C下；
步骤3:分别取质量百分比浓度为10%的双氧水溶液21 μ L、步骤I配制的底物缓冲液IOmL以及步骤2配制的TMB底物液200 μ L，混合，得到显色液；
称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL水中，此时该溶液会放热，待溶液恢复至常温定容至500mL，得到摩尔体积浓度2mol/L的硫酸终止液；
在盛放抗体的塑料容器中预先加满步骤2制得的抗体稀释液，放入37°C恒温箱中干燥孵育90min ;甩干容器内液体，得到封闭好的抗体盛放容器，干燥保存在4°C冰箱；
在盛放二抗的塑料容器中预先加满步骤2制得的二抗稀释液，放入37°C恒温箱中干燥孵育90min ;甩干容器内液体，得到封闭好的二抗盛放容器，干燥保存在4°C冰箱；
用步骤I制得的碳酸盐缓冲液将抗原蛋白稀释成质量体积浓度为5 μ g/mL的抗原蛋白溶液，并保存在4°C下；
若抗原蛋白溶液浓度过高，会造成试剂的浪费，浓度过低，会导致与抗体反应不完全，该浓度的抗原蛋白可以均匀、充分的吸附在酶标板内，同时满足之后和抗体反应时，浓度比抗体高，这样更有利于低浓度抗体充分捕获到抗原分子；
在封闭好的抗体盛放容器中，用步骤2中的抗体稀释液将抗体稀释成质量体积浓度为
3.34 μ g/mL的抗体溶液，并保存在4°C下；
若抗体溶液浓度过高，会降低该方法的灵敏度，同时造成试剂的浪费，浓度过低，会导致线性范围很小，该浓度的抗体溶液满足之后抗体与样品中莱克多巴胺小分子能够完全反应，并且有很闻的灵敏度；
在封闭好的二抗盛放容器中，用步骤2制得的二抗稀释液将二抗稀释成质量体积浓度为I μ g/mL的二抗溶液，并保存在4°C下；
若二抗溶液浓度过高，会造成试剂的浪费，浓度过低，会导致与抗体反应不完全，该浓度的二抗溶液满足之后和抗体反应时，浓度比抗体略高，保证酶标板中的抗体都能和二抗反应;
步骤4:将步骤3制得的抗原蛋白溶液以每孔100 μ L加入到酶标板内，加盖放入4°C冰箱中干燥孵育24h，倒出孔内液体，甩干；在每孔中加入PBST洗涤液300 μ L进行洗板，共洗板四次，拍干；然后在每孔中加入1%BSA封闭液100μ L，在37°C恒温箱中干燥孵育90min后，重复洗板过程四次，拍干，待用；步骤5:用步骤I制得的碳酸盐缓冲液稀释莱克多巴胺标准品，制成九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液，该九个莱克多巴胺溶液的质量体积浓度分别为:lng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、l.lng/mL、0.44ng/mL、0.llng/mL、0.044ng/mL、0.01lng/mL 以及 Ong/mL ；该九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液作为系列标准溶液，将该九种不同浓度的莱克多巴胺溶液各自与质量体积浓度为3.34 μ g/mL的抗体溶液等体积混合，在37°C恒温箱中干燥孵育IOmin后，以每孔100 μ L加入到步骤4制备好的酶标板中，在37°C恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法,洗板三次,拍干；将质量体积浓度I μ g/mL的二抗溶液以每孔100 μ L加入到酶标板内，在37°C恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100 μ L步骤3配制的显色液，放入37°C恒温箱中干燥孵育lOmin，充分显色；每孔加入50 μ L步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm,在5min之内测定每孔的吸光值,并以LogC为横坐标,LnA/(A。-A)为纵坐标，(C为标准溶液的浓度、A为各标准溶液所测吸光度、A0为空白吸光度)，绘制如图1所示的系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线；该标准曲线的回归方程为:y=-0.5356x-0.4146，相关系数 R2=0.9799 ；
同时作空白实验，以空白作参比；
步骤6:精确称取2.0Og待测定的纯瘦肉置于50mL离心管中，加入4mL甲醇，混匀，超声提取5~lOmin, 5000r/min离心5分钟,取上清液ImL,氮吹仪吹干,用步骤I配制的磷酸盐缓冲液复原至lmL，得样品制备液；
步骤7:将样品制备液与质量体积浓度为3.34 μ g/mL的抗体溶液等体积混合，在37°C恒温箱中干燥孵育IOmin后，以每孔100 μ L加入到步骤4制备好的酶标板中，在37°C恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法,洗板三次,拍干；将质量体积浓度I μ g/mL的二抗溶液以每孔100 μ L加入到酶标板内，在37°C恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100 μ L步骤3配制的显色液，放入37°C恒温箱中干燥孵育lOmin，充分显色；每孔加入50 μ L步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm,在5min之内测定每孔的吸光值；
步骤8:根据步骤7测得的样品制备液的吸光度值，从步骤5绘制的系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线上找到该吸光度值对应的莱克多巴胺的含量，按下式计算待测动物源性制品中莱克多巴胺的含量X:
【权利要求】
