一种预处理方法及果胶的检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种预处理方法及果胶的检测方法。该预处理方法包括以下步骤：(1)将待测果胶样品在碱性溶液中进行蛋白质沉淀，分离得滤液；(2)向将步骤(1)所得的滤液中加入乙醇的浓度至50％体积分数以上，进行沉淀处理，分离得沉淀；(3)将步骤(2)所得的沉淀溶于水得溶液A，加入乙醇的浓度至50％体积分数以上，进行二次沉淀处理，分离得沉淀；(4)将步骤(3)所得的沉淀溶于水，得溶液。本发明可以用于检测乳饮料中的果胶含量，实验的步骤简单、准确度高、重现性好，且预处理过程在尽可能除去了中性糖和乳蛋白的同时，又减少了果胶的损失。
【专利说明】一种预处理方法及果胶的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种预处理方法及果胶的检测方法。
【背景技术】
[0002] 果胶是一类高分子碳水化合物，其分子主链是由α -1，4-糖苷键连接起来的半乳 糖醛酸链构成的。因此，通常用半乳糖醛酸的含量计算样品中的果胶含量。
[0003] 由于糖类物质大都不吸收紫外光，故在测定果胶中半乳糖醛酸含量时，必须将其 转化衍生后方可进行测定。目前国内常用的测定糖醛酸含量的方法为硫酸咔唑法或间羟基 联苯法。在实际工作中，往往发现测得的结果与实际情况不符，主要原因是乳饮料中的中性 己糖和戊糖对实验结果的干扰，影响糖醛酸含量测定的准确性。
[0004] 间羟基联苯法测定果胶含量步骤如下：首先糖醛酸与含四硼酸钠的硫酸溶液在高 温作用下水解，水解产物进一步与间羟基联苯反应，生成粉红色衍生物，产生紫外吸收，且 在一定浓度范围内，该衍生物吸收值与糖醛酸含量呈线性关系，可通过比色法对糖醛酸含 量进行计算。
[0005] 与硫酸咔唑法相比较，间羟基联苯法对糖醛酸显色的专一性强，但是当中性糖含 量较多时，中性糖会与硫酸反应碳化生产褐色物质，导致吸光度的增加，严重影响实验结 果。乳饮料中一般含有较高含量的葡萄糖、蔗糖、乳糖等中性糖，而起稳定剂作用的果胶的 添加量极少，因此中性糖的存在严重干扰果胶含量的测定，如牛奶中乳糖的含量45g/L左 右，调制乳中一般还会添加40g/L_80g/L的蔗糖，而起稳定剂作用的果胶的含量一般小于 5g/L，当采用间羟基联苯法时，中性糖的存在对产品中果胶的检测影响很大。所以采取间羟 基联苯法测定乳饮料中果胶含量时，如何解决中性糖的干扰是十分重要的。
[0006] 现有技术一般检测半乳糖醛酸的方法为液相的方法，实验繁琐，而且不一定适用 于乳饮料，只能够检测水溶液。如何检测乳饮料的果胶的含量是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007] 本发明克服了现有技术中当采用间羟基联苯法测定果胶含量时，预处理过程后中 性糖和乳蛋白含量相对较高，由于中性糖干扰导致准确性低、重现性差和果胶损失较多，以 及现有技术中检测半乳糖醛酸的方法为液相，实验繁琐只能检测水溶液，不一定适用于乳 饮料的缺陷，提供了一种预处理方法及果胶的检测方法。本发明可以用于检测乳饮料中的 果胶含量，实验的步骤简单、准确度高、重现性好，且预处理过程在尽可能除去了中性糖和 乳蛋白的同时，又减少了果胶的损失。
[0008] 本发明通过以下技术方案解决上述技术问题。
[0009] 本发明提供了一种预处理方法，其包括以下步骤：
[0010] (1)将待测果胶样品在碱性溶液中进行蛋白质沉淀，分离得滤液；
[0011] (2)向将步骤（1)所得的滤液中加入乙醇的浓度至50%体积分数以上，进行沉淀 处理，分离得沉淀；
[0012] (3)将步骤（2)所得的沉淀溶于水得溶液A，加入乙醇的浓度至50%体积分数以 上，进行二次沉淀处理，分离得沉淀；
