一种高效定量检测高尔基体73的试剂盒的制作方法

本发明属生物技术领域，涉及一种检测GP73的方法及其建立的试剂盒，特别是涉及一种定量检测GP73的酶联免疫试剂盒。

背景技术：

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长，已超过62.6万/年，居于恶性肿瘤的第5位；死亡接近60万/年，位居肿瘤相关死亡的第3位。目前，我国发病人数约占全球的55％；在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第二。因此，肝癌严重威胁我国人民健康和生命。肝脏是人体最大的实质性器官，承担人体的各类重要代谢功能，因此，肝脏一旦出现恶性肿瘤将导致未及生命的严重后果。又由于肝脏具有丰富的血流供应，与人体的重要结构如下腔静脉、门静脉、胆道系统等关系密切；肝脏恶性肿瘤发病隐匿，侵袭性生长快速，其治疗甚为困难。因此，早期发现、早期诊断对肝癌的治疗及其重要。目前肝癌的诊断主要依靠血清肿瘤标志物检测，影像学和组织学检查，其中大量的研究已经证实甲胎蛋白是目前临床原发性肝细胞癌的最主要实验室指标，在肝癌患者的早期，血清中有数种分子水平已经发生了明显的变化，通过对血清中这些分子水平的定量检查可以作为肝癌预测的一个有效手段。

AFP是目前诊断原发性肝癌最重要的肿瘤标记物,已被广泛用于肝癌的普查、诊断、判断治疗效果和预测复发中,但AFP的敏感性和特异性较差,虽然甲胎蛋白(AFP)是诊断肝癌的重要指标之一，但其仍有一定的局限性。据文献报道，阳性率仅为60-70％，并存在假阳性。30％至40％的HCC患者APF呈阴性或弱阳性，且急性病毒性肝炎，慢性活动性肝炎，肝硬化活动期等疾病也会出现AFP升高。

高尔基体蛋白73是新近发现的一个分子量在73kDa，定位于高尔基本上的II型跨膜糖蛋白。采用免疫组化的研究方法证实在人类的上皮细胞有着GP73和少量表达，而在正常的肝脏中，GP73仅在胆管上皮细胞表达，肝细胞基本不表达。但是病变的组织，特别是肝癌的早期，GP73呈现过表达并且其表达水平与肝癌的进展相关，在肝癌患者血清中GP73的含量是正常人的3至5倍，与临床疗效及预后有较好的相关性。

肝癌的早期的发现率低，主要与早期肝癌的症状不明显以及目前市场上缺乏有效的检测手段有关。目前临床上用于检测肝癌的方法包括影像学方法如PET-CT、病理活检来验证。PET-CT检查费用昂贵，而侵入性活检对患者来讲是极其痛苦的。因此，有必要在目前技术上十分成熟的普通ELISA的基础上继续优化检测灵敏度的工艺，开发能检测到更低含量GP73的ELISA试剂盒。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效定量检测GP73的方法及其建立的免疫试剂盒，该试剂盒具有特异性强、灵敏度高，检测范围更低、线性条件好等优点，更适合用于精确定量。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。

一种高效定量检测GP73的免疫学方法，以抗GP73的多克隆抗体和抗GP73的单克隆抗体混合在一起作为联合捕获抗体，以抗GP73的单克隆抗体或抗GP73的多克隆抗体作为检测抗体DMA，通过抗原抗体反应从而检测GP73。

现有技术中在使用免疫学方法检测GP73时，捕获抗体都是仅使用一种类型的抗体，要么是单克隆抗体，要么是多克隆抗体；而本发明将抗GP73的单克隆抗体与抗GP73的多克隆抗体混合制备成捕获抗体，以另一种抗体作为检测抗体，这样建立的免疫学检测方法的敏感性和特异性更高。敏感性和特异性显著提高的原因在于，联合捕获抗体在不同的溶液环境下增加了抗原抗体的结合表位，减少了假阴性，但有可能增加假阳性，所以本发明在选择检测抗体时，采用点阵法来作交叉实验，筛选到的检测抗体特异性十分强，该检测抗体与9种肝病相关抗原蛋白无交叉反应。从而弥补了联合捕获抗体可能导致的假阳性。作为检测抗体的 抗GP73的单克隆抗体为货号为130-10311，购自美国瑞博奥生物科技有限公司。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述抗GP73多抗是根据以下方法制备的：用纯化的GP73抗原蛋白免疫SPF级新西兰兔，得到含有抗GP73多抗的兔血清，先用硫酸铵沉淀法从兔血清中初步纯化免疫球蛋白IgG，再用ProteinG/A亲和柱进一步纯化，得到抗GP73多抗。

