一种λ核酸外切酶活性测定方法
【专利摘要】本发明公开了一种λ核酸外切酶活性测定方法，所述方法包括以下步骤：获得一条链的5'端磷酸化的双链DNA，然后以该双链DNA为底物在λ核酸外切酶存在下在反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果推导出λ核酸外切酶的活性程度。本发明方法与现有技术的方法相比，无放射性污染，操作简单快捷，灵敏度高。
【专利说明】一种λ核酸外切酶活性测定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生化【技术领域】，具体来说涉及一种λ核酸外切酶活性测定方法。
【背景技术】
[0002] λ核酸外切酶由λ噬菌体核酸外切酶基因编码。λ核酸外切酶作用于双链DNA， 沿5' -3'方向逐步切去7单核苷酸，最适底物是5'磷酸化的双链DNA。
[0003] λ核酸外切酶是基因工程技术中一种重要的工具酶，可用于制备单链DNA模板。 标准的测活方法采用放射性同位素法，即首先合成一条5'末端带 32Ρ标记dATP的双链DNA。 入核酸外切酶活性可将[32P]-dATP切除。再经过TCA沉淀、whatman滤纸过滤，通过测定酸 可溶性物质中放射性的含量，计算λ核酸外切酶活性。这种方法易产生放射性污染，且步 骤多、周期长，难以实现高通量、自动化。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的λ核酸外切酶测活方法。本发 明原理如图1所示。
[0005] 具体来说，本发明采用的是以下技术方案： 一种λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得一条链 的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在λ核酸外切酶存在下在反 应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结果 推导出λ核酸外切酶的活性程度。
[0006] 优选地，双链DNA或单链DNA的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且 双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光强度表示的。更优选，所采用的荧光染料是双链DNA 特异性荧光染料。在一个实施方案中，所采用的染料是成熟的商用双链DNA特异性荧光染 料，例如picogreen染料。
[0007] 在一个实施方案中，所采用的双链线性DNA模板是以λ DNA为底物，在正向和反向 弓丨物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链DNA，以便于建立标准的检测体系，其中所用的 正向和反向引物中的一者的5'端具有磷酸化基团。在一个相应的实施方案中，所用正向引 物为 5' -aataacgtcggcaactttgg-3'，反向引物为 5' -gttacgccaccagtcatcct-3'。
[0008] 本发明的优点： 1. 无放射性污染； 2. 操作步骤简单快速，无需TCA沉淀、洗涤、干燥、洗脱步骤；可实现高通量、自动化的 活性测定。
[0009] 3.灵敏度高，可检测到10 mU的λ核酸外切酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是本发明的测定方法的原理图。
[0011] 图2是通过本发明方法测定活性获得荧光活性曲线图。
【具体实施方式】
[0012] 本发明的目的是建立一种简便、快速、非放射性的λ核酸外切酶测活方法。本发 明原理如图1所示。
[0013] 如图1所示，λ核酸外切酶可以将一端磷酸化的双链DNA降解为单链DNA，双链 DNA可被双链特异性的picogreen染料结合，产生突光；而picogreen染料不能结合单链 DNA，从而不能产生荧光。λ核酸外切酶的活性在一定范围内单链DNA产物的量成正比，因 此其活性就可以用Picogreen荧光强度来进行测定。
[0014] 举例来说，本发明的测定方法涉及以下方面： 1.磷酸化双链DNA的制备 引物 F (5' 磷酸化修饰）：5' -aataacgtcggcaactttgg-3' ； 引物 R :5' -gttacgccaccagtcatcct-3' ； PCR模板：入DNA PCR反应：
【权利要求】
1. 一种λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：获得一条 链的5'端磷酸化的双链线性DNA，然后以该双链线性DNA为底物在λ核酸外切酶存在下在 反应体系中反应，反应完成后测定反应体系中单链DNA或双链DNA的相对量，并由该检测结 果推导出λ核酸外切酶的活性程度。
2. 如权利要求1所述的λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，双链DNA或单链DNA 的相对量是利用荧光染料，通过荧光法测得的，并且双链DNA或单链DNA的相对量是以荧光 强度表不的。
3. 如权利要求2所述的λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所采用的荧光染料 是双链DNA特异性荧光染料。
4. 如权利要求3所述的λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所采用的染料是 picogreen 染料。
5. 如权利要求1所述的λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所采用的双链线 性DNA模板是以λ DNA为底物，在正向和反向引物的存在下通过PCR扩增获得的线性双链 DNA，其中所用的正向和反向引物中的一者的5'端具有磷酸化基团。
6. 如权利要求5所述的λ核酸外切酶活性测定方法，其特征在于，所用正向引物为 5，-aataacgtcggcaactttgg-3，，反向弓|物为 5，-gttacgccaccagtcatcct-3，。
【文档编号】G01N21/64GK104297221SQ201410502144
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】徐晓昱 申请人:南京诺唯赞生物科技有限公司