一种基于特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法与流程

本发明属于生化分析领域，涉及一种高通量检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法，尤其涉及一种基于特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法，该方法中通过制备特异识别蛋白质棕榈酰化修饰的泛抗体及将其用于生物样本的检测中。

背景技术：

现有技术公开了棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、发展等过程中起着重要的作用，其中，通常是饱和的16个碳的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白质Cys的巯基上。传统的用于检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法是用放射性棕榈酸盐代谢标记培养细胞，通过放射自显影检测同位素标记的程度，但该法操作繁琐，使用放射性同位素有害且处理费用高，且只能用于检测活细胞中的棕榈酰化修饰蛋白质，存在灵敏度不高，缺乏直接富集和鉴定放射性标记蛋白质的方法等缺陷。现有技术中对蛋白质棕榈酰化通量分析的方法主要有两大类，其中一大类是以“棕榈酸盐为中心”的分析方法，即用含叠氮或炔基的棕榈酸盐类似物代谢标记培养细胞，通过化学选择性连接如施陶丁格连接或点击化学方法，选择性地将带叠氮或炔基基团的蛋白质连接到生物素或荧光基团上，富集或检测棕榈酰化修饰的蛋白质；该类方法不能分析组织样品和体液，可能会更偏向棕榈酸盐更新较快的蛋白质，棕榈酸盐类似物的引入可能会导致无法预测的生物学效应；另一大类方法是“以半胱氨酸为中心”的方法，即蛋白质提取后，先用碘乙酰胺或N-乙基顺丁烯二酰亚胺等完全封闭蛋白质Cys上所有自由巯基，再利用羟胺(HA)选择性地切开蛋白质Cys和脂肪酸修饰基团之间的巯酯键，产生新的自由巯基，再用合适的试剂如具有巯基特异反应活性的试剂等反应，将其转化成二硫键连接的生物素，再进行纯化、检测S-棕榈酰化修饰蛋白质；该法为间接检测和纯化方法，假阳性率相对较高。

鉴于现有技术存在的缺陷，本申请的发明人拟提供一种能高通量分析，特异性高的检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法，尤其涉及一种基于特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法，

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能高通量分析，特异性高的检测棕榈酰化修饰蛋白质的方法，具体涉及一种基于特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法。

本发明中，通过严格筛选特异识别蛋白质半胱氨酸棕榈酰化修饰泛抗体血清，然后建立对生物样本中的棕榈酰化修饰蛋白质的免疫化学鉴定方法，结合质谱精密分析的特点，能实现对各类型大规模样本(如细胞、组织和体液)的棕榈酰化修饰蛋白质的高通量分析，且特异性高。

本发明的进一步目的是采用所建立的方法简便地检测蛋白质棕榈酰化修饰状态，本发明方法尤其适用于在研究或临床应用中大规模检测棕榈酰化修饰蛋白质。

本发明的检测方法中，首先制备蛋白质棕榈酰化修饰泛抗体血清，然后利用该泛抗体血清对复杂生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质进行高通量检测。

本发明中利用蛋白质棕榈酰化修饰泛抗体血清高通量检测蛋白质的棕榈酰化修饰状态。

本发明中利用载体偶联的棕榈酰化的多肽作为免疫原，并利用该修饰肽段与未修饰肽段进行鉴别筛选，获得针对蛋白质棕榈酰化修饰的泛抗体血清。

本发明中采用制得的泛抗体血清通过western blot特异识别生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质及其变化，并通过质谱分析鉴别修饰蛋白质的类别。

具体而言，本发明的一种基于特异抗体的棕榈酰化修饰蛋白质的检测方法，其包括步骤：

(1)利用半胱氨酸位点棕榈酰化修饰的肽段作为半抗原，将其与载体蛋白质偶联后采用皮下多点注射的方式免疫实验动物；本发明的实施例中，先将含16个碳的饱和脂肪酸棕榈酸通过硫酯键共价修饰到半胱氨酸的巯基上，与KLH偶联后免疫新西兰白兔，以获得抗棕榈酰化修饰的泛抗血清；

