小反刍兽疫病毒c-elisa抗体检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，包括盒体与盒盖，本实用新型盒体与盒盖采用插入式结构相连；盒体内设置有与盒体尺寸大小相同的海绵托，所述的海绵托上设置有12个凹孔；凹孔内分别放置有1瓶20×浓缩洗涤液、1瓶稀释液、1瓶包被液、1瓶终止液、1瓶底物液、1管PPRV单抗、1管HRP羊抗鼠二抗、1管PPRV强阳性血清、1管PPRV弱阳性血清、1管PPRV阴性血清、1管注射用水，1瓶PPRV?N抗原。本实用新型将便携性达到极致，使得小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测可以企业化操作、规模化生产，且具有检测灵敏度高、检测时间短、稳定可靠的优点。
【专利说明】小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于试剂盒结构【技术领域】，具体涉及小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒结构【技术领域】。
【背景技术】
[0002]小反会兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是由小反会兽疫病毒(PPRV)弓丨起的小反刍动物的一种急性或亚急性高度接触性传染病，以发热、眼鼻分泌物增多、口炎、腹泻和肺炎为特征。
[0003]1942年，小反刍兽疫首次报道于西非科特迪瓦；1970年-1972年，报道于东非苏丹；1987年报道于亚洲印度；2007年我国西藏首次报道。2008年、2010年在西藏局部有流行。2013年11月，新疆伊犁州霍城县突然出现小反刍兽疫疫情，随后在全国呈现快速扩散趋势，截止2014年5月13日，PPR疫情出现在全国16个省份、4个自治区、I个直辖市(重庆市)。发病动物(羊)33996头，死亡动物(羊)14780头，处理动物(羊)49973头。平均死亡率42.59%。
[0004]小反刍兽疫抗体检测方法有中和试验、ELISA试验。其中ELISA方法由于实验条件要求低(不涉及病原操作、生物安全要求低)而被广泛应用。本实用新型专利中的C-ELISA检测方法，主要利用昆虫细胞表达的小反刍兽疫病毒核蛋白(PPRV N蛋白)作为包被抗原，针对核蛋白的PPRV单抗等物质组成而成试剂盒。试剂盒具有生产成本低，易于规模化生产等特点。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的是提供一种简便、快速、敏感、特异的新型小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，可广泛应用于羊、牛等各种动物感染小反刍兽疫病毒后血清抗体的检测和相应的流行病学调查。
[0006]小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，包括盒体与盒盖，本实用新型盒体与盒盖采用插入式结构相连；盒体内设置有与盒体尺寸大小相同的海绵托，所述的海绵托上设置有12个凹孔；凹孔内分别放置有I瓶20X浓缩洗涤液、I瓶稀释液、I瓶包被液、I瓶终止液、I瓶底物液、I管PPRV单抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管PPRV强阳性血清、I管PPRV弱阳性血清、I管PPRV阴性血清、I管注射用水，I瓶PPRV N抗原。
[0007]本实用新型所述的20X浓缩洗涤液体积为60ml，瓶盖为蓝色；所述的稀释液体积为50ml,瓶盖为黄色；包被液体积为25ml,瓶盖为紫色；所述的终止液体积为25ml,瓶盖为红色；所述的底物液体积为25ml，瓶盖为棕色；所述的PPRV强阳性血清和PPRV弱阳性血清体积分别为300ul，管盖均为红色；所述的PPRV阴性血清体积为300ul，管盖为蓝色；所述的PPRV单抗体积为300ul,管盖为绿色；所述的注射用水体积为800ul,管盖为白色；所述的HRP羊抗鼠二抗体积为300ul，管盖为黄色。
[0008]本实用新型所述海绵托上放置有2块酶标板、6张封板纸、I份说明书。
[0009]本实用新型所述的酶标板为96孔酶标板，该酶标板由聚乙烯制成，酶标板上设置有支撑架，可单条拆卸，由12条酶标条构成，每条酶标条上有8个微孔。
[0010]本实用新型的有益效果是=ELISA系统有很多好处，如不需活病毒，因此不需要在2?3级生物安全实验室中进行，另外竞争ELISA法快速、敏感、重复性强、成本低。本实用新型将便携性达到极致，使得小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测可以企业化操作、规模化生产，且具有检测灵敏度高、检测时间短、稳定可靠的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为本实用新型盒体内布置结构示意图；
[0012]图2为酶标板结构图。
[0013]图中标号为，1:两块酶标板，2:1份说明书，3:6张封板纸，4:60ml20X浓缩洗涤溶液，5:50ml稀释液，6:25ml包被液，7:25ml终止液，8:25ml底物液，9 =PPRV N抗原，10:
0.3mlPPRV强阳性血清，11:0.3mlPPRV弱阳性血清，12:0.3mlPPRV阴性血清，13:0.3ml羊抗鼠二抗，14 =PPRV单抗，15:0.8ml注射用水(去离子水)，16:盒体。
【具体实施方式】