[0013] (4)将步骤（3)所得的沉淀溶于水，得溶液。
[0014] 步骤（1)中，所述的待测果胶样品一般是指含有果胶的液体待测样品，较佳地为 包含果胶的液态奶制品。
[0015] 步骤（1)中，所述的碱性溶液为本领域内常规的能使蛋白质沉淀的碱性溶液，较 佳地为碳酸钠溶液，碳酸氢钠溶液，氢氧化钾溶液，碳酸钾溶液，碳酸氢钾溶液和氢氧化钠 溶液中的一种或几种，更佳地为氢氧化钠溶液。所述的碱性溶液的溶度较佳地为〇. 5-lmol/ L。所述的碱性溶液与所述的待测果胶样品的体积比较佳地为1:5-1:15,更佳地为1:10。
[0016] 步骤（1)中，所述的分离为本领域内常规，较佳地为离心。所述的离心较佳地转速 为 5000-10000r/min，时间为 5-10 分钟。
[0017] 步骤（2)中，所述的乙醇为本领域内常规的乙醇，所述的加入乙醇的浓度至50% 体积分数以上是通过加入95%体积分数的乙醇溶液实现的，所述的95%体积分数的乙醇 溶液与所述的滤液的体积比较佳地为1:1. 8-1: 4。
[0018] 步骤（2)中，所述的分离为本领域内常规，较佳地为离心。所述的离心较佳地转速 为 5000-10000r/min，时间为 5-10 分钟。
[0019] 步骤（3)中，所述的水为本领域内常规，较佳地为符合GB/T 6682要求的二级水。
[0020] 步骤（3)中，所述的乙醇为本领域内常规的乙醇,所述的加入乙醇的浓度至50% 体积分数以上是通过加入95%体积分数的乙醇溶液实现的；
[0021] 步骤（3)中，所述的二次沉淀处理较佳地为向所述溶液A中第一次加入乙醇离 心沉淀后，第二次再加入乙醇离心沉淀。其中，当所述的加入乙醇的浓度至50%体积分 数以上是通过加入95%体积分数的乙醇溶液实现时，第一次沉淀过程中，所述溶液A与所 述的95%体积分数的乙醇溶液的体积比较佳地为1:1-1:4 ;其中，所述离心较佳地转速为 5000-10000r/min，时间为5-10分钟。第二次沉淀过程中，所述溶液A与所述的95%体积 分数的乙醇溶液的体积比较佳地为1:2-1:4 ;其中，所述离心较佳地转速为5000-10000r/ min，时间为 5-10min。
[0022] 步骤（4)中，所述的水为本领域内常规，较佳地为符合GB/T 6682要求的二级水。 所述的水的用量较佳地为步骤（1)中所述的待测果胶样品的体积的2-20倍。
[0023] 本发明还提供了一种果胶的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：将上述预 处理方法得到的溶液，与四硼酸钠-硫酸溶液混合保温后，水浴冷却，与间羟基联苯氢氧化 钠溶液反应后，525nm处测定吸光度，经标准曲线法测定，即可；
[0024] 其中，所述的吸光度落入0. 3-0. 8范围内时，经标准曲线法测定，即可；若所述的 吸光度不在所述的范围内，调节所述预处理中步骤（4)中水的用量，重复实验，使所述的吸 光度值落入所述的范围内，再经标准曲线法测定，即可。
[0025] 其中，所述的四硼酸钠-硫酸溶液较佳地为每IOOmL浓硫酸中溶解有0. 478g四硼 酸钠。所述的保温的温度较佳地为95°C，所述的保温的时间较佳地为10分钟。
[0026] 其中，所述的间羟基联苯氢氧化钠溶液中，间羟基联苯的浓度为较佳地为I. 5g/L， 氢氧化钠的浓度较佳地为5g/L。所述的间羟基联苯氢氧化钠溶液较佳地为将间羟基联苯溶 液溶于氢氧化钠溶液中形成。所述的反应的时间较佳地为15-20分钟。
