一种用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：血管生成(Angiogenesis)是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常，且血管基质不完善，这种微血管容易发生渗漏，因此肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。越来越多的研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。血管生成机制复杂，参与并促进血管生成的因子也众多，VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的血管形成刺激因子。它是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的有丝分裂原。TNF-α是一类具有血管活性的细胞因子，可诱导异位子宫内膜炎性细胞因子MCP-1、IL-6和IL-8等的释放，促进异位内膜及基质细胞增殖及炎性细胞浸润，新生血管形成，组织粘连，从而形成异位病灶。基质金属蛋白酶(MMP)通过降解基底膜糖蛋白及细胞外基质成分，启动了内皮细胞的激活和迁移，整合素家族通过和不同配基结合，介导血管内皮细胞的迁移和黏附，有助于新生血管的成熟和稳定，细胞黏附因子(ICAM-1)可产生免疫抑制和降低自然杀伤细胞的杀细胞毒性，有助于异位组织逃避机体免疫系统和自然杀伤细胞的的杀伤，促进异位组织侵入后的血管生成。转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、乙酰肝素酶、血管生成素(angs)、骨生成素(OPN)、环氧化酶(COX－2)、缺氧诱导因子-1、层粘连蛋白(LN)、胎盘生长因子 (PLGF)、Survivin、促红细胞生成素(Epo)均参与了EMT血管形成过程。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的血管形成刺激因子。目前常用的血管生成因子检测方法主要包括：酶联免疫吸附法(ELISA)，流式细胞仪(Flow-Cytometry)等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点，但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的血管生成因子检测中，该方法存在明显的不足。流式细胞仪能在细胞水平上检测血管生成分子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。技术实现要素：针对现有技术的操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等不足，本发明的目的在于提供一种用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒，该试剂盒能够通过一次实验而检测20种血管生成因子，具有高通量、高灵敏度、高特异性和低成本、标本用量少的特点，能在普通实验室推广和规模化等优点。本发明所述的一种用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒，包括：由用于点样的标准载玻片、用于防止漏液的软质硅胶垫、划分为若干个小格的硬质框架、U形框夹形成的反应槽，所述U形框夹从两侧将由下至上放置的尺寸对应的所述硬质框架、所述软质硅胶垫和所述标准载玻片夹紧在一起，以致所述标准载玻片贴紧封闭所述硬质框架的底部，使所述硬质框架上的每个小格形成一个小的反应槽，各个小的反应槽里的标准玻片结合有相应浓度的抗血管生成因子的特异性抗体；所述硬质框架划分为1×4或者2×8个小孔，形成4或16孔框架。根据本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述特异性抗体为针对选自如下20种血管生成因子的抗体：ANG、EGF、ENA-78、bFGF、GRO、IFN-γ、IGF1、IL6、IL8、Leptin、MCP1、PDGF-BB、PIGF、RANTES、TGF-β1、TIMP1、TIMP2、THPO、VEGF、VEGF-D。根据本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述的特异性抗体是通过全自动点样仪完成点样操作，将特异性抗体固定于玻片的方法包括：1)特异性抗体与含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔；3)抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点10至100个特异性抗体。各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列，通过控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。根据本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述玻片上还有阳性对照孔，点样对应特异性抗体的具有相应浓度的生物素化IgG抗体，每个反应的生物素化的IgG抗体的浓度一致；根据本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述玻片上还有阴性对照孔，点样具有相应浓度的生物素化的无关抗体，每个反应的生物素化的无关抗体的浓度一致。根据本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述样本处理液为包含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液，用于裂解细胞沉淀物，可处理血浆、血清、尿液、咽拭子、细胞培养物、组织等样本。