所述抗GP73多克隆抗体是基于GP73抗原蛋白来制备的，所述的GP73抗原标准品是采用原核表达系统表达的蛋白，该蛋白可溶性程度高，空间构象接近天然抗原。

所述抗GP73单抗是用序列为SEQ ID NO:1的多肽来制备的。

所述抗GP73单抗可以是根据以下方法制备的：用纯化的序列为SEQ ID NO:1的多肽免疫SPF级Balb/c鼠，所得小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0融合后筛选得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞分泌所得抗体用ProteinG/A亲和柱进一步纯化，得到抗GP73单抗。

优选地，所述抗GP73单抗是由保藏号为CCTCC NO.C2014216的杂交瘤细胞株GP73-5B4-G6-C9-C6-G4分泌的单抗。该杂交瘤细胞株保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年11月20日。

本发明所述的试剂盒可以是酶联免疫试剂盒，其包括：包被所述联合捕获抗体的96孔微孔板，20X浓缩洗涤液，含重组人类GP73蛋白的标准品抗原干粉，用于稀释样本的2瓶15ml 5X浓缩稀释液D，用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5X浓缩稀释液B，生物素化抗GP73检测抗体，200μl 300X浓缩HRP-链亲和素溶液，12ml TMB底物，8ml含0.2M硫酸的终止液。

根据本发明所述的酶联免疫试剂盒的进一步特征，所述联合捕获抗体的包被浓度是每种抗体0.3至0.5ug/孔，所述待测血清的稀释倍数是1:10，所述检测抗体为抗GP73单抗DMA,浓度为0.1mg/L，所述生物素标记的检测抗体DMA的稀释浓度是1:5000。

实验结果表明，该酶联免疫试剂盒检测抗体具有很高的特异性，与9种肝病相关抗原蛋白无交叉反应。

本发明所述的定量检测高尔基体73(GP73)的酶联免疫试剂盒，其优点在于：采用两种抗体联合包被酶标板，该试剂盒具有特异性强、检测范围更低、灵敏度高，灵敏度可达200pg/ml(对照组检测值<效价检测值的一半)，而常规GP73检测试剂盒检测范围的最低检测值是0.5ng/ml(例如，北京热景生物技术有限公司的发明专利ZL 200810181016.1中所述的定量检测试剂盒)。

本发明所述的试剂盒可以是胶体金免疫层析检测试剂盒，该试剂盒包括至少一个试纸条，其包括：样品垫、标记垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、标记垫上包被胶体金标记的抗CRP检测抗体DMA，硝酸纤维素膜包括包被有抗鼠IgG二抗的质控区和包被有所述联合捕获抗体的检测区。

根据本发明所述的胶体金免疫层析检测试剂盒的进一步特征，所述联合捕获抗体的包被浓度分别为0.5～1mg/ml，用量按膜包被液量为20～25ug/30cm²；所述检测抗体DMA的包被浓度为0.2～1mg/ml，用量按膜包被液量为0.8ug/cm²。

本发明所述的免疫层析试纸条的检测原理是双抗夹心法，将直径范围0.01～1um的胶乳微球与抗GP73单抗和各类不同的荧光素共价结合，利用荧光素在激光发作用下可以发射荧光，当此荧光胶乳标记的GP73单抗与样本中的抗原结合形成复合物，在层析作用下移至包被膜的检测区，在包被膜的检测区包被有能与GP73抗原结合的联合捕获抗体。复合物聚积在包被膜的T线区，受到光源激发释发出相应波长的发射光，通过荧光检测系统捕捉的光信号转化为数字信号，从而可用于准确定量的快速免疫检测中。

本发明所述的试剂盒可以是时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒，该试剂盒包括多个检测试剂条，所述试纸条由样品垫，荧光微球包被的释放垫，硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸组成；其中，样品垫用于加样(血清或全血)；释放垫中含过量的抗GP73检测抗体和荧光微球的复合物；NC膜上有两道线：检测线，又称T线，含定量的所述联合捕获抗体；对照线，又称C线，含定量的抗鼠IgG二抗。

说明书附图

图1是本发明所述的ELISA试剂盒检测抗体的特异性时的抗原点阵列图。

图2是本发明所述的ELISA试剂盒的样本检测值与医院检测值的比较图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：GP73基因的分泌表达

