纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种SrTiO3/CoO-WO3纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及其应用，属于生物传感检测【技术领域】。基于SrTiO3/CoO-WO3复合物作为信标物质，可实现对实体组织目标DNA及其管家基因的定性、定量检测，具有设备简单、成本低、易于微型化的优点。
【专利说明】-种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制 备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法及 其应用，该传感器用于的生物组织DNA的检测，属于生物传感检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 基因科技与DNA检测是近几年来人们非常热门的话题，随着对基因科技的深入研 究，人类基因组计划的完成，人类已经破解了生命的秘码，人类社会发展到今天，基因科技 已经逐渐被人们所掌握，并利用来造福于人类自身。基因科技产业就是在这种大背景下应 运而生的前沿性的高科技产业。
[0003] 美国是全世界最早利用基因检测预测疾病的国家，2005年已有近500万人次接受 了检测，通过预知和医学干预，使大肠癌的发病率下降了 90%，乳腺癌的发病率下降了 70%。 中国在基因检测方面相对滞后，截至2006年底才有约10万人次接受了检测。而中国近五 年癌症患者高达750万人，不到20年癌症发病率增长了 29%以上，每年约有160万人死于 癌症。据统计表明，我国因疾病导致的经济损失高达14000亿元。中国基因领域著名科学 家毛裕民指出，基因检测是人们为了解基因的个体特征而进行的基因特征的检测，这种检 测为人类的一系列生理病理找到了依据和途径。中国有超过10万人进行过基因检测，有超 过10万多人的从业队伍，从事着基因检测的工作。这一现状远远不能满足社会的需要，将 会有一个大的跨越式的发展。公安及医学上的DNA检测就是基因检测的一种。
[0004] 生物基因领域众多基因和疾病、基因和健康间的科学发现和成果亟待转化为现实 生产力，服务于社会大众。企业参与科技创新，与科技界联手，实现科技成果的转化，共同为 国民经济的发展做贡献，已经成为全社会的共识。验证和完善实验室科研成果，并为我国生 命科学的深化研究，积聚巨量数据库和大群体样本库，搭建新的技术平台和支撑系统。
[0005] 鉴于此，本专利将利用SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的信号放大作用，利用体系 中光致电信号的强度变化来对真实生物细胞经培养后抽提的DNA目标片段进行检测，并将 所研制的光电生物传感器进一步推广到实际应用中，该方法具有成本低、灵敏度高、特异性 好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，大大克服了目前DNA检测方法局限于纯生物 领域的弊端，有效拓展了DNA检测方法的范围。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是基于组氨酸对DNA的生物特异亲和性及SrTi03/Co0-W03纳米 复合材料，制备了一种具备特异性，超灵敏的光电生物传感器； 本发明的目的之二是将该传感器用于实体组织抽提的DNA的检测。
[0007] 本发明的技术方案如下： 1. 一种SrTi03/Co0-W03m米复合材料光电适配体传感器的制备方法，步骤如下： (1)将1.0cmX2. 5cm的长方形IT0导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0. 1V/s扫 速，扫描1(T15圈，电位范围为-0. 8?2. 0V，在含有0. 01、. 05mol/L的L-组氨酸、pH为 7. (T9. 0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组 氨酸，真空干燥器中保存； (2) 滴涂2(T50ML的SrTi03/Co0-W03纳米复合材料到（1)修饰的工作电极表面，4°C 冰箱中晚干； (3) 继续滴涂10?20ML、5?50Pg/mL的目标DNA的上游引物或10?20ML、1(T20Pg/mL 管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干； (4) 继续滴涂10?20ML、5?50Pg/mL的目标DNA的下游引物或10?20ML、1(T20Pg/mL 管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种SrTi03/C〇0-W03m米复合 材料光电适配体传感器。
