人源沉默信息调节因子6的活性荧光检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，本发明利用含有荧光基团与淬灭基团（FRET效应）、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物，将荧光强度与Sirtuin6的酶活性关联起来，FRET效应可以使底物长链脂肪酰化赖氨酸这一Sirtuin6识别位点位于底物的中部，这样一来，使得底物多肽更接近于Sirtuin6的天然底物，结合更紧密 ；同时，可以给予更多选择的荧光基团，最终，可以得到更可靠的筛选结果。这样的方法可应用于Sirtuin6调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin6活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点，适用于高通量的应用，也可应用于新型Sirtuin6活性检测试剂盒的开发和开展Sirtuin6调节剂的筛选服务。
【专利说明】人源沉默信息调节因子6的活性巧光检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药学领域，尤其是一种人源沉默信息调节因子6(Sbtuin6或SIRT6) 的活性英光检测方法。
【背景技术】
[0002] 组蛋白去己醜化酶是一类催化各种底物蛋白赖氨酸残基侧链的己醜基水解的蛋 白酶家族。目前发现的人源的组蛋白去己醜化酶包括4个亚类共18个亚种。按催化机理 的不同，它们分为经典的I类、II类和IV类W锋为辅酶的组蛋白去己醜化酶化DAC，有11 种分别是HDACl到HDAC11KA.J.deRuijter,etal.化ocAeffl. 乂 2003，737]; 另外，比较特殊的III类W烟醜胺腺嘿岭二核巧酸（NAD)为辅酶的组蛋白去己醜化酶，也叫 做沉默信息调节因子（Sirtuin，有7种分别是SIRTl到SIRT7)。根据蛋白序列的相似性W 及进化分类，所有物种的Sbtuin又被分成四大类；SIRT1，SIRT2，SIRT3属于I类；SIRT4 属于II类；SIRT5 属于III类；SIRT6 和SIRT7 属于IV类[A.A.Sauve,etal.心/7化 Rev. Biochem.2006,75,435] 〇
[0003] 研究表明，HDAC抑制剂可W抑制肿瘤细胞的生长、促进其分化及调亡，而对正常 细胞几乎没影响。因此，它们已成为新一代明星祀向抗癌药物，目前多种HDAC抑制剂正处 于临床前期和临床试验中肛Giannini,etal.巧/fare必化Z。細?. 2012，4，1439; S.Minucci,etal.TfetoreTPwiewsCancer2006, 6, 38]。Vorinostat和FK228 (图 10)已被美国FDA分别于2006年和2009年批准用于治疗难治性的皮肤T细胞淋己瘤[M. Duvic,etal.化/oot/ 2007, 2W, 31;R.L.Piekarz,etal. 乂 化C(97. 2009, 之7，5410]。已上市的该两个药物都是机理型的HADC抑制剂，但它们都不是选择性地只抑 制某一个HDAC。该有可能导致该两个药物在治疗过程中会带来的一些副作用，如疲劳、恶 也、腹泻、肺栓塞和血小板减少等，甚至极个别的也脏毒性[G.Giannini,etal.巧/tore Med. Chem.2012, 1439;S.Minucci,etal.Tfetore成Cancer2006, 6, 3引。
[0004]相对于HDAC抑制剂，Sirtuin抑制剂的抗肿瘤研究相对滞后，报道的不多[S. Sanchez-Fidalgo,etal. 。細?. 2012, 2乂 2414]。目前只有一个针 对Sbtuin的非特异性抑制剂（EX-527)在欧洲进入一期临床研究[Y.化ang,etal. 化cwe/?e2009,細，445]。
[0005]Sirtuin抑制剂开发相对滞后的主要原因在于，在该四大类的Sirtuin当中，仅有 I类Sbtuin(即SIRT1，SIRT2和SIRT3)具有显著的去己醜化酶活；而其他的类 Sirtuin(SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7)的去己醜化酶活则是非常微弱圧.Michishita, etal.必〇7.化(97.保772005, 26, 4623;G.Liszt,etal. 乂化(97.。細?. 2005,之况?， 21323;M.C.Haigis,etal.保772006, 斯 941;A.Schuetz,etal. 2007，25，277;E.Michishitaetal. #別"re, 2008，必么 292]。对于该些仅具有微 弱去己醜化活性的Sirtuin来说，我们很难开发出可靠的Sirtuin活性筛选方法去开发它 们的调节剂。