将GP73基因序列插入载体，经测序成功后转入大肠杆菌，表达产物经SDS-PADG验证得到单一条带。

GP73抗原蛋白序列与GenBank登录号AAF44663.1的一致。

实施例2：抗GP73多抗的制备、纯化及鉴定

用实施例1所述的大肠杆菌表达的GP73蛋白免疫SPF级新西兰兔(广东省实验动物中心)，免疫三次，每次间隔半个月。最后一次加强免疫三天后，通过心脏采血，血清析出后，先用硫酸铵沉淀法从兔血清中初步纯化免疫球蛋白IgG，再用ProteinG/A亲和柱进一步纯化抗GP73多抗，SDS-PAGE和Western Blotting鉴定纯化的抗体。

实施例3：抗GP73单抗的制备，纯化及鉴定

用不同的KLH偶联的GP73抗原多肽免疫SPF级Balb/c鼠(广东省实验动物中心)，免疫三次，每次间隔半个月。最后一次加强免疫三天后，通过收集脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞分泌所得抗体用ProteinG/A亲和柱进一步纯化。

根据GP73蛋白序列设计了以下3段多肽进行实验：

SEQ ID NO:1 CKEQCEERIEEVTKKGNEAV

SEQ ID NO:2 CDGQEEEQEAAGEGRNQQ

SEQ ID NO:3 CNMDENEAESETDKQAAL

采用上述3段多肽得到3株杂交瘤细胞株，下面将采用这些杂交瘤细胞株分泌的单抗组建酶联免疫(ELISA)试剂盒，通过直接ELISA验证它们的灵敏度。实验结果表明，SEQ ID NO:1多肽和SEQ ID NO:2多肽制备的单抗的灵敏度比SEQ ID NO:3多肽高。

实施例4：检测GP73的酶联免疫(ELISA)试剂盒

本实施例采用实施例3得到的2株杂交瘤细胞株分泌的单抗，分别对应于SEQ ID NO:1多肽、SEQ ID NO:2多肽组建酶联免疫(ELISA)试剂盒。

1、ELISA试剂盒的组分

1)ELISA酶标板：采用吸附性能好，空白值低，批次稳定的聚苯乙烯板包被捕获抗体，预先用封闭液处理。采用纯化好的抗GP73多抗和抗GP73单抗作为捕获抗体。包被浓度每个抗体每孔在0.3至0.5ug之间。

2)洗涤液：含0.1％Tween 20的20X浓缩洗涤液。

3)标准品：含重组人类GP73蛋白的标准品抗原干粉。

4)稀释液：2瓶用于稀释样本的15ml 5X浓缩稀释液D，1瓶用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml 5X浓缩稀释液B。

5)检测抗体：生物素化抗GP73单克隆抗体，最佳稀释浓度为0.1mg/L。

6)200μl 300X浓缩HRP-链亲和素溶液。

7)底物：12ml TMB溶液。

8)终止液：8ml含0.2M硫酸溶液。

2、ELISA试剂盒的操作步骤

1)将所有试剂放置室温条件(18-25℃)下平衡30分钟，标准品和样本都设置至少一个重复。

2)加入100μl稀释好的标准品及样品，盖上封板膜室温条件下孵育2.5个小时或者4℃过夜，放置于洗板机洗涤并倒转微孔板在纸巾上吸干净。

3)加入100μl稀释好的生物素化的检测抗体，室温条件下孵育1个小时。

4)放置于洗板机洗涤并倒转微孔板在纸巾上吸干净。

5)加入100μl稀释好的HRP-链亲和素，孵育45分钟。

6)重复4)的步骤。

7)加入100μl TMB反应30分钟，再加入50μl终止液终止反应，于酶标仪450nm读数。

8)根据检测结果得出折线图公式，计算待测血清的GP73含量。

实施例5：ELISA试剂盒的质量分析

本实施例采用实施例4得到的3种ELISA试剂盒，通过直接ELISA验证它们的灵敏度。这些试剂盒采用的联合捕获抗体为抗GP73多抗和抗GP73单抗，其中抗GP73单抗分别对应于由SEQ ID NO:1多肽、SEQ ID NO:2多肽得到的2株杂交瘤细胞株分泌的单抗。

1)ELISA试剂盒的灵敏度

参照实施例4中的操作步骤，在第2步的微孔板中依次加入50、25、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.09、0ng/ml的GP73抗原蛋白，设两个重复求平均值，所得检测结果如下表1，可知其检测灵敏度可达97pg/ml(对照组检测值<效价检测值的一半)，而常规GP73检测试剂盒检测范围的最低检测值是0.5ng/ml。

表1：灵敏度检测

根据包被抗体的不同分为单抗1为SEQ ID No.1多肽制备的单抗，单抗2为SEQ ID No.2多肽制备的单抗，多抗为GP73蛋白制备的多抗，联合捕获抗体1为单抗1与多抗组合包被，联合捕获抗体2为单抗2与多抗组合包被。