(2)第三次免疫后用ELISA技术检测抗血清的效价，然后收集抗血清；

(3)利用收集的抗血清对实验动物小鼠脑膜组分蛋白质进行免疫化学方法检测，通过比对抗血清对羟胺处理前后的小鼠脑膜组分蛋白质的western blot检测效果，评价该抗血清检测棕榈酰化修饰蛋白质的特异性；

(4)利用该抗血清对大肠癌细胞SW480中的棕榈酰化修饰蛋白质进行免疫化学方法检测，通过比对抗血清对羟胺处理前后的SW480细胞蛋白质的western blot检测效果，评价该抗血清检测棕榈酰化修饰蛋白质的特异性；

(5)采用高分辨的质谱方法对western blot检测结果阳性条带中的蛋白质进行鉴定分析，通过将鉴定蛋白质与已知棕榈酰化修饰蛋白质进行比对评价方法的可行性。

本发明提供了一种基于制备的蛋白质棕榈酰化修饰泛抗体血清以及利用含该泛抗体血清对复杂生物样本中棕榈酰化修饰蛋白质的高通量检测方法，经实验显示，本发明为高通量检测生物样本中蛋白质棕榈酰化修饰提供了有效的手段。

本发明的优点及有益效果为：

本发明方法首次采用棕榈酰化修饰的肽段作为抗原，制备了特异性强的棕榈酰化修饰泛抗血清，利用特异识别棕榈酰化修饰蛋白质的抗血清对蛋白质棕榈酰化修饰状态进行检测，该方法相比现有的通量分析方法具有特异性强的优点，假阳性率低，能够直接指示棕榈酰化修饰蛋白质，能用于各种来源的样本，结合质谱分析，能高通量地鉴定生物样本中棕榈酰化修饰的蛋白质，具有简便易行的可操作性。

附图说明

图1为western blot检测抗血清对小鼠脑膜组份样品中棕榈酰化修饰蛋白质的特异性，

图中，M-B-M-HA和M-B-M+HA分别表示未经羟胺处理和经羟胺处理后的小鼠脑膜组分蛋白混合物；实验过程中M-B-M-HA和M-B-M+HA样品经SDS-PAGE分离，转膜后，用丽春红染色(如右上两个泳道图示)，并以β-actin的抗体进行western blot分析为参照(如左下两个泳道图示)，结果表明，两个泳道上样量一致；左上两个泳道为采用泛抗棕榈酰化修饰血清孵育的结果，结果表明，在上样量相同的情况下，未经羟胺处理的蛋白质样品具有明显的信号，经羟胺处理后几乎没有条带出现，说明该抗棕榈酰化修饰的抗血清是有效的。

图2为western blot检测抗血清对大肠癌细胞SW480样品中棕榈酰化修饰蛋白质的特异性，其中，大肠癌细胞SW480全细胞提取蛋白质混合物经抗棕榈酰化修饰抗血清孵育后，呈现明显的阳性条带；箭头所示的蛋白质条带被用于PVDF膜上酶解和色谱-质谱分析鉴定蛋白质组成。

图3为蛋白质Apolipoprotein B-100(P04114)的肽段ENFAGEATLQR的质谱串级图，图示说明所述蛋白是可靠鉴定的。

图4为蛋白质Excitatory amino acid transporter 2(P43004)的肽段TSVNVVGDSFGAGIVYHLSK的质谱串级图，图示说明所述蛋白是可靠鉴定的。

图5为蛋白质Tyrosine-protein kinase Fyn(P06241)的肽段WTAPEAALYGR的质谱串级图，图示说明所述蛋白是可靠鉴定的。

图6为蛋白质Ras-related protein R-Ras 2(P62070)的肽段TGEGFLLVFSVTDR的质谱串级图，图示说明所述蛋白是可靠鉴定的。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施例对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 制备免疫抗原及对照抗原

采用本领域公知的方法合成含有棕榈酰化修饰的肽段及其对照肽段，并将肽段与载体蛋白耦联，本实施例中，由上海睿星生物技术有限公司完成所述肽段合成和蛋白耦联：合成不含棕榈酰化修饰的只含两个半胱氨酸的短肽5mg(用C-C表示)和含有棕榈酰化修饰的只含两个半胱氨酸的短肽9mg(用C-C(pal))表示，并将C-C和C-C(pal)耦联到牛血清白蛋白BSA上，分别表示为CC-BSA和C(pal)-BSA，同时将C-C(pal)耦联到mcKLH上，用C(pal)-KLH表示。