[0014]如图1和图2所示，小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，包括盒体与盒盖，本实用新型盒体与盒盖采用插入式结构相连；盒体内设置有与盒体尺寸大小相同的海绵托，所述的海绵托上设置有12个凹孔；凹孔内分别放置有I瓶20X浓缩洗涤液、I瓶稀释液、I瓶包被液、I瓶终止液、I瓶底物液、I管PPRV单抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管PPRV强阳性血清、I管PPRV弱阳性血清、I管PPRV阴性血清、I管注射用水，I瓶PPRV N抗原。
[0015]本实用新型所述的20X浓缩洗涤液体积为60ml，瓶盖为蓝色；所述的稀释液体积为50ml,瓶盖为黄色；包被液体积为25ml,瓶盖为紫色；所述的终止液体积为25ml,瓶盖为红色；所述的底物液体积为25ml，瓶盖为棕色；所述的PPRV强阳性血清和PPRV弱阳性血清体积分别为300ul，管盖均为红色；所述的PPRV阴性血清体积为300ul，管盖为蓝色；所述的PPRV单抗体积为300ul,管盖为绿色；所述的注射用水体积为800ul,管盖为白色；所述的HRP羊抗鼠二抗体积为300ul，管盖为黄色。
[0016]本实用新型所述海绵托上放置有2块酶标板、6张封板纸、I份说明书。
[0017]本实用新型所述的酶标板为96孔酶标板，该酶标板由聚乙烯制成，酶标板上设置有支撑架，可单条拆卸，由12条酶标条构成，每条酶标条上有8个微孔。
[0018]使用本试剂盒的操作步骤如下。
[0019](I)在PPRV N抗原冻干瓶中注入500ul去离子水，用包被液1:50稀释后，在所需的孔中各加10ul，37。。孵育Ih ；
[0020](2)将各孔的液体弃入废液桶。每孔加300ul的洗涤液(试剂盒内20 X浓缩洗涤液需用蒸馏水或去离子水稀释后方可使用。如有结晶，需先溶解后，方可进行稀释)进行洗板，重复三次。
[0021](3)在每孔中加入40ul稀释液；然后在Al，A2孔加入60ul稀释液，BI，B2，Cl，C2中加入lOulPPRV强阳性血清;D1，D2，E1，E2中加入lOulPPRV弱阳性血清;F1，F2，G1，G2中加入1ul稀释液；H1，H2中加入lOulPPRV阴性血清；待检样品加入相应的孔中；除了 A1，A2孔外，其余各孔加入50ul PPRV单抗(PPRV单抗用稀释液1:50稀释)，并做好记录，37°C孵育Ih;
[0022](4)重复步骤⑵；
[0023](5)将HRP羊抗鼠二抗用稀释液1:100稀释后，每孔中加入100ul，37°C孵育Ih ；
[0024](6)重复步骤⑵；
[0025](7)每孔加lOOulTMB底物液；
[0026](8) 37°C避光放置 10_15min ；
[0027](9)每孔加10ul终止液；在15min内于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即0D450nm 值。
[0028](10)计算各孔的PI值，即PI = 100-(血清样品OD值/M孔平均OD值)X 100，其中M孔为单抗对照即F1、F2、G1、G2的平均值。结果判定当PPRVPPRV强阳性血清孔(SP)PI值大于80 ;PPRVPPRV弱阳性血清孔(WP)PI值在50-79之间；CC(HRP羊抗鼠二抗对照即Al，A2孔)孔PI值大于90 ；PPRV阴性对照(N)PI值小于50，实验结果有效。此时检测样品PI值> 50时判为阳性，PI值< 50时判为PPRV阴性。每份样品加样两孔时，在结果判定时出现I孔PI值大于或等于50，I孔PI值小于50时，需重复检测。
[0029]备注:抗原溶解后呈乳白色或无色或有微量不溶物，不影响使用效果。溶解抗原-20°C保存，反复冻融至少30次不影响实验结果；试剂盒保存方式，2°C _8°C保存。
【权利要求】
1.小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，包括盒体与盒盖，其特征在于:盒体与盒盖采用插入式结构相连；盒体内设置有与盒体尺寸大小相同的海绵托，所述的海绵托上设置有12个凹孔；凹孔内分别放置有I瓶20X浓缩洗涤液、I瓶稀释液、I瓶包被液、I瓶终止液、I瓶底物液、I管PPRV单抗、I管HRP羊抗鼠二抗、I管PPRV强阳性血清、I管PPRV弱阳性血清、I管PPRV阴性血清、I管注射用水，I瓶PPRV N抗原。
2.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的20X浓缩洗涤液体积为60ml，瓶盖为蓝色；所述的稀释液体积为50ml，瓶盖为黄色；包被液体积为25ml,瓶盖为紫色；所述的终止液体积为25ml,瓶盖为红色；所述的底物液体积为25ml，瓶盖为棕色；所述的PPRV强阳性血清和PPRV弱阳性血清体积分别为300ul，管盖均为红色；所述的PPRV阴性血清体积为300ul，管盖为蓝色；所述的PPRV单抗体积为300ul,管盖为绿色；所述的注射用水体积为800ul,管盖为白色；所述的HRP羊抗鼠二抗体积为300ul，管盖为黄色。
3.根据权利要求1所述的小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述海绵托上放置有2块酶标板、6张封板纸、I份说明书。
4.根据权利要求3所述的小反刍兽疫病毒C-ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的酶标板为96孔酶标板，该酶标板由聚乙烯制成，酶标板上设置有支撑架，用于单条拆卸。
【文档编号】G01N33/569GK203941169SQ201420380747
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】艾军, 杨云庆, 孙瑶, 祝贺, 杨俊兴, 聂福平, 叶玲玲, 蒋宏伟, 杨素, 周晓黎, 花群义, 李应国, 董俊, 尹尚莲 申请人:艾军, 杨俊兴, 聂福平