一种桉树染色体的压片方法与流程

本发明属于植物鉴定技术领域，特别涉及一种桉树染色体的压片方法。

背景技术：
染色体是遗传物质在肉眼可见层面的载体和物质基础，染色体的数目、形态是物种显著的遗传性特征，可用于鉴别或辅助性鉴别物种，物种间的亲缘关系和物种的变异程度。掌握染色体压片技术，进行染色体的数量和形态观察是一项基本的和基础性的细胞生物学研究技术和手段，这种技术在物种鉴定和鉴别、物种间亲缘关系确定、物种倍性鉴定和杂交育种等研究中有广泛的应用。桉树是桃金娘科(Mytraceae)杯果木属(Angophora)、伞房属(Corymbia)和桉属(Eucalyptus)树种的统称。桉树是一种外来树种，是我国南方重要的人工林造林树种，现今对其研究主要集中在引种栽培与木材加工、遗传改良、遗传图谱构建和分子标记辅助育种，高效栽培及生态效应相关研究，对其细胞层面的研究很少。国外曾有人做过不同种桉树染色体的观察研究，但存在稳定性差，成功率低的不足；因此，有时需要大量制样，才能获得清晰可见的染色体核型分析图像；因秋水仙素价格昂贵，导致压片成本较高。桉树染色体压片技术在国内只有零星的研究，从研究报道看，仍没有掌握成熟、稳定和高质量的染色体压片技术。如果在国内能够开发出桉树成熟、稳定的染色体压片技术，则可为开展桉树种间鉴别、倍性鉴定和种间亲缘关系确定提供必要的技术支持。该压片技术另外一个有价值的研发方向是在不降低压片质量的前提下，寻找到比秋水仙素毒性和价格更低的替代品。