[0027] 其中，所述的标准曲线法测定的方法为本领域常规的标准曲线法计算的方法。较 佳的，所述的标准曲线法测定的方法包括以下步骤：用标准品配制标准溶液，标准溶液经上 述果胶检测方法的步骤处理后，分别测定其吸光度，用吸光度对标准工作液中样品的浓度 绘制标准曲线，再在相同的测量条件下测量待测果胶样品的吸光度，根据待测果胶样品的 吸光度和标准曲线计算待测果胶样品的浓度，并计算其含量。更佳的，所述的标准曲线法测 定的方法包括以下步骤：将半乳糖醛酸配置六份浓度为C1_C6(较佳的C1-C6按照梯度变 化）的标准溶液，取相同体积的所述标准溶液分别与四硼酸钠-硫酸溶液混合保温后，水浴 冷却，与间羟基联苯氢氧化钠溶液反应后，525nm处测定吸光度，记作A1-A6 ;根据C1-C6和 A1-A6绘制标准曲线，再在相同的测量条件下，测量待测果糖样品的吸光度，根据待测果糖 样品的吸光度和标准曲线计算待测果糖样品的半乳糖醛酸浓度，并计算果糖的含量。
[0028] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0029] 本发明所用试剂和原料均市售可得，所有试剂均为分析纯。
[0030] 本发明的积极进步效果在于：
[0031] 1、采用本发明预处理方法后进行果胶的检测，实验的步骤简单、准确度高、重现性 好，且前预理过程在尽可能除去了中性糖和乳蛋白的同时，又减少了果胶的损失。
[0032] 2、本发明预处理及果胶的检测方法能够检测乳制品中的果胶的含量，且准确度 高、重现性好。
[0033] 3、本发明不仅能够检测果胶水溶液中果胶的含量，还能够准确检测乳饮料中果胶 的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1的方法检测得到的标准曲线。
【具体实施方式】
[0035] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0036] 若在待测果胶样品中，果胶中半乳糖醛酸的含量是可以直接获得的，可以用本方 法直接测定；若果胶中半乳糖醛酸的含量不能够直接获得，可以根据国标果胶中半乳糖醛 酸含量为65%计算。本实验中lg/L果胶原料中半乳糖醛酸含量为67. 2%。
[0037] 将0. 478g四硼酸钠溶于IOOmL浓硫酸中形成四硼酸钠-硫酸溶液；将间羟基联 苯溶液溶于氢氧化钠溶液中形成间羟基联苯氢氧化钠溶液，在间羟基联苯氢氧化钠溶液， 间羟基联苯的浓度为I. 5g/L，氢氧化钠的浓度为5g/L。下述实施例中均采用上述制备的溶 液。
[0038] 下述实施例中所述的水均为符合GB/T 6682要求的二级水。
[0039] 实施例1
[0040] 标准曲线的制备：
[0041] 半乳糖醛酸标准品购于Sigma公司。
[0042]将半乳糖醒酸配制为 10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L 和 lOOmg/L 的标准 溶液；取不同浓度的标准溶液ImL与5mL四硼酸钠-硫酸溶液混合，95°C保温IOmin后，水 浴冷却，加入100 μ 1间轻基联苯氢氧化钠溶液反应20min后，525nm处测定吸光。
[0043] 以吸光度对半乳糖醛酸的浓度做标准曲线，标准曲线方程为：
[0044] Y = 0. 007X-0. 009, R2 = 0. 9994。其中：X表示半乳糖醛酸浓度，mg/mL ;Y表示吸 光度值。
[0045] 标准曲线如图1所示。
[0046] 实施例2
[0047] 乳饮料中果胶的含量测定
[0048] 1、乳饮料的制备：
[0049] 将690g水预热到60°C，加入蔗糖使其的浓度为50g/L，加入葡萄糖使其的浓度为 10g/L，加入果胶使其的含量为lg/L，搅拌20min，加入酸奶基料250g搅拌20min，并用柠檬 酸调节酸度致60° T，60°C均质，95°C灭菌lOmin，灌装备用。
[0050] 2、检测方法：
[0051] (1)将上述乳饮料10mL，加入ImL lmol/L的氢氧化钠溶液，进行离心，转速为 10000r/min，时间为IOmin取出蛋白质，得滤液；