本发明还提供了根据本发明所述的抗体芯片试剂盒用于检测人受体酪受酸激酶的磷酸化抗体的方法，其特征在于：通过改良的夹心酶联免疫吸附法测定RTK磷酸化蛋白，所述的特异性抗体与样品中的目标抗原结合，经过筛选的检测抗体与目标抗原的另一区域结合形成稳定的化合物；结果判定根据以下计算方式：X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)，减去背景信嗓值后，其中P1表示阳性对照在参考组中的信号强度，P(y)表示阳性对照在反应组中的信号强度，X(y)表示样本在反应组中的信号强度,表示样本在反应组中的检测值。当检测值大于参考值1.5倍或者小于参考值0.65倍，可分别判定为阳性或者阴性。本发明所述的抗体芯片试剂盒结合了玻片式抗体芯片平台与半定量芯片平台的优势：(1)在一个实验中，同时检测出20种血管生成因子；(2)无需进行蛋白沉淀和蛋白印记等实验；(3)不需要特殊的设备，普通实验室即可应用；(4)工作流程短，不需要同位素放射性物质；(5)灵敏度高(可检测出pg量的蛋白质)；(6)检测的特异性高、样品范围广、信号检测多样。本发明所述的抗体芯片试剂盒可通过监测血管生长因子表达水平的变化，能对相关癌症如肝癌、肺癌、食道癌、肾癌、淋巴癌进行辅助诊断。附图说明图1是本发明所述的用于检测血管生成因子的抗体芯片试剂盒的一个实施例的抗体点样示意图。图2为本发明所述的用于检测凋亡因子的抗体芯片试剂盒所采用的1×4芯片框架以及2×8芯片框架的示意图。图3为用间接ELISA法测定本发明所述试剂盒中的抗Angiogenin抗体的灵敏度。图4为本发明所述抗体芯片试剂盒检测肿瘤组织样本的结果，图中，T1为第一种肿瘤组织样本，N1为T1对应的正常组织样本，T2为第二种肿瘤组织样本，N2为T2对应的正常组织样本。图5为本发明所述试剂盒的抗体交叉反应结果。具体实施方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1：试剂盒的制备。1、抗体的筛选与来源抗体来源信息如下：表1：这些特异性抗体通过全自动点样仪完成点样操作，将特异性抗体固定于玻片的方法包括：1)特异性抗体与含有1.4至2％酪蛋白的pH7.4磷酸盐缓冲液混合形成抗体混合物；2)于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至2ng固定于所述点样孔，每个抗体设置2至4个重复孔；3)抗体芯片点阵排布于玻片，玻片每平方厘米点10至100个特异性抗体。各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体芯片排布阵列，通过控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。图1显示了本发明所述的用于检测人RTK磷酸化抗体芯片试剂盒的一种抗体点样示意图。全自动点样仪为美国铂金艾尔默公司生产的产品；玻片为美国康宁公司产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。2、试剂盒的化学组份固相载体：已包被抗体的标准玻片洗涤液：含吐温20的20X浓缩洗涤液。1X洗涤液为pH7.2，含0.1％吐温20、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。稀释液：2瓶用于稀释样本的15ml5X浓缩稀释液D，1瓶用于稀释抗体和HRP-链亲和素的15ml5X浓缩稀释液B。1X稀释液B为15mM,pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述稀释液B中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mMNaCl。1X稀释液D为15mM,pH6.5的PBS缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2-4％蔗糖，150mMNaCl。检测抗体：生物素化的检测抗体混合物。200μl300X浓缩荧光素-链亲和素溶液。样本处理液：2X细胞裂解液10ml，1X细胞裂解液包含10mMpH7.5，Tris.HCl，25mMNaCl，1％脱氧胆酸钠，1％TritonX-100，包含磷酸酶及蛋白酶抑制剂。实施例2：用本发明的试剂盒检测血管生成因子的实验。1、玻片芯片的完全干燥将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。2、芯片操作流程每个孔中加50-100μl的样品，不同样品的加样量不一样：血浆，血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50－500ug/ml的量。3、清洗抽去每个孔中的样品，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗涤液，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗涤液。4、检测抗体混合物的孵育离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。5、清洗抽去每个孔中的检测抗体，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。6、Cy3-链霉亲和素的孵育离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。8、清洗抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，洗涤液清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的洗涤液，每次清洗要抽干净洗液。9、荧光检测9.1将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。9.2将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的洗涤液，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去洗涤液。