一种检测肾癌标记物的抗体芯片试剂盒的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种抗体芯片试剂盒，尤其是涉及一种检测肾癌标记物的抗体芯片试剂盒。
背景技术：
：肾癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤。肾癌典型的临床表现是血尿、腰部肿块和疼痛，但这三个症状一般只有到晚期病变时才会同时出现。因此，对40岁以上的病人，出现以上任何一个症状都应引起高度重视，尤其是无痛性全程肉眼血尿往往是肾癌的首发症状，更应首先考虑和排除肾肿瘤的可能。但不是所有的肾癌病人都会出现血尿，目前临床中无症状肾癌的比率逐年升高，约占总数70％。近些年来，大多数肾癌患者是由于健康查体时发现的无症状肾癌，这些患者占肾癌患者总数的50％～60％以上。有症状的肾癌患者中最常见的症状是腰痛和血尿，少数患者是以腹部肿块来院就诊。10％～40％的患者出现副瘤综合征，表现为高血压、贫血、体重减轻、恶病质、发热、红细胞增多症、肝功能异常、高钙血症、高血糖、血沉增快、神经肌肉病变、淀粉样变性、溢乳症、凝血机制异常等改变。20％～30％的患者可由于肿瘤转移所致的骨痛、骨折、咳嗽、咯血等症状就诊。诊断肾癌需要进行实验室检查、影像学检查和病理学检查。实验室检查的目的是作为对患者术前一般状况、肝肾功能以及预后判定的评价指标，主要包括尿素氮、肌酐、肝功能、全血细胞计数、血红蛋白、血钙、血糖、血沉、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶等。目前，肾癌的临床诊断主要依靠影像学检查，确诊则需病理学检查。由于影像学检查诊断肾癌的符合率高达90％以上，而肾穿刺活检病理检查诊断肾癌的价值有限，所以通常不做肾穿刺活检检查。尚无公认的可用于临床诊断肾癌的肿瘤标记物。有鉴于此，有必要开发一种新型的肾癌标记物定量检测试剂盒，涵盖了相关的肾癌标志物，以克服现有技术中亟待解决的问题，实现多种受体的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测肾癌标记物的抗体芯片试剂盒，该试剂盒通过测定174个蛋白质的表达水平，从而筛选出angiopoietin2,vegf,ccl28,il6，stnfrii，cntf,igfbp1,egf,pdgf-bb,flt-3ligand,m-csf11种蛋白对应的抗体作为肾癌芯片试剂盒的特异性抗体，一次实验迅速、简捷和准确地检测肾癌标记物，而不需要昂贵的检测仪器(westernblotting)。本发明所述的一种检测肾癌标记物的抗体芯片试剂盒，包括：固相载体、样本稀释液、洗涤液、冻干蛋白标准品混合物、检测抗体混合物、结合链亲合素的cy3染料底物、封口膜；其特征在于：所述固相载体为包被与肾癌相关的蛋白标记物的特异性抗体的标准组织玻片。根据本发明所述的检测与肾癌相关的蛋白标记物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述与肾癌相关的蛋白标记物是：angiopoietin-2、vegf、ccl-28、il-16、stnfrii、cntf、igfbp-1、egf、pdgf-bb、flt-3ligand以及m-csf蛋白。根据本发明所述的检测与肾癌相关的蛋白标记物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述肾癌相关蛋白标记物检测抗体混合物在24℃、40％的湿度条件下点样到固相载体上。根据本发明所述的检测与肾癌相关的蛋白标记物的抗体芯片试剂盒的进一步特征，所述玻片是通过亲水试剂处理后在20至26℃条件下与特异性抗体紧密结合的。优选地，所述亲水试剂是烷基糖苷。更优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。最优选地，所述亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。本发明选用没有空间限制的标准组织玻片作为载体，可使点在同一微阵列上检测肾癌标记物的数目，可以不受空间的限制。由于玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测几十个因子。本发明采用抗体夹心法原理在玻片表面进行多重elisa反 应，不仅一次可以检测多十个肾癌标记物，并且所检测的肾癌标记物灵敏度可达单因子的elisa检测灵敏度。定量抗体芯片平台采用多重夹心elisa的技术，使研发人员能够准确地同时测定多个肾癌标记物的浓度。它结合了elisa高灵敏度和特异性的优点，以及高通量的检测技术，将捕获抗体结合到固体载玻片上，加入样品孵育后再加入生物素标记的检测抗体，最后加入链霉亲和素-cy3标记物荧光染料进行激光扫描。不同于传统的elisa方法，定量抗体芯片采用阵列结构，使通过多重捕获抗体结合玻片的支持，实现了在一个玻片中同时检测多个肾癌标记物。抗体芯片试剂盒通过类似于夹心法elisa的检测方法，用含cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，选用合适的激光扫描参数使芯片上最高信号接近饱和，所得图像存储为tiff文件。然后用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号。通过梯度稀释的肾癌标记物的标准样品的数码信号绘制每个肾癌标记物的信号与浓度标准曲线，然后通过相应的标准曲线计算出每个肾癌标记物在未知样品中的浓度。本发明所述的检测肾癌标记物的抗体芯片试剂盒具有以下优点：(1)克服了常规elisa在受体检测中的检测指标单一，耗时，耗力，耗材等缺点，同时也克服了现有多因子检测技术中的低通量，重复性差等弱点。