[0008] 2?上述SrTi03/Co0_W03纳米复合材料的制备步骤如下： (1) SrTi03固体的制备 将:T5g11(011)4固体粉末，加入到含有0.047?0. 189mol/L的Sr(N03)2溶液中，真 空干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5°C/min的升温速率升至40CT600 °C，焙烧6~10h，去离子水冲洗4~8次，过滤，真空干燥，制得SrTi03固体； 所述的11(011)4固体粉末，是将8~12g钛酸正丁酯溶于100mL的无水乙醇中，充分搅 拌溶解，逐滴滴加超纯水8~12mL，5000r/min离心5~15min，取沉淀，真空干燥，制得白色 的Ti(0H)4固体粉末； 所述的Sr(N03)2溶液，是将0. 1?0. 4g的Sr(N03)2固体粉末和0. 1?0. 4gK0H固体粉 末，溶于10mL的超纯水，制得的0. 047?0. 189mol/L的Sr(N03)2溶液； (2) SrTi03/Co0固体的制备 将（1)制得的SrTi03固体0.3?0.7g溶于4?8mL、0?广0.3mol/L的C〇(N03)2溶液中， 浸渍18~36h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2~5 °C/min的速率升温至500 °C，500 °C下氧化0. 5?2h，制得SrTi03/Co0黑色固体粉末； (3) SrTi03/Co0凝胶的制备 将（2)制得的0. 4~1gSrTi03/Co0黑色固体粉末溶于广3ml超纯水中，室温下震荡 1?3h，制得SrTi03/Co0凝胶； (4) W03固体的制备 将4~8g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 °C/min的速率升至500 °C，在500 °C下 煅烧2?4h，冷却，真空干燥，制得W03固体； (5) SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 将0. 3?0. 6 g SrTi03/Co0凝胶和0. 1?0. 3 g 103固体溶于1?4 mL的超纯水，室温下震 荡18~24h，制得SrTi03/Co0-W03纳米复合材料。
[0009] 3?目标DNA及其管家基因的检测步骤 (1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为 辅助电极，所制备的SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在1(T50 mL、pH7、的PBS，0.f〇. 3mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试； (2) 用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为 0. 1V，取样间隔20S，取样时间20S，运行时间400S，光源选择365nm、385nm、405nm、 430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线； (3 )将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法 进行测定。
[0010] 本发明的有益成果： (1 )L-组氨酸有良好的热稳定性、生物亲和性，本发明中将L-组氨酸进行电聚合，修饰 于IT0电极表面，提供了可保持生物活性的固载DNA等生物大分子的方法，同时该方法不需 经过预处理，电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围10pmol/L~ 30 nmol/L，检测限为 5. 4pmol/L。
[0011] (2)本发明使用SrTi03/Co0-W03纳米复合材料，做为光电信标物质，，利用能带匹 配的特性使得SrTi03、C〇0、W03三者的光电特性均有大幅度增强，大大提高了本发明所述 传感器的光电性能。
[0012] (3)本发明所检测DNA均从实际生物肿瘤组织中提取，具有一定的实用价值。
[0013]
【具体实施方式】： 为进一步说明，结合一下实施例具体说明： 实施例1 一种SrTi03/C〇0-W03m米复合材料光电适配体传感器的制备方法 (1) 将1.0cmX2. 5cm的长方形IT0导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0. 1V/s扫 速，扫描10圈，电位范围为_〇. 8?2. 0V，在含有0. 01mol/L的L-组氨酸、pH为7. 4的PBS 中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥 器中保存； (2) 滴涂20ML的SrTi03/Co0-W03纳米复合材料到（1)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱 中瞭干 (3) 继续滴涂10ML、5Pg/mL的目标DNA的上游引物或10ML、10Pg/mL管家DNA的上 游引物到工作电极表面，4°C冰箱中晾干； (4) 继续滴涂10ML、5 吒/mL的目标DNA的下游引物或10ML、10 吒/mL管家DNA的下 游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电适 配体传感器。