实施例2 抗原免疫制备蛋白质修饰泛抗体血清

将制得的C(pal)-KLH免疫实验兔子，分三次免疫，第一次免疫，200ug/兔，第二次和第三次免疫100ug/兔，三次免疫后，常规颈动脉放血，抗血清收集后保存于-20度。

实施例3 采用竞争法ELISA鉴定抗血清的特异性

1)包被合成多肽和蛋白C(pal)-KLH，C(pal)-BSA和CC-BSA作为抗原，浓度为2μg/ml，用封闭液倍比(2倍)稀释纯化抗血清(1：100起始)，进行ELISA检测，比较C(pal)-KLH，C(pal)-BSA和CC-BSA与抗血清反应后的OD值，判断 抗血清的效果，结果表明(如表1示)，抗原为正对照mcKLH-C-C(pal)时，具有明显的免疫反应；当以BSA-C-C(pal)为抗原时也有反应，说明该抗棕榈酰化修饰抗血清是有效的，其效价相对较低；2)减小抗血清的稀释比例，用封闭液倍比(2倍)稀释纯化抗血清(1：3起始)，进行ELISA检测，比较C(pal)-KLH，C(pal)-BSA和CC-BSA与抗血清反应后的OD值，判断抗血清的效果，结果表明(如表2示)，在稀释比例较小时，抗血清对BSA-C-C(pal)具有较强的免疫反应；因此，该抗棕榈酰化修饰抗血清需要在1:10～30梯度内使用；3)将兔抗血清1:30稀释后，加入0-100μl/ml梯度稀释的C-C(pal)2氨基酸肽(加入DMSO促溶)进行竞争实验，比较加入C-C(pal)2氨基酸肽前后OD值的变化情况，考察该抗血清的有效性，结果表明(如表3示)，该泛抗血清与BSA-C-C(pal)的反应可以被加入的C-C(pal)短肽竞争拉低数据，但不能完全终止，说明该兔血清有针对棕榈酰化修饰的抗体，亲和力相对较差。

表1显示了，将兔的抗血清从1:100开始梯度稀释后，用ELISA法检测抗棕榈酰化修饰抗血清的滴度及特异性。结果表明，抗原为正对照mcKLH-C-C(pal)时，具有明显的免疫反应；当以BSA-C-C(pal)为抗原时也是有反应的，说明，该抗棕榈酰化修饰抗血清是有效的。

表1

表2显示了，将上述兔抗血清进一步从1:3开始梯度稀释，用ELISA法检测抗棕榈酰化修饰抗血清的滴度及特异性，结果表明，在稀释比例较小时，抗血清对BSA-C-C(pal)具有较强的免疫反应，因此，该抗棕榈酰化修饰抗血清需要在1:10～30梯度内使用。

表2

表3显示了，将兔抗血清1:30稀释后，加入0-100μl/ml梯度稀释的C-C(pal)2氨基酸肽(加入DMSO促溶)进行竞争实验，结果表明，该泛抗血清与BSA-C-C(pal)的反应可以被加入的C-C(pal)短肽竞争拉低数据，但不能完全终止，说明该兔血清有针对棕榈酰化修饰的抗体。

表3

实施例4 抗血清对鼠脑膜组分中棕榈酰化修饰蛋白质进行检测

采用硫酸铵沉淀法纯化处理抗血清：将抗血清在20000×g，4℃条件下离心30min，收集上清；取400ul上清与等体积生理盐水混合后，于搅拌条件下缓慢滴加400ul饱和硫酸铵，4℃沉淀过夜使蛋白充分沉淀；在20000×g，4℃条件下离心10min，弃上清；用240ul生理盐水溶解蛋白质沉淀，滴加160ul饱和硫酸铵，4℃条件下沉淀1hr；在20000×g，4℃条件下离心10min，弃去上清；加入240ul生理盐水溶解沉淀，并超滤除去过量的盐，收集为100ul溶液，备用；