本发明使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心elisa的反应。同时抗体芯片的规格符合标准96孔酶标板的尺寸，使得高通量样品操作成为可能。(2)本发明所述抗体芯片试剂盒所检测的受体的浓度可以达到单个elisa的检测灵敏度和精确度。附图说明图1a至图1c为本发明所述的用于筛选肾癌标志物的抗体芯片点阵图。图2a和图2b为本发明所述的抗体芯片在癌旁、正常、癌症样本中的扫描结果。图3为本发明所述的抗体芯片从one-wayanova两两比较分析得到的50个差异因子进行聚类。具体实施方式实施例1：抗体芯片载体的筛选。常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片的洗涤难度大，以致芯片的背景高，结果波动大。同时硝酸纤维素膜易碎，不易于大规模的操作，用于大规模临床样本的使用还不普遍。而传统的玻片价廉且背景低，这给诊断和研究领域的广泛使用带来了突破。我们筛选了市面上不用活性方法处理的玻片，无论是醛基化还氨基化的玻片点样效果不稳定。经过大量的筛查得出温度，湿度及玻片表面的活性试剂成分才是决定玻片点样效果的关键。为了使抗体固定在玻片表面，我们筛选了不同方法处理玻片，如下表。各种玻片的处理方法如下：第1组为氨基化玻片，购自康宁公司，货号为ultragaps40019。第2组为醛基化玻片：将第1组玻片加入戊二醛浸泡40分钟制作醛基化玻片。第3组为apes玻片：将普通玻片加入丙酮稀释的apes中浸泡0.5至1分钟，再用纯丙酮清洗制成apes玻片。第4组为多聚赖氨酸玻片：将普通玻片加入pbs稀释的多聚赖氨酸浸泡0.5至1个小时，再用纯水清洗制成多聚赖氨酸玻片。第5组为经亲水试剂处理的玻片：将普通玻片用亲水试剂处理，亲水试剂为0.01至0.1％的烷基糖苷。亲水试剂为质量分数为0.01～0.2％的烷基糖苷、0.01～0.1％的甘油，0.01～0.05％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3～5分钟，晾干即可。各种玻片的点样效果不尽相同，其中经过氨基化及亲水处理的玻片较其他的类型效果较高。在20至26度条件下，玻片点样效果较清晰，背景值低；而在27至30度条件下，无论何种玻片的点样效果都出现扩散现象，温度湿度越高，扩散越明显。将上述5组玻片结合抗体后加入二抗及底物，在不同的温度及湿度条件下的灵敏度(ng/ml)筛选结果如下表1：表1：综合以上指标，选择经过亲水试剂烷基糖苷处理的玻片作为固相载体。优选的亲水试剂为质量分数为0.1％的烷基糖苷、0.05％的甘油，0.01％的聚乙二醇4000的超纯水溶液；亲水试剂处理玻片的方法为将玻片在亲水试剂中浸泡3分钟，晾干即可。实施例2：本发明所述的抗体芯片试剂盒的制备。本发明所述的抗体芯片试剂盒包括以下组份：1、结合11种特异性抗体的定量抗体芯片玻片。2、样本稀释液：为通用的样本稀释液。2瓶用于稀释样本的15ml5x浓缩稀释液d，1瓶用于稀释抗体和hrp-链亲和素的15ml5x浓缩稀释液b。1x稀释液b为15mm,ph7.4的pbs缓冲液，溶质及其在所述稀释液b中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.5％酪蛋白，2-4％蔗糖，150mmnacl。1x稀释液d为15mm,ph6.5的pbs缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2-4％蔗糖，150mmnacl。3、洗涤液：为通用的洗涤液。含吐温20的20x浓缩洗涤液。1x洗涤液为ph7.2，含0.1％吐温20、0.1mol/l的磷酸盐缓冲液。4、冻干蛋白标准品混合物：为经过筛选的目标蛋白混合物，可通过稀释作为梯度标准品。5、检测抗体混合物：生物素化的检测抗体混合物。6、结合链亲合素的cy3染料底物。7、封口膜。用于筛选肾癌标志物的三种抗体芯片为h6、h7、h8，特异性抗体的点阵图分别见图1a、图1b和图1c。抗体芯片的制备：表2：特异性抗体所针对的抗原蛋白质名称将以上各个蛋白质用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于－80℃保存。2、抗体芯片的制备与保存将含特异性抗体的pbs缓冲液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白)用全自动点样仪点样于玻片上。具体的芯片点阵以生物素标记的牛igg作为阳性对照。10种抗体及三种不同浓度的阳性对照在每个阵列中都有四个重复点。在本实施例中芯片阵列采用如图1所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，芯片阵列还可以以其它的排布方式进行组合，并不局限于如图所表示的形式。每张玻片上有16个相同的芯片阵列。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。干燥后的玻片装上配套的16孔框架把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。u形框夹从两侧将16孔框架，硅胶垫与标准载玻片卡贴紧在一起，以致标准载玻片贴紧封闭16孔框架的底部，使16孔框架上的每个小格形成一个小的反应孔,16孔框架边缘分别按照孔的位置标注1至16的凹陷数字以方便辨认。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。本实施例中，全自动点样仪为美国伯乐公司或铂金艾尔默公司生产的产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。