1.一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法，具体按以下步骤进行: 步骤1:称取氯化钠4.0OOOg、十二水合磷酸氢二钠1.4500g、氯化钾0.1OOOg和磷酸二氢钾0.lOOOg，混合，超纯水溶解并定容至500mL，得磷酸盐缓冲液； 称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合，超纯水溶解并定容至500mL，得碳酸盐缓冲液； 称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g,混合,超纯水溶解并定容至500mL，得底物缓冲液； 步骤2:称取牛血清白蛋白lg，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得BSA封闭液； 取500mL步骤I中的磷酸盐缓冲液，加入250 μ L吐温-20，得到PBST洗液； 称取3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺0.01OOg，溶于2mL 二甲基亚砜中，得到TMB底物液； 取20.0OmL小牛血清、5.0Og蔗糖、1.0Og牛血清白蛋白和0.01g叠氮化钠，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得抗体稀释液； 取5.0Og鹿糖和1.0Og牛血清白蛋白，用步骤I中的磷酸盐缓冲液定容至IOOmL,得到二抗稀释液； 步骤3:分别取质量百分比 浓度为10%的双氧水溶液21 μ L、步骤I配制的底物缓冲液IOmL以及步骤2配制的TMB底物液200 μ L，混合，得到显色液； 称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL水中，此时该溶液会放热，待溶液恢复至常温定容至500mL，得到摩尔体积浓度2mol/L的硫酸终止液； 在盛放抗体的塑料容器中预先加满步骤2制得的抗体稀释液，放入37°C恒温箱中干燥孵育90min ;甩干容器内液体，得到封闭好的抗体盛放容器； 在盛放二抗的塑料容器中预先加满步骤2制得的二抗稀释液，放入37°C恒温箱中干燥孵育90min ;甩干容器内液体，得到封闭好的二抗盛放容器，干燥保存在4°C冰箱； 用步骤I制得的碳酸盐缓冲液将抗原蛋白稀释成质量体积浓度为5 μ g/mL的抗原蛋白溶液，并保存在4°C下； 在封闭好的抗体盛放容器中，用步骤2中的抗体稀释液将抗体稀释成质量体积浓度为.3.34 μ g/mL的抗体溶液，并保存在4°C下； 在封闭好的二抗盛放容器中，用步骤2制得的二抗稀释液将二抗稀释成质量体积浓度为I μ g/mL的二抗溶液，并保存在4°C下； 步骤4:将步骤3制得的抗原蛋白溶液以每孔100 μ L加入到酶标板内，加盖放入4°C冰箱中干燥孵育24h，倒出孔内液体，甩干；每孔中加入PBST洗涤液300 μ L进行洗板，共洗板四次，拍干；然后每孔中加入1%BSA封闭液100μ L，在37°C恒温箱中干燥孵育90min后，重复洗板过程四次，拍干； 步骤5:用步骤I制得的碳酸盐缓冲液稀释莱克多巴胺标准品，制成九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液，该九个莱克多巴胺溶液的质量体积浓度分别为:lng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、l.lng/mL、0.44ng/mL、0.llng/mL、0.044ng/mL、0.01lng/mL 以及 Ong/mL ；该九个不同质量体积浓度的莱克多巴胺溶液作为系列标准溶液，将该九种不同浓度的莱克多巴胺溶液各自与质量体积浓度为3.34 μ g/mL的抗体溶液等体积混合，在37°C恒温箱中干燥孵育IOmin后，以每孔100 μ L加入到步骤4制备好的酶标板中，在37°C恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法,洗板三次,拍干；将质量体积浓度I μ g/mL的二抗溶液以每孔100 μ L加入到酶标板内，在37°C恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100 μ L步骤3配制的显色液，放入37°C恒温箱中干燥孵育lOmin，充分显色；每孔加入50 μ L步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm，在5min之内测定每孔的吸光值，绘制系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线； 同时作空白实验，以空白作参比； 步骤6:称取2.0Og待测定的纯瘦肉置于50mL离心管中，加4mL甲醇，混匀，超声提取.5~lOmin, 5000r/min离心5分钟,取上清液ImL,氮吹仪吹干,用步骤I配制的磷酸盐缓冲液复原至lmL，得样品制备液； 步骤7:将样品制备液与抗体溶液等体积混合，在37°C恒温箱中干燥孵育IOmin后，以每孔100 μ L加入到步骤4制备好的酶标板中，在37°C恒温箱中干燥孵育30min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；将质量体积浓度I μ g/mL的二抗溶液以每孔.100 μ L加入到酶标板内，在37°C恒温箱中干燥孵育20min，反应结束后用步骤4的洗板方法，洗板三次，拍干；每孔加入100 μ L步骤3配制的显色液，放入37°C恒温箱中干燥孵育.IOmin,充分显色；每孔加入50 μ L步骤3配制的硫酸终止液，轻轻振荡混匀；酶标仪波长设定为450nm,在5min之内测定每孔的吸光值； 步骤8:根据步骤7测得的样品制备液的吸光度值，从步骤5绘制的系列莱克多巴胺标准溶液的工作曲线上找到该吸光度值对应的莱克多巴胺的含量，按下式计算待测动物源性制品中莱克多巴胺的含量X:
2.根据权利要求1所述动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法，其特征在于，步骤I中所配制的溶液均需过0.22 μ m微孔滤膜除菌，并保存在4°C下。
【文档编号】G01N33/558GK103823056SQ201410071091
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】周鑫櫆, 洪霞, 钱滢文 申请人:甘肃省商业科技研究所