一种糖皮质激素微乳毛细管电动色谱法的大体积进样—非匀强电场扫集在线富集技术的制作方法

本发明属于分析检测技术领域，公开了采用正向电压下利用微乳毛细管电动色谱法与大体积进样非匀强电场扫集联用在线富集测定糖皮质激素的技术。

背景技术：

糖皮质激素(glucocorticoids)是一类由肾上腺皮质分泌的甾类激素，是肾上腺皮质激素类药物，具有重要的生理活性，如抗炎及抗过敏，降低毛细血管壁和细胞膜的通透性，减少炎性渗出等作用。某些商家为了谋取利益在一些化妆品中加入糖皮质激素可以起到美白保湿的效果。但长期使用含有糖皮质激素的化妆品会产生面部毛囊萎缩、毛细血管扩张等副作用，对人体面部皮肤造成严重损害。因此建立化妆品中糖皮质激素的经济、快速和高灵敏度的检测方法对于化妆品的质量控制，确保化妆品的使用安全具有重要意义。糖皮质激素的测定主要方法有高效液相色谱法、固相萃取-液相色谱法、液相色谱-质谱法和毛细管电泳法等。其中高效液相色谱是最常用的方法，但是该方法需要比较复杂的样品预处理过程去除基质，且液相色谱仪及液相色谱柱价格昂贵，仪器的运行成本也比较高。毛细管电泳法检测糖皮质激素，例如中国专利公开号cn102778494，公开日2012年11月14日，发明创造的名称为一种分离测定护肤类化妆品中6种皮质激素的方法，该申请案公开了了一种分离测定护肤类化妆品中6种激素的方法。以离子液体和β-环糊精为添加剂的反向微乳毛细管电泳法(meekc)分离测定化妆品中丙酸氟替卡松、曲安奈德、醋酸可的松、地塞米松、氢化可的松和泼尼松6种激素的方法。其不足之处是，该方法灵敏度较低不适合痕量糖皮质激素的检测。因而有必要建立一种简单、快速、灵敏度高且成本低的检测方法。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明提供了一种采用正向电压下利用微乳毛细管电动色谱法与大体积进样非匀强电场扫集联用在线富集测定糖皮质激素(泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松)的技术。该技术耗样量少，经济快速，具有更高的灵敏度和更好的分离度等优点。

本发明的目的通过下列的技术方案实现：高效毛细管电泳仪的毛细管中先充满含有微乳粒子的背景缓冲液，然后从入口端以压力进样的方式引入一段样品溶液，并施加正电压，从而实现样品中泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松的在线富集。方案中最佳背景缓冲液的配制：利用30mmol/l硼酸-硼砂缓冲液(ph＝8.2)为母液，配制sds的质量比2.4％(w/w)，正辛烷的质量比0.6％(w/w)，正丁醇的质量比6.6％(w/w)的背景缓冲液。超声20min即得最佳背景缓冲液。将激素的混合标准溶液溶入样品基质中构成试液；最佳样品基质溶液：60mmol/l磷酸二氢钠溶液，用0.1mmol/l氢氧化钠和磷酸调节ph为3.6。具体样品测定时，样品经甲醇提取后，将提取液溶解于样品基质中。压力进样的进样压力为12.3kpa，进样时间为95s；毛细管两端插入背景缓冲液中并施加正电压，分离电压为9.6kv。

附图说明

图1为标准品混合液的微乳毛细管电动色谱图1为泼尼松，2为氢化可的松，3为泼尼松龙，4为倍他米松

图2为标准品的混合液的毛细管电动色谱法的大体积进样——非匀强电场扫集色谱图1为泼尼松，2为氢化可的松，3为泼尼松龙，4为倍他米松

具体实施方式

实施例1：

(1)仪器：th-3100高效毛细管电泳仪；采用未涂层石英毛细管(总长度为65cm，有效长度50cm，柱内径50um)为分离通道。

(2)激素标准溶液的配制：准确称取泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松各20.0mg置于10.00ml容量瓶中，加甲醇超声溶解后，冷却至室温，再加甲醇稀释至刻度，摇匀后即得。避光4℃保存。制成待测标准品混合液，使用时根据需要稀释成不同浓度的标准液。

(3)背景缓冲液的配制：利用30mmol/l硼酸-硼砂缓冲液(ph＝8.2)为母液，配制sds的质量比2.4％(w/w)，正辛烷的质量比0.6％(w/w)，正丁醇的质量比6.6％(w/w)的背景缓冲液。超声20min即得最佳背景缓冲液。

(4)样品溶液制备：准确称取化妆品样品1.0g于50ml离心管内，向其中加入15ml甲醇，充分振荡5min，超声20min，再加入10ml正己烷，振荡10min，在8000r/min离心8min，弃去上层正己烷层；再加入10ml正己烷重复上述操作，下层甲醇溶液在45℃下，减压浓缩至约1ml。以样品基质溶液定容至10ml，即得样品溶液。

(5)色谱条件：以步骤3中微乳液为运行缓冲液，采用压力进样，进样压力12.3kpa，进样时间95s，运行温度20℃，检测波长为230nm。

(6)富集倍数：泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松的在线富集倍数分别可以达到853、893、933和925倍。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种糖皮质激素微乳毛细管电动色谱法的大体积进样一非匀强电场扫集在线富集技术，采用正向电压下利用微乳毛细管电动色谱法(MEEKC)与大体积进样(LVSI)非匀强电场扫集(REFS)联用在线富集测定糖皮质激素(泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松)，高效毛细管电泳仪的毛细管中先充满含有微乳粒子的背景缓冲液，然后从入口端以压力进样的方式引入一段样品溶液，并施加正电压，从而实现样品中泼尼松，氢化可的松，泼尼松龙，倍他米松的在线富集。本发明比常规的MEEKC分离测定方法具有更高的灵敏度和更好的分离度。实验结果显示该方法耗样量少，方法经济快速，实现了痕量糖皮质激素的毛细管电泳测定。

技术研发人员：商少明;郭成方;沈洁;许虎君;陈秀英;高海燕;顾丹
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2015.12.28
技术公布日：2017.07.04