[0014] 实施例2 -种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法 (1) 将1.0cmX2. 5cm的长方形IT0导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30min，纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0. 1V/s扫 速，扫描12圈，电位范围为-0.8?2.0V，在含有0.03mol/L的L-组氨酸、pH为8.0的PBS 中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥 器中保存； (2) 滴涂30ML的SrTi03/Co0-W03纳米复合材料到（1)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱 中晚干； (3) 继续滴涂15ML、25Pg/mL的目标DNA的上游引物或15ML、15Pg/mL管家DNA的 上游引物到工作电极表面，4°C冰箱中晾干； (4) 继续滴涂15ML、25Pg/mL的目标DNA的下游引物或15ML、15Pg/mL管家DNA的下游 引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种SrTi03/C〇0-W03m米复合材料光电适配 体传感器。
[0015] 实施例3 -种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法 (1) 将1.0cmX2. 5cm的长方形IT0导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0. 1V/s扫 速，扫描15圈，电位范围为-0.81.0V，在含有0.05mol/L的L-组氨酸、pH为9.0的PBS 中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组氨酸，真空干燥 器中保存； (2) 滴涂50ML的SrTi03/Co0-W03纳米复合材料到（1)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱 中晚干； (3) 继续滴涂20ML、50Pg/mL的目标DNA的上游引物或20ML、20Pg/mL管家DNA的 上游引物到工作电极表面，4°C冰箱中晾干； (4) 继续滴涂20ML、50Pg/mL的目标DNA的下游引物或20ML、20Pg/mL管家DNA的 下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电 适配体传感器。
[0016] 实施例4SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 (1) SrTi03固体的制备 将3gTi(0H)4固体粉末，加入到含有0. 047mol/L的Sr(N03)2溶液中，真空干燥得固 体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 °C/min的升温速率升至400 °C，焙烧6h，去 离子水冲洗4次，过滤，真空干燥，制得SrTi03固体； 所述的11(011)4固体粉末，是将8g钛酸正丁酯溶于100mL的无水乙醇中，充分搅拌 溶解，逐滴滴加超纯水8mL，5000r/min离心5min，取沉淀，真空干燥，制得白色的Ti(0H)4 固体粉末； 所述的Sr(N03)2溶液，是将0. 1g的Sr(N03)2固体粉末和0. 1K0H固体粉末，溶于10mL的超纯水，制得的0? 047mol/L的Sr(N03)2溶液； (2) SrTi03/Co0固体的制备 将（1)制得的SrTi03固体0. 3g溶于4mL、0. 1mol/L的C〇(N03)2溶液中，浸渍18h， 真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2 °C/min的速率升温至500 °C，500 °C下氧化0.5 h，制得SrTi03/C〇0黑色固体粉末； (3) SrTi03/Co0凝胶的制备 将（2)制得的0. 4gSrTi03/Co0黑色固体粉末溶于1ml超纯水中，室温下震荡1h， 制得SrTi03/C〇0凝胶； (4) W03固体的制备 将4g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 °C/min的速率升至500 °C，在500 °C下煅 烧2h，冷却，真空干燥，制得W03固体； (5) SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 将0. 3gSrTi03/Co0凝胶和0. 1gW03固体溶于lmL的超纯水，室温下震荡18h，制 得SrTi03/Co0-W03纳米复合材料。