[0052] (2)取2. 2mL步骤（1)所得的滤液，加入95%体积分数的乙醇溶液4mL，进行离心， 转速为l〇〇〇〇r/min，时间为IOmin,分离得果胶沉淀；
[0053] (3)将步骤⑵所得的沉淀溶于4mL 7jC，加入95%体积分数的乙醇溶液4mL，进行 离心，转速为l〇〇〇〇r/min，时间为lOmin，分离得果胶沉淀，再加入95%体积分数的乙醇溶 液8mL，进行离心，转速为10000r/min，时间为IOmin,分离得果胶沉淀；
[0054] (4)将步骤⑶所得的沉淀溶于20mL 7K，得溶液；
[0055] (5)将步骤⑷所得的溶液ImL与5mL四硼酸钠-硫酸溶液混合95°C保温IOmin 后，水浴冷却，加入100 μ 1间轻基联苯氢氧化钠溶液反应20min后，525nm处测定吸光度为 0. 4362±0. 01。
[0056] 根据实施例1制得的标准曲线方程Y = 0. 007X-0. 009, R2 = 0. 9994 (X表示半乳 糖醛酸浓度，mg/mL ;Y表示吸光度值），计算得到半乳糖醛酸的浓度为636mg/L。
[0057] 实施例3
[0058] 在实施例2乳饮料的制备过程中，加入果胶使其浓度为2g/L，其余工艺参数及测 试条件与实施例2相同。
[0059] 在525nm处测定吸光度值为0. 8493±0. 02,超出吸光度范围0. 3-0. 8,为使实验结 果较为准确，经过两次稀释后测定吸光度值为〇. 4311 ±0. 02。
[0060] 根据实施例1制得的标准曲线方程Y = 0. 007X-0. 009, R2 = 0. 9994 (X表示半乳 糖醛酸浓度，mg/mL ;Y表示吸光度值），计算得到半乳糖醛酸的浓度为1257mg/L。
[0061] 实施例4
[0062] 在实施例2乳饮料的制备过程中，加入果胶使其浓度为3g/L，其余工艺参数及测 试条件与实施例2相同。
[0063] 在525nm处测定吸光度值为1. 4750±0. 03,超出吸光度范围0. 3-0. 8,为使实验结 果较为准确，经过三次稀释后测定吸光度值为〇. 4438 ±0. 02。
[0064] 在525nm处测定吸光度值，根据实施例1制得的标准曲线方程Y = 0. 007X-0. 009， R2 = 0. 9994 (X表示半乳糖醛酸浓度，mg/mL ;Y表示吸光度值），计算得到半乳糖醛酸的浓 度为 1940mg/L。
[0065] 实施例5
[0066] 本实施例为制备标准曲线，其操作中加入间羟基联苯氢氧化钠溶液反应时间为 15min，其余的操作条件与实施例1相同。制备得到相应的标准曲线。
[0067] 实施例6
[0068] 1、乳饮料的制备：
[0069] 具体制备如实施例2。
[0070] 2、检测方法：
[0071] (1)将上述乳饮料15mL，加入ImL 0· 5mol/L的碳酸钠溶液，进行离心，转速为 5000r/min，时间为5min，取出蛋白质，得滤液；
[0072] (2)取2mL步骤⑴所得的滤液，加入95%体积分数的乙醇8mL，进行离心，转速为 5000r/min，时间为5min，分离得果胶沉淀；
[0073] (3)将步骤⑵所得的沉淀溶于4mL水，加入95 %体积分数的乙醇16mL，进行离 心，转速为5000r/min，时间为5min，分离得果胶沉淀，再加入95%体积分数的乙醇16mL，进 行离心，转速为5000r/min，时间为5min，分离得果胶沉淀；
[0074] (4)将步骤⑶所得的沉淀溶于300mL 7K，得溶液；
[0075] (5)将步骤⑷所得的溶液ImL与5mL四硼酸钠-硫酸溶液混合95°C保温IOmin 后，水浴冷却，加入100 μ 1间轻基联苯氢氧化钠溶液反应15min后，525nm处测定吸光度。