采用western blot方法，用所制备的泛抗血清(按1:20稀释)对小鼠脑膜组分中棕榈酰化修饰蛋白质进行检测，其包括步骤：

1)鼠脑膜组分的分离纯化：取新鲜的小鼠脑组织，剪碎后用预冷的PBS溶液洗去血液等，加入裂解液A(150mM NaCl,50mM Tris,5mM EDTA,pH 7.4)进行匀浆，高速离心(200000g，4℃)30分钟后收集其中的膜组分；

2)取5mg上述小鼠脑膜组分蛋白质，加入蛋白质裂解液B(2％SDS,50mM Tris,5mM EDTA,pH 7.4)，加入终浓度为20mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原打开蛋白质中的二硫键，并加入终浓度为50mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)避光反应，封闭蛋白质中的自由巯基；采用甲醇-氯仿沉淀蛋白质样品除去其中过量的TCEP和NEM，然后将蛋白质样品等分成两部分，其中一份加入pH 7.4的羟胺，另一份加入pH7.4的Tris溶液，室温处理2～3hr，加入甲醇-氯仿沉淀蛋白质后，加入裂解液A重悬蛋白质，用BCA法进行蛋白质定量；

3)免疫印迹实验：分别取羟胺处理和Tris溶液处理的蛋白质100ug，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)，将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入β-actin抗体(1:5000稀释，Cell Signaling)或泛抗血清(1:20稀释)震荡4℃孵育过夜，用TBS-T洗膜后，加入1：8000稀释的羊抗兔二抗(Thermo Scientific)，室温震荡孵育1小时，再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(Thermo Scientific)，用ImageQuant ECL仪器(GE公司)捕获显色图像，图1显示了：用β-actin抗体孵育后，由羟胺和Tris处理的两种蛋白质混合物免疫杂交信号相当，表明该两个样品上样量相同；但分别用棕榈酰化修饰蛋白质泛抗血清孵育后，只有Tris处理后的样品有明显的免疫杂交，而加羟胺组的样品中基本没有杂交信号，表明抗血清对棕榈酰化修饰蛋白质能够特异识别。

实施例5 抗血清对大肠癌细胞中棕榈酰化修饰蛋白质检测

将100ug大肠癌细胞蛋白质采用实施例4所述的方法，利用制得的特异泛抗血清对大肠癌细胞中棕榈酰化修饰蛋白质进行检测，图2显示了，用抗血清孵育后具有明显的免疫杂交信号；将PVDF膜上信号最强的条带剪下，剪碎，并用Milli Q纯水洗净，向样品溶液中加入终浓度为10mM的新鲜配制的二硫苏糖醇，56℃，振荡反应1小时，还原打开蛋白质中的二硫键；反应完成后，弃去溶液，在膜中加入终浓度为100mM的碘乙酰胺溶液，室温、避光条件下反应45分钟进行烷基化反应；弃去上清，按1：50(酶：蛋白质)加入测序级胰蛋白酶(Promega)，37℃酶解过夜，加入0.1％TFA-50％ACN提取肽段三次，用SpeedVac真空抽干，用20ul0.1％FA-5％ACN水溶液重悬，15000g，室温离心30min，取15ul上清进行LC-MS分离分析，采用Magic C18AQ反相色谱柱(100μm id×15cm,美国Michrom Bioresources公司)进行色谱分离，色谱梯度：B相(90％ACN-1％FA)在70分钟从5％线性上升到45％，流速为500nL/min。LTQ Orbitrap XL质谱仪(美国热电公司)，如表4所示，所鉴定的蛋白质中有APOB[Zhao Y等，Mol.Biol.Cell,2000,11:721-734]，SLC1A2，FYN和RRAS24个蛋白质在Uniprot数据库注解为已知的棕榈酰化修饰蛋白质，结果表明，该抗血清对棕榈酰化修饰蛋白质能特异识别；图3～图6分别显示了所述4个蛋白质的质谱鉴定谱图。

表4显示了蛋白质的质谱鉴定情况，将图2中箭头所示条带从PVDF膜上切下来，进行蛋白质酶解，色谱-质谱分析，通过与Uniprot数据库进行比对，发现表中所列的这4个鉴定蛋白质是已知的棕榈酰化修饰蛋白质，表中列出了该蛋白质的登录号，基因名，蛋白名称，质谱鉴定时的蛋白质得分以及Uniprot数据库中已报道的棕榈酰化修饰位点。

表4