实施例3：用本发明的试剂盒定量检测肾癌标记物的实验。1、玻片芯片的完全干燥将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。2、对表1所示的肾癌标记物蛋白梯度进行梯度稀释2.1、添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为std1。2.2、分别标记6个干净的离心管为std2、std3到std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。2.3、抽取100μl的std1加入到std2中轻轻混合，然后从std2中抽取100μl加入到std3中，如此梯度稀释至std7。2.4、抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为cntrl，作为阴性对照。注：因为每种细胞因子的起始浓度是不同的，所以std1到std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的。3、芯片操作流程3.1、每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。3.2、抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。注：不同样品的孵育量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入5-50ug的量。3.3、清洗抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液i。抽去每个孔中的1×洗液i，加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液ii。3.4检测抗体混合物的孵育离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次 快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。3.5清洗抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液ii清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液ii，每次清洗要抽干净洗液。3.6cy3-链霉亲和素的孵育离心cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。3.7清洗抽去每个孔中的cy3-链霉亲和素，1×洗液i清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液i，每次清洗要抽干净洗液。3.8荧光检测1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液i，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液i，添加约30ml的1×洗液ii，在室温摇床上震荡5min。3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。4)采用激光扫描仪例如axongenepix扫描信号，采用cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析1)用genepix软件来读取生物芯片的荧光值。2)读数后选用的数值为扣除点周围背景的中间值读数(f532median-localbackground)。用特定的定量芯片软件来作每个肾癌标记物蛋白的标准曲线。实施例4：抗体芯片在癌旁、正常、癌症样本中的扫描结果。采用20例肾癌组织(t)，20例癌旁组织(p)，20例正常肾组织(n)分别加入抗体芯片中进行检测，扫描结果去掉背景值，以阳性对照的强度比值作为归一化因子进行数据分析。定量抗体芯片的在不同样品中的检测结果如图2a和图2b所示。图2a为抗体芯片h6在第7号病人的癌组织、癌旁组织、正常肾组织的检测结果。如图2a所示，在癌组织中ccl28、il-16蛋白浓度上升，egf、pdgf-bb蛋白浓度下降。图2b为抗体芯片h6在第5号病人的癌组织、癌旁组织、正常肾组织的检测结果。如图2b所示，在癌组织中egf、flt-3l、igfbp1、m-csf蛋白浓度下降。数据分析结果如下表：表3：表4：表5表6表7表8表9表10表11实施例5：one-wayanova两两比较分析抗体芯片从one-wayanova两两比较分析得到的50个差异因子进行聚类。红色部分代表蛋白的表达量高，绿色部分代表蛋白的表达量低。如图3所示，cxxl-16、timp1、lap等蛋白在肿瘤组织中的表达量较高，而nap-2、igfbp6等蛋白在肿瘤组织中的表达量较低。由此可从各个蛋白的表达水平判断出样本是否为肿瘤组织。综合抗体芯片中进行检测，扫描结果去掉背景值，以阳性对照的强度比值作为归一化因子进行数据分析得到肾癌组织相对于正常组织：angiopoietin-2、vegf、ccl28、il16，stnfrii蛋白上调，cntf、igfbp1、egf、pdgf-bb、flt-3ligand、m-csf蛋白下调，芯片采用这11种抗体对作为特异性标志物用于肾癌芯片的检测。肾癌芯片点阵图如下：正对照1正对照2angiopoietin-2vegfccl28il16cntfigfbp1egfpdgf-bbflt-3ligandstnfriim-csf负对照负对照当前第1页12