[0076] 根据实施例5制得的标准曲线方程计算得到半乳糖醛酸的浓度与实际值想符合。
[0077] 实施例7
[0078] 1、乳饮料的制备：
[0079] 具体制备如实施例2。
[0080] 2、检测方法：
[0081] (1)将上述乳饮料IOmL,加入2mL 0. 8mol/L的碳酸氢钠溶液，进行离心，转速为 8000r/min，时间为8min，取出蛋白质，得滤液；
[0082] (2)取2mL步骤⑴所得的滤液，加入95%体积分数的乙醇6mL，进行离心，转速为 8000r/min，时间为8min，分离得果胶沉淀；
[0083] (3)将步骤⑵所得的沉淀溶于4mL 7jC，加入95 %体积分数的乙醇12mL，进行离 心，转速为8000r/min，时间为8min，分离得果胶沉淀，再加入95%体积分数的乙醇12mL，进 行离心，转速为8000r/min，时间为8min，分离得果胶沉淀；
[0084] (4)将步骤（3)所得的沉淀溶于IOOmL 7K，得溶液；
[0085] (5)将步骤⑷所得的溶液ImL与5mL四硼酸钠-硫酸溶液混合95°C保温IOmin 后，水浴冷却，加入100 μ 1间轻基联苯氢氧化钠溶液反应15min后，525nm处测定吸光度。
[0086] 根据实施例5制得的标准曲线方程计算得到半乳糖醛酸的浓度与实际值想符合。
[0087] 对比实施例1
[0088] 在实施例2的步骤2检测方法中，步骤（1)中，不添加氢氧化钠溶液，直接进行离 心去除蛋白，其它操作与实施例2相同。
[0089] 本实验中，加入果胶使其浓度为lg/L，实际半乳糖醛酸的含量为672mg/L，根据实 施例1制得的标准曲线计算得到的半乳糖醛酸含量为476 ±25,准确率为67-75%。
[0090] 对比实施例2
[0091] 在实施例2的步骤2检测方法中，步骤（3)中，仅用乙醇溶液沉淀处理一次，其它 操作与实施例2相同。
[0092] 在本实验中，由于中性糖没有去除完全，溶液由于中性糖碳化严重呈现深褐色，而 不是半乳糖醛酸与间羟基联苯反应呈现的粉红色。由此说明，仅用乙醇溶液沉淀处理一次， 严重影响实验结果。
[0093] 对比实施例3
[0094] 在实施例2的步骤2检测方法中，步骤（3)中，用乙醇溶液沉淀处理三次，其它操 作与实施例2相同。
[0095] 本实验中，加入果胶使其浓度为lg/L，实际半乳糖醛酸的含量为672mg/L，根据实 施例1制得的标准曲线计算得到的半乳糖醛酸含量为532±30,准确率为74-83%。
[0096] 效果实施例1
[0097] 表1为实施例2-4中果胶的测定结果，表格中准确度的计算公式为：准确度=计算 半乳糖醛酸含量/实际半乳糖醛酸含量X 100%
[0098] 表 1
【权利要求】
1. 一种预处理方法，其包括以下步骤： (1) 将待测果胶样品在碱性溶液中进行蛋白质沉淀，分离得滤液； (2) 向将步骤（1)所得的滤液中加入乙醇的浓度至50%体积分数以上，进行沉淀处理， 分离得沉淀； (3) 将步骤（2)所得的沉淀溶于水得溶液A，加入乙醇的浓度至50%体积分数以上，进 行二次沉淀处理，分离得沉淀； (4) 将步骤（3)所得的沉淀溶于水，得溶液。
2. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的待测果胶样品为 包含果胶的液态奶制品。
3. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的碱性溶液为碳酸 钠溶液，碳酸氢钠溶液，氢氧化钾溶液，碳酸钾溶液，碳酸氢钾溶液和氢氧化钠溶液中的一 种或几种；所述的碱性溶液的溶度为〇. 5-lmol/L ;所述的碱性溶液与所述的待测果胶样品 的体积比为1:5-1:15 ; 步骤（1)中，所述的分离为离心，所述的离心的转速为5000-10000r/min，时间为5-10 分钟。
4. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的加入乙醇的浓度 至50%体积分数以上是通过加入95%体积分数的乙醇溶液实现的，所述的95%体积分数 的乙醇溶液与所述的滤液的体积比为1:1. 8-1:4 ; 步骤（2)中，所述的分离为离心，所述的离心的转速为5000-10000r/min，时间为5-10 分钟。
5. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（3)中，所述的加入乙醇的浓度 至50%体积分数以上是通过加入95%体积分数的乙醇溶液实现的； 其中，第一次沉淀过程中，所述溶液A与所述的95%体积分数的乙醇溶液的体积比为 1:1-1:4 ;其中，所述离心转速为5000-10000r/min，时间为5-10分钟； 第二次沉淀过程中，所述溶液A与所述的95 %体积分数的乙醇溶液的体积比为 1:2-1:4 ;其中，所述离心转速为5000-10000r/min，时间为5-10min。
6. 如权利要求1所述的预处理方法，其特征在于，步骤（4)中，所述的水的用量为步骤 (1)中所述的待测果胶样品的体积的2-20倍。
7. -种果胶的检测方法，所述的检测方法包括以下步骤：将如权利要求1-6任一项所 述的预处理方法得到的溶液，与四硼酸钠-硫酸溶液混合保温后，水浴冷却，与间羟基联苯 氢氧化钠溶液反应后，525nm处测定吸光度，经标准曲线法测定，即可； 其中，所述的吸光度落入0.3-0. 8范围内时，经标准曲线法测定，即可；若所述的吸光 度不在所述的范围内，调节所述的预处理方法中步骤（4)中水的用量，重复实验，使所述的 吸光度值落入所述的范围内，再经标准曲线法测定，即可。
8. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的四硼酸钠-硫酸溶液为每IOOmL 浓硫酸中溶解有〇. 478g四硼酸钠； 所述的保温的温度为95°C，所述的保温的时间为10分钟； 所述的间羟基联苯氢氧化钠溶液中，间羟基联苯的浓度为I. 5g/L，氢氧化钠的浓度为 5g/L ； 所述的间羟基联苯氢氧化钠溶液为将间羟基联苯溶液溶于氢氧化钠溶液中所形成的 溶液； 所述的反应的时间为15-20分钟。
9. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述的标准曲线法测定的方法包括以 下步骤：用标准品配制标准溶液，标准溶液经所述的果胶检测方法的步骤处理后，分别测定 其吸光度，用吸光度对标准工作液中样品的浓度绘制标准曲线，再在相同的测量条件下测 量待测果胶样品的吸光度，根据待测果胶样品的吸光度和标准曲线计算待测果胶样品的浓 度，并计算其含量。
10. 如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述的标准曲线法测定的方法包括 以下步骤：将半乳糖醛酸配置六份浓度为C1-C6的标准溶液，取相同体积的所述标准溶液 分别与四硼酸钠-硫酸溶液混合保温后，水浴冷却，与间羟基联苯氢氧化钠溶液反应后， 525nm处测定吸光度，记作A1-A6 ;根据C1-C6和A1-A6绘制标准曲线，再在相同的测量条件 下，测量待测果糖样品的吸光度，根据待测果糖样品的吸光度和标准曲线计算待测果糖样 品的半乳糖醛酸浓度，并计算果糖的含量； 其中，所述的C1-C6的标准溶液的浓度较佳地按照阶梯变化。
【文档编号】G01N21/31GK104316382SQ201410640726
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】韩梅, 郭本恒, 董文琪, 徐致远, 刘振民, 杨博崴 申请人:光明乳业股份有限公司