[0017] 实施例5SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料的制备 (1) SrTi03固体的制备 将4g11(011)4固体粉末，加入到含有0. 1mol/L的Sr(N03)2溶液中，真空干燥得固体 粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 °C/min的升温速率升至500 °C，焙烧8h，去离 子水冲洗6次，过滤，真空干燥，制得SrTi03固体； 所述的11(011)4固体粉末，是将10g钛酸正丁酯溶于100mL的无水乙醇中，充分搅 拌溶解，逐滴滴加超纯水10mL，5000r/min离心10min，取沉淀，真空干燥，制得白色的 Ti(0H)4固体粉末； 所述的Sr(N03)2溶液，是将0. 21g的Sr(N03)2固体粉末和0. 2gK0H固体粉末，溶于 10mL的超纯水，制得的0? 1mol/L的Sr(N03)2溶液； (2) SrTi03/Co0固体的制备 将（1)制得的SrTiO固体0. 5g溶于7mL、0. 2mol/L的C〇(N03)2溶液中，浸渍24h， 真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以3 °C/min的速率升温至500 °C，500 °C下氧化1h， 制得SrTi03/C〇0黑色固体粉末； (3) SrTi03/Co0凝胶的制备 将（2)制得的0. 8gSrTi03/Co0黑色固体粉末溶于2ml超纯水中，室温下震荡2h， 制得SrTi03/C〇0凝胶； (4) W03固体的制备 将6g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 °C/min的速率升至500 °C，在500 °C下煅 烧3h，冷却，真空干燥，制得W03固体； (5) SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 将0. 4gSrTi03/Co0凝胶和0. 2g103固体溶于2mL的超纯水，室温下震荡20h，制 得SrTi03/Co0-W03纳米复合材料。
[0018] 实施例6SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 (1) SrTi03固体的制备 将5g11(011)4固体粉末，加入到含有0. 189mol/L的Sr(N03)2溶液中，真空干燥得固 体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5 °C/min的升温速率升至600 °C，焙烧10h，去 离子水冲洗8次，过滤，真空干燥，制得SrTi03固体； 所述的11(011)4固体粉末，是将12g钛酸正丁酯溶于100mL的无水乙醇中，充分搅 拌溶解，逐滴滴加超纯水12mL，5000r/min离心15min，取沉淀，真空干燥，制得白色的 Ti(0H)4固体粉末； 所述的Sr(N03)2溶液，是将0.4g的Sr(N03)2固体粉末和0.4gK0H固体粉末，溶于 10mL的超纯水，制得的0? 189mol/L的Sr(N03)2溶液； (2) SrTi03/Co0固体的制备 将（1)制得的SrTi03固体0. 7g溶于8mL、0. 3mol/L的C〇(N03)2溶液中，浸渍36h， 真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以5°C/min的速率升温至500 °C，500 °C下氧化2h， 制得SrTi03/C〇0黑色固体粉末； (3) SrTi03/Co0凝胶的制备 将（2)制得的lgSrTi03/Co0黑色固体粉末溶于3ml超纯水中，室温下震荡3h，制得SrTi03/Co0 凝胶； (4) W03固体的制备 将8g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 °C/min的速率升至500 °C，在500 °C下煅 烧4h，冷却，真空干燥，制得W03固体； (5) SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 将0. 6gSrTi03/Co0凝胶和0. 3gW03固体溶于4mL的超纯水，室温下震荡24h，制 得SrTi03/Co0-W03纳米复合材料。
[0019] 实施例7目标DNA的检测 (1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极 为辅助电极，所制备的SrTi03/C〇0-W03m米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在10 mL、pH7的PBS，0.lmmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试； (2) 用时间-电流法对目标DNA标准溶液进行检测，输入电压为0.1V，取样间隔20s， 取样时间 20s，运行时间 400s，光源选择 365nm、385nm、405nm、430nm、450nm、530nm、 570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线； (3) 将待测样品代替目标DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法进行测定； (4) 线性范围 10pmol/L?30nmol/L，检测限为 5.4pmol/L。
[0020] 实施例8管家基因的检测 (1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极 为辅助电极，所制备的SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在50 mL、pH9的PBS，0. 3mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试； (2 )用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为 〇. 1V，取样间隔20s，取样时间20s，运行时间400s，光源选择365nm、385nm、405nm、 430nm、450nm、530nm、570nm、600nm，记录电流变化，绘制工作曲线。