9.3去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。9.4采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。10、芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。利用GenepixPro6.1软件获取芯片上所有点的信号强度。利用自行开发的电子表格版的分析软件计算每个蛋白的表达水平和标准曲线，利用阳性对照信号标准化。背景阈值设置对照组的平均强度加上2倍标准偏差(SD)进行统计，表达水平高于背景加上2×SD的蛋白用于校正的T检验分析。结果判定根据以下计算方式：X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)，减去背景信嗓值后，其中P1表示阳性对照在参考组中的信号强度，P(y)表示阳性对照在反应组中的信号强度，X(y)表示样本在反应组中的信号强度,表示样本在反应组中的检测值。当检测值大于参考值1.5倍或者小于参考值0.65倍，可分别判定为阳性或者阴性。实施例3：试剂盒的质量检测1)本发明的试剂盒的检测灵敏度。以抗Angiogenin抗体举例说明芯片中各抗体的灵敏度，检测限的检测结果。具体步骤按照间接ELISA法：(1)酶标板的包被：用包被液(Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N31.2g，加ddH2O到1L，调pH到9.6)将抗原蛋白浓度按梯度稀释加入到96孔酶标板中，每孔100μL，将板密封于4℃过夜。(2)酶标板的封闭：将包被过夜的酶标板拍干，加入200μL/well的封闭液，370C封闭2h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，并于4℃备用，或-200C长期保存。(3)加入抗Angiogenin抗体，100μL/well，于37℃温育1h，用洗板机洗板6次后将酶标板拍干，再加入一定浓度的HRP标记羊抗-小鼠IgG抗体(购自美国Raybiotech)，100μL/well，于37℃温育1h；洗板后加入TMB显色液，待显色完全后，加入2M的浓硫酸终止显色，并用酶标仪(美国Biotek)测定OD450。检测结果见图3。如图3所示，抗Angiogenin抗体灵敏度为1.5pg/ml。以相同的原理和方法得到其他抗体的灵敏度数据如下表2：表2：实施例4：试剂盒的应用配制ProteaseInhibitorCocktail(蛋白酶抑制剂组合物)：将ProteaseInhibitorCocktail小管简单离心一下，然后将盖子打开，加入60μL稀释好的1X样本处理液在小管中，混匀溶解蛋白酶抑制剂。取10μL配制好的蛋白酶抑制剂，加入到990μL的1X样本处理液中，混匀，即配制好的已添加蛋白抑制剂的细胞/组织裂解液，备用。将配制好的细胞/组织裂解液和1XPBS在冰上预冷。从-80度冰箱取出冰冻组织，取组织，用手术剪刀将其剪碎至1-3mm3，转移至2ml离心管，加入150μL样本处理液，置冰上保持低温，匀浆机裂解组织，5-15min(根据具体组织而定)。冷冻离心机离心13000rpm10min；取上清备用。细胞裂解后，测定样本蛋白浓度(BCA法Pierce公司，货号：23227)。采用BCA试剂盒检测组织裂解液蛋白浓度，测定结果如下：样品ID蛋白浓度(mg/ml)T124.44N128.22T243.06N230.09玻片芯片的完全干燥,将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时.每个芯片孔中加入100μL样品，一个阵列一个样品，4℃振荡过夜孵育。(样品离心14000rpm4min，样品0.5mg/ml上样)使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板机清洗玻片，首先用1×洗液I进行清洗，每孔250μl洗液I，清洗6次，每次震荡10s，震荡强度选择高。配制生物素标记抗体，快速离心生物素标记抗体的小管，每个小管加入300μL的1×抗体稀释液，混合均匀。每孔加入70ul生物素标记抗体；室温震荡孵育2个小时。清洗，清洗步骤同上。每孔加入70μl的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素(快速离心后加入1.5ml的封闭液到荧光剂-链霉亲和素的小管)，用密封条贴住玻片，然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1-2个小时。(此步也可在4℃过夜孵育)清洗，清洗步骤同上。采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，扫描仪器为GenePix4000BMicroarrayScanner，扫描参数：PMT： 700,Wavelengh：532nm；resolution：42um。采用芯片分析软件提取数据，采用AAH-ANG-G1及AAH-ANG-G2的数据分析软件来进行数据分析。本发明所述抗体芯片试剂盒检测肿瘤组织样本的结果如图4所示，T1图显示肺癌组织样本在芯片上样后的扫描结果，N1为T1对应的正常肺部组织样本，T2为白血病细胞K562细胞裂解液样本，N2为T2对应的正常白细胞裂解液样本。通知激光扫描仪对发光点进行微调，扫描结果显示蛋白表达的细小变化。由结果可知，肺癌组织的蛋白EGF,ENA-78,Leptin的表达量显著增加，白血病细胞蛋白EGF,bGFG,IL-8,Leptin,PLGF,VEGF-D的表达量显著增加。经X(Ny)＝X(y)*P1/P(y)公式判定为阳性表达，说明这九个蛋白在肿瘤细胞中有异常表达。实施例4：试剂盒的抗体交叉反应结果。具体操作步骤如实施例3如述，抗体交叉反应结果见图5。由结果可知，每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原，而与其他的抗原没有交叉反应。当前第1页1 2 3