一种快速检测转基因植物中转基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac的方法与流程

本发明涉及转基因水稻、玉米、棉花、大豆等作物的谷物散粮及其粗加工产品中的蛋白BT-Cry1Ab/Ac的快速检测方法，属于转基因检测领域。

背景技术：

随着各种各样的转基因食品大量涌入市场，转基因食品的安全性日益备受关注，世界各国对转基因食品的安全性存在较大的争议。欧盟，日本等地区已制定相关法规对转基因食品进行严格的管理。因此，快速检测转基因作物/植物中转基因蛋白的方法具有重要的意义。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广泛存在于土壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中。二十世纪50年代，人们发现Bt菌的杀虫活性与其伴胞晶体有关，并证实这种伴胞晶体由蛋白质组成(包括Cry1Ab，Cry1C等)，通常被称作杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。这种蛋白亦成为如今抗虫转基因作物中最为常用的抗虫蛋白质之一。

目前常用的Bt杀虫晶体蛋白检测方法包括基于DNA的PCR检测方法及基于蛋白质的酶联免疫吸附法。PCR法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确检测，不受样品的处理方法的影响，但易出现假阳性和假阴性等问题，且因经高度处理过的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何DNA成分，因此PCR方法无法实现对此类转基因食品的检测。酶联免疫吸附法可对样本进行批量处理，但其耗时较长，需要专业技术人员，且需特殊的仪器，因此该种检测方法不利于在无相关专业技术用户市场的推广和使用。本发明采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明提供一种快速检测转基因植物中转基因蛋白 Bt-Cry1Ab/Ac的方法，采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种快速检测转基因植物中转基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac的方法，包括以下步骤：

步骤一，胶体碳的制备；

步骤二，适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备；

步骤三，抗体包被至反应膜作为T线及二抗包被至反应膜的C线；

步骤四，胶体碳试纸条的制备；

步骤五，从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；

步骤六，将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；

步骤七，适当反应时间后，进行肉眼判断结果。

优选的，步骤二中所述抗体为鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac单克隆抗体；优选的，步骤二中PH值为8～10，最优选的PH值为9.0。

优选的，步骤三中所述抗体亦为鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac单克隆抗体。

优选的，步骤三中抗体包被量为100ug/1ml碳。

优选的，步骤三中所述二抗为羊抗鼠IgG抗体。

优选的，步骤六中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。

优选的，步骤七中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。

本发明的优点是：采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。采用胶体碳检测试纸条，制备出表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒，胶体碳相对胶体金具备一系列优越性：胶体碳较胶体金更易制备，更易实现规模化生产且批间差小；胶体碳黑白信噪比更高，而胶体金红白对照不易辨别且易受全血检测的影响；检测动力学范围更广，大大降低了胶体金易出现的HOOK效应的可能性；较胶体金更稳定，可于室温下保存更久；固态碳对环境友好，避免了胶体金技术出现的环境重金属污染的情况。快速检测转基因植物中转基因蛋白采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和NC膜检测线 上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。

附图说明

图1为胶体碳试纸条的结构示意图。

图2为本发明与美国一龙同类产品性能比较图。

图3中本发明与北京奥创生物同类产品性能比较图。

在图中：1-PVC底板，2-样品垫，3-硝酸纤维素膜，4-C线，5-T线，6-吸水滤纸，7-胶体碳垫，8-加样区。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

参见图1～图3，一种快速检测转基因植物中转基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac的方法，包括以下步骤：

步骤一，胶体碳的制备；

步骤二，适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备；

步骤三，抗体包被至反应膜作为T线及二抗包被至反应膜的C线；

步骤四，胶体碳试纸条的制备；

步骤五，从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；

步骤六，将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；

步骤七，适当反应时间后，进行肉眼判断结果。

优选的，步骤二中所述抗体为鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac单克隆抗体；优选的，步骤二中PH值为8～10，最优选的PH值为9.0。

优选的，步骤三中所述抗体亦为鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac单克隆抗体。

优选的，步骤三中抗体包被量为100ug/1ml碳。

优选的，步骤三中所述二抗为羊抗鼠IgG抗体。

优选的，步骤六中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。

优选的，步骤七中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。

作为优选实施例，步骤一胶体碳的制备方法具体为：

1、向100g碳粉中加入超纯水，定容至500ml，搅拌溶解30分钟后离心(12000g，30分钟)，收集上清于干净的烧杯中；

向步骤1的溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的终浓度(质量体积比)为20％，CTAB的终浓度(质量体积比)为0.1％；