【权利要求】
1. 一种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法，其特征在于，包 括以下步骤： (1)将1.0 cmX 2. 5 cm的长方形ITO导电玻璃依次用丙酮、超纯水、乙醇超声清洗30 min，纯氮吹干，将其作为工作电极，钼丝为对电极，参比电极为饱和甘汞电极，以0. 1 V/s扫 速，扫描1(T15圈，电位范围为-0. 8?2. 0 V，在含有0. 01、. 05 mol/L的L-组氨酸、pH为
7. (T9. 0的PBS中，利用循环伏安技术，于工作电极表面电聚合L-组氨酸，形成一层聚L-组 氨酸，真空干燥器中保存； 滴涂20?50ML的SrTi03/Co0-W03纳米复合材料到（1)修饰的工作电极表面，4 °C冰箱 中晚干； (3) 继续滴涂10?20 ML、5?50 Pg/mL的目标DNA的上游引物或10?20 ML、1(T20 Pg/mL 管家DNA的上游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干； (4) 继续滴涂10?20 ML、5?50 Pg/mL的目标DNA的下游引物或10?20 ML、1(T20 Pg/mL 管家DNA的下游引物到工作电极表面，4 °C冰箱中晾干，制得一种SrTi03/C〇0-W03m米复合 材料光电适配体传感器。
2. -种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配体传感器的制备方法，所述SrTi0 3/ C〇0_W03纳米复合材料，制备步骤如下： (1) SrTi03固体的制备 将:T5 g 11(011)4固体粉末，加入到含有0.047?0. 189 mol/L的Sr(N03)2溶液中，真空 干燥得固体粉末，将所得固体粉末置于马弗炉中，以5°C /min的升温速率升至40(T60(TC， 焙烧6~10 h，去离子水冲洗4~8次，过滤，真空干燥，制得SrTi03固体； 所述的11(011)4固体粉末，是将8~12 g钛酸正丁酯溶于100 mL的无水乙醇中，充分搅 拌溶解，逐滴滴加超纯水8~12 mL，5000 r/min离心5~15min，取沉淀，真空干燥，制得白色的 Ti(0H)4固体粉末； 所述的Sr(N03)2溶液，是将0. 1?0. 4 g的Sr(N03)2固体粉末和0. 1?0. 4 g K0H固体粉 末，溶于10 mL的超纯水，制得的0. 047?0. 189 mol/L的Sr(N03)2溶液； (2) SrTi03/Co0固体的制备 将（1)制得的SrTi03固体0.3?0.7 g溶于4?8 mL、0?广0.3 mol/L的C〇(N03)2溶液中， 浸渍18~36 h，真空干燥，将所得溶液置于马弗炉，以2~5 °C/min的速率升温至500 °C，500 °C下氧化0. 5?2 h，制得SrTi03/Co0黑色固体粉末； (3) SrTi03/Co0凝胶的制备 将（2)制得的0. 4~1 g SrTi03/Co0黑色固体粉末溶于广3 ml超纯水中，室温下震荡 1?3 h，制得SrTi03/Co0凝胶； (4) W03固体的制备 将4~8 g钨粉，置于坩埚中，在马弗炉内以2 °C/min的速率升至500 °C，在500 °C下 煅烧2?4 h，冷却，真空干燥，制得W03固体； (5) SrTi03/Co0-W03纳米复合材料的制备 将0. 3?0. 6 g SrTi03/Co0凝胶和0. 1?0. 3 g 103固体溶于1?4 mL的超纯水，室温下震 荡18~24 h，制得SrTi03/Co0-W03纳米复合材料。
3. 如权利要求1所述的制备方法制备的一种SrTi03/Co0-W03纳米复合材料光电适配 体传感器，其特征在于，用于目标DNA及其管家基因的检测，检测步骤如下： (1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，钼丝电极为 辅助电极，所制备的SrTi03/C〇0-W03纳米复合材料光电适配体传感器为工作电极，在1(T50 mL、pH 7、的PBS，0. f〇. 3 mmol/L的抗坏血酸缓冲溶液中进行测试； (2) 用时间-电流法对目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液进行检测，输入电压为 〇. 1 V，取样间隔20 s，取样时间20 s，运行时间400 s，光源选择365 nm、385 nm、405 nm、 430 nm、450 nm、530 nm、570 nm、600 nm，记录电流变化，绘制工作曲线； (3 )将待测样品代替目标DNA标准溶液或管家DNA标准溶液，按照工作曲线的绘制方法 进行测定。
【文档编号】G01N27/327GK104330454SQ201410601204
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年11月1日 优先权日:2014年11月1日
【发明者】庞雪辉, 魏琴, 吴丹, 范大伟, 王友英, 任伟 申请人:济南大学