对比实验表明，SEQ ID NO:1多肽制备的单抗的灵敏度比SEQ ID NO:2多肽制备的单抗的灵敏度低，但由联合捕获抗体1的组合的灵敏度较其他抗体组合的较高，ELISA试剂盒采用此种组合。

因此，将分泌SEQ ID NO:1多肽制备的单抗的该株杂交瘤细胞株保藏于武汉大学菌种保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C2014216，命名为杂交瘤细胞株GP73-5B4-G6-C9-C6-G4。

2)ELISA试剂盒检测抗体的特异性

采用芯片点阵法来建议检证试剂盒中检测抗体的特异性。

在硝酸素纤维膜上点上10种不同的蛋白，每种蛋白点3个重复。加入生物素标记的抗GP73检测单抗DMA及链亲和素连接的荧光底物，通过Odyssey扫描荧光成像，结果如图1所示，可知检测抗体与其它9种肝病相关抗原蛋白均无交叉反应。

实施例6：ELISA试剂盒的应用

GP73定量检测试剂盒针对同一批临床样本包括447例肝癌血清、25例肝病血清和41例正常人血清，结果如表2和图2所示。

表2：试剂盒的应用

从表2的结果中可见，肝疾病组和原发性肝癌组患者的血清GP73水平相对于健康人的体检血清水平显著升高(P<0.0001)，其中肝疾病组(包括肝炎、肝硬化等疾病)的GP73含量平均水平为278ng/ml，肝癌组平均水平为284ng/ml，与肝疾病组的差异不大，而正常人的血清含量为74.86ng/ml。

实施例7：检测GP73的胶体金免疫层析检测试剂盒

以上述实施例所述的联合捕获抗体和检测抗体建立一种检测GP73的胶体金免疫层析检测试剂盒，所述试剂盒包括多个试纸条，所述试纸条由样品垫，胶体金标记垫，硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸组成，所述NC膜包被有检测区和质控区，检测区包被联合捕获抗体，质控区包被抗鼠IgG二抗；所述胶体金标记垫包被检测抗体。

所述胶体金标记垫的制备过程为，以氯金酸-柠檬酸三钠还原法制备活化的胶体金溶液，将检测抗体按照100～500ug检测抗体蛋白每100ul胶体金溶液的比例加入到胶体金溶液中，搅拌室温反应2小时，离心洗涤2次，沉淀用胶体金溶液复溶至50ml，按0.8ug/cm²的用量涂覆在胶体金标记垫上，室温干燥备用。

硝酸纤维素膜的制备过程为：将联合捕获抗体(抗GP73的单抗和多抗)和抗鼠IgG二抗用包被液调整至浓度为0.5至1mg/ml，将抗鼠IgG二抗用包被缓冲液PBS调整至浓度为0.8mg/ml，按膜包被液量为20ug/30cm²至25ug/30cm²的用量将联合捕获抗体喷到NC膜的检测区，分别按膜包被液量为25ug/30cm²至30ug/27cm²的用量将抗鼠IgG喷到质控区，过夜冷冻干燥，加入干燥剂封存备用。在底板上依次相互搭接地粘贴样品垫，胶体金标记垫，NC膜和吸水纸，按照要求切割成适当宽度的试纸条形成试剂盒。

实施例8：检测GP73的时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒

以实施例中所述的联合捕获抗体和检测抗体建立一种检测GP73的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括多个检测试纸条，所述试纸条由样品垫，荧光微球包被的释放垫，硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸组成。其中，样品垫用于加样(血清或全血)；释放垫中含过量的抗GP73检测抗体和荧光微球的复合物；NC膜上有两道线：检测线，又称T线，含定 量的联合捕获抗体；对照线，又称C线，含定量的抗鼠IgG二抗。

本试剂盒采用时间分辨荧光微球作为标记载体，将检测抗体标记于荧光微球上，利用侧向层析技术，将标记抗体的微球干燥于释放垫上，同时在NC膜上喷制相应的联合捕获抗体，利用双抗体夹心法检测血清或全血中的GP73。当将含有待测抗原(GP73)的样品滴在加样区，待测样品中的GP73与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗GP73检测抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的联合捕获抗体结合，形成微粒-抗体-抗原的抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。反应结束后，用紫外光源(365nm)对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光(615nm)，且衰变时间也较长。利用延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光(1～10ns)全部衰变后，再测量微球的特异性激发荧光，这样就可以完全排除特异本底荧光的干扰。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。