2、将步骤2所得溶液进行超声破碎：超声变幅杆Φ6，输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟(宁波新芝超声波细胞粉碎机，Scientz-IID)，使之成为悬浮状的胶体碳纳米颗粒溶液；电镜下观察，颗粒直径覆盖范围由数十纳米至数百纳米不等；

3、、向步骤3所得溶液中加入100ml的无水乙醇，充分搅匀后，加入10ml硅烷化试剂(购于Thermo公司，货号48927)，搅拌速度200转/分钟，通入氮气情况下，55℃反应8小时；待反应结束后，用无水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02M PBS(PH7.4)缓冲液洗涤3～5次，至此，制备完成表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒。

作为优选实施例，步骤二适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备具体方法为：

1、胶体碳最适PH值确定

向一系列不同PH值梯度的硼酸盐缓冲液中先后加入0.1％纳米碳悬液及0.1％TritonX-100。超声处理(300W，超声6秒停4秒，工作80个循环)上述混合液后，200rpm离心10分钟，收集上清并静置24小时后，观察无沉淀者即为最适PH值。本发明中，PH9时，胶体碳最为稳定，无沉淀，因此PH 9作为标记抗体最适PH值。

2、单克隆抗体的胶体碳标记

向800ul 0.02M硼酸缓冲液(PH9.0，下同)中加入100ul抗Bt-Cry1Ab/Ac单克隆抗体M03(购买于华葵金配公司，1mg/ml)，涡旋振荡混匀。向上述混合液中加入20ul 1.5％(质量体积比)EDC溶液，于室温条件下旋转震荡20分钟；向上述混合液中加入200ul实施例所制备胶体碳纳米颗粒，于恒温摇床中300转，25℃放置2小时；向上述混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸缓冲液，继续于恒温摇床中300转，25℃放置5小时；于12000g离心20分 钟，留取沉淀，0.02M硼酸缓冲液反复重悬-离心，洗涤4次；最终，1ml 0.02M硼酸盐缓冲液重悬沉淀并于超声破碎仪(宁波新芝超声波细胞粉碎机，Scientz-IID)中，超声分散输出功率60％，超声开时3秒，关时3秒，总时长5分钟；至此，即得胶体碳标记的Bt-Cry1Ab/Ac抗体，置于4℃保存备用。

作为优选实施例，胶体碳试纸条的制备方法具体为：

本发明检测试纸条采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和NC膜检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。具体步骤包括：

1、制备用胶体碳标记的Bt-Cry1Ab/Ac抗体M03。

2、碳标垫及反应膜的制备：

按照1∶100比例稀释胶体碳标记的鼠抗BT-Cry1Ab/Ac单克隆抗体M03，喷涂于胶体碳垫上，干燥后备用；按照1∶8000比例稀释单克隆抗体M02(初浓度为1mg/ml，购买于华葵金配公司)及1∶10000比例稀释羊抗鼠IgG(初浓度为1mg/ml)后分别包被于硝酸纤维素膜的T线及C线位置，干燥后备用。

3、贴膜及切膜：

从左向右依次将样品垫，胶体碳垫，硝酸纤维素膜，吸水滤纸依次贴附于PVC底板上且相互之间依附搭接相连。完成之后将试纸切割成宽3mm的试纸条成品。

转基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac快速检测试纸条的性能评价：

将本发明所述转基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac快速检测试纸条分别与市售美国一龙公司及北京奥创生物同类产品进行性能比较，具体如下：

1、与美国一龙公司同类产品比较

分别按照产品说明书，对阳性样品1％Bt63大米(水稻品系为Bt63，别称Bt籼优63或者TT51-1)两批次Riogene产品与美国一龙同类产品进行测试比较，采用娃哈哈纯净水作为阴性对照，检测结果如图2。左一试纸条为美国一龙同类产品，其余均为本发明试纸条。结果可见，本发明检测试纸条具有更好的灵敏度。

2、与北京奥创生物同类产品比较

分别按照产品说明书，测试阳性KMD1大米(水稻品系为KMD1，别称克螟稻)。其中样品1为5％KMD1大米，样品2为1％KMD1大米；左侧为北京奥创生物同类产品，右侧为本发明检测试纸条。检测结果可见，本发明检测试纸条亦具有更高的灵敏度。样品1为5％KMD1大米，样品2为1％KMD1大米；左侧为北京奥创生物同类产品，右侧为本发明检测试纸条。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。