[0006] 近期的最新研究成果表明，IV类Sbtuin中的一员SIRT6是NAD依赖的去长链脂 肪醜化酶（NAD-cbpendentdefatt}f-aclyase) 根据SIRT6去长链脂肪醜化酶活性的该一最新研究结果，已开发出香豆素偶联多肤的 英光底物并建立了相关的SIRT6的活性筛选方法[CN103403553A; J.化，etal.化伊 化0皿?7.。細?.2013，11，5213]。然而，该些方法依赖的香豆素只能连接在多肤的C端， 使得底物长链脂肪醜化赖氨酸该一SIRT6识别位点只能位于C端，从而导致了底物多肤与 SIRT6的亲和力下降，另一方面，香豆素基团还可能给后续的药物筛选带来一些误导[K.T. Howitz,etal. 7fetore2003,全放，191;M. Kaeberlein,etal.乂化(97.曲.2005, 之况?，17038; M.T. Borra,etal.乂化(97.。6曲.2005,之况?，17187; D.Beher,etal. 。細?.化(97.化媒?化占.2009,7#,619; M, Pacholec,etal.乂化(97. 曲.2010, 风8：340]。
[0007] 因此，SIRT6的新型活性筛选方法亟待研究和开发。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是；提供一种人源沉默信息调节因子6的活性英光筛选方法，它的 筛选效果更准确，且简单易行，成本低廉，W克服现有技术的不足。
[0009] 本发明是该样实现的：人源沉默信息调节因子6的活性英光筛选方法，W含有英 光基团与英光浑灭基团、且含有长链脂肪醜化赖氨酸残基的多肤为底物，1)将所述底物与 人源沉默信息调节因子6赔育，脱去底物的赖氨酸残基上的长链脂肪醜化修饰，得到无修 饰的赖氨酸多肤；2)将所述的无修饰的赖氨酸多肤与蛋白水解酶裂解液赔育，从赖氨酸的 C端裂解肤键；使英光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肤关联起来，该检测得到英光强度 与人源沉默信息调节因子6的酶活性具有相关性。
[0010] 所述的W含有英光基团与英光浑灭基团、且含有长链脂肪醜化赖氨酸残基的多肤 为底物具有如下结构式：
【权利要求】
1. 一种人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：以含有荧光基团 与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物，1)将所述底物与人源沉 默信息调节因子6孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的长链脂肪酰化修饰，得到无修饰的赖 氨酸多肽；2)将所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育,从赖氨酸的C端裂 解肽键；使荧光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到荧光强度与人源 沉默信息调节因子6的酶活性具有相关性。
2. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的以含有荧光基团与荧光淬灭基团、且含有长链脂肪酰化赖氨酸残基的多肽为底物具 有如下结构式：
式中，Rl及R2均表示3个以上氨基酸；所述的多肽为通过肽键相连的3个以上的氨基 酸；在该氨基酸序列中没有无修饰的赖氨酸或者精氨酸，且长链脂肪酰化赖氨酸残基不能 位于多肽的两端。
3. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的配对的荧光基团和荧光淬灭基团包括Edans/Dabcyl、Trp/Dansyl、Trp/DNP、MCA/ DNP, Abz/DNP 或 Abz/Tyr (NO2)。
4. 根据权利要求I所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述的蛋白水解酶裂解液为蛋白质裂解液其有效成分为胰蛋白酶、羧肽酶或gluc-C。
5. 根据权利要求1所述的人源沉默信息调节因子6的活性荧光筛选方法，其特征在于：所述底物与人源沉默信息调节因子5的体积比为10:1，孵育时间为30分钟；所得的无修饰 的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液的体积比为10 :1，孵育时间为1小时；上述的孵育温度 为 25-37。。。
【文档编号】G01N21/64GK104359883SQ201410641045
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月13日 优先权日:2014年11月13日
【发明者】何彬, 李燕, 刘亭, 李勇军, 兰燕宇, 王爱民, 王永林 申请人:贵阳医学院