技术实现要素：
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种桉树染色体的压片方法。本发明的目的是通过下述方案实现：一种桉树染色体的压片方法，包括以下具体步骤：(1)取材：取尾巨桉无性系(Eucalyptusurophylla×Eucalyptusgrandis)DH32-29的二倍体或四倍体组培生根苗生根5～10天的根尖，距最尖端处0.5cm以内部分；(2)预处理：将所取的根尖用蒸馏水清洗干净，放入0.002～0.02g/L的胺磺灵中浸泡处理3h～7h；(3)固定：将预处理后的根尖用蒸馏水清洗干净，放入卡诺氏固定液中于4℃条件下固定24h；(4)解离：从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，放入37℃的混合酶液中解离30～40min；(5)染色和压片：将解离后的根尖用蒸馏水漂洗后，置于载玻片上，用刀片把根冠及延长区部分切去，滴1滴卡宝品红染色液，染色10min，然后，盖上盖玻片，然后用橡皮擦轻轻敲打盖玻片，用吸水纸把多余的染色液吸干；(6)镜检：将压片置于显微镜下观察，选择染色体分散、充分收缩，呈棒状，清晰且处于有丝分裂中期分裂相的细胞进行计数和拍照。优选的，步骤(2)中所述的胺磺灵的浓度为0.01g/L，所述的浸泡处理的时间为4h。步骤(1)中所述的取材的时间为8～18点。优选的，步骤(1)中所述的取材的时间为上午8～10点。更优选的，步骤(1)中所述的取材的时间为上午9点。步骤(4)中所述的混合酶液是指体积比为1：1的10g/L纤维素酶和10g/L果胶酶的混合液。优选的，步骤(4)中所述的解离指解离35min。本发明的机理为：在本发明中，预处理的目的是在固定时累积更多的分裂中期相细胞，从而提高压片的成功率，提升压片效果，获得尽可能高比例的分裂中期相细胞。秋水仙素处理时，在阻断细胞有丝分裂进程，获得分裂中期相细胞时，因所需浓度较高，使秋水仙素对细胞产生了较大的毒害作用，导致积累的分裂中期相细胞数减少，染色体压片成功的比例减小，稳定性降低。而胺磺灵预处理时的所需浓度，约为秋水仙素的10％，其在阻断细胞有丝分裂时，对细胞毒害作用明显减轻，细胞可进行正常有丝分裂，从而，在固定时，累积的分裂中期相细胞数多，染色体压片成功的比例增加，稳定性提高。固定的目的是迅速杀死生活细胞，稳定预处理的效果；酸解的目的是软化细胞壁和降解细胞质，以便于染色体的分散和展平；染色的目的是特异性的使染色体(或染色质)着色，便于在显微镜下观察和呈现染色体图像。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)使用胺磺灵可提高压片的稳定性和成功率，获得更高比例的染色体分裂中期图像；(2)秋水仙素价格为600～1000元/g，而本研究所用的胺磺灵价格非常便宜，是秋水仙素价格的2％左右，可大大减少实验成本；(3)秋水仙素毒性远大于胺磺灵，因此，使用胺磺灵替代秋水仙素后，在压片过程中，可减少对环境的污染，显著减少对人产生毒害的程度和风险。附图说明图1为实施例1中的染色体观察图。图2为实施例2中的染色体观察图。图3为实施例3中的染色体观察图。图4为实施例3～4中不同倍性细胞的染色体效果图。图5为实施例3和对比实施例1中采用不同预处理剂处理时获得的分裂中期相细胞比例对比图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用的尾巨桉无性系DH32-29的二倍体组培生根苗(该种苗为国家级林木良种，良种登记编号为：国S-SC-EU-001-2011)，购自于广西壮族自治区国有东门林场，所使用的尾巨桉无性系DH32-29的四倍体组培生根苗由尾巨桉无性系DH32-29的二倍体组培生根苗诱导得到。纤维素酶和果胶酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。所用的其它试剂均可从市场常规购得。实施例1取尾巨桉无性系DH32-29的二倍体组培生根苗的根尖，放入0.01g/L的胺磺灵中浸泡处理4h，然后将浸泡后的根尖用蒸馏水洗涤，放入卡诺氏固定液中于4℃条件下固定24h，从固定液中取出根尖，用蒸馏水漂洗，放入37℃的体积比为1：1的10g/L纤维素酶和10g/L果胶酶的混合液中解离30min，取出根尖，用蒸馏水洗净，置于干净的载玻片上，用刀片把根冠及延长区部分切去，滴1滴卡宝品红染色液，染色10min，盖上盖玻片，用橡皮擦轻轻敲打盖玻片，用吸水纸把多余的染色液吸干，然后将压片置于显微镜下观察。染色体观察图如图1所示。实施例2将实施例1中的酶解时间由30min增加到40min，其余操作均与实施例1相同。染色体观察图如图2所示。实施例3将实施例1中的酶解时间由30min增加为35min，其余操作均与实施例1相同。所得的染色体观察图如图3所示。从图1～3中可以看出，当酶解30min时(如图1)，酶解不足，染色体仍然束缚在细胞核内，未分散；当酶解40min时(如图2)，解离过度，不仅细胞膜被分解，染色体也被分解，较难观察到成形的染色体。只有当解离时间适宜，才能获得理想的解离效果。因此，从操作的便利及成本考虑，以纤维素酶和果胶酶混合溶液于37℃恒温解离35min为佳(如图3)。实施例4将实施例3中的尾巨桉无性系DH32-29生根小苗二倍体替换为尾巨桉无性系DH32-29生根小苗四倍体，其余条件均与实施例3相同。图4为实施例3～4中不同倍性细胞的染色体效果图，即使是4倍体，有44条染色体时，仍能实现染色体充分的收缩和分布上的分散，能够使用染色体核型分析软件进行计数和核型分析，这也验证了本研究摸索出的方法的可靠性和成熟性。对比实施例1将实施例3中的预处理剂由0.01g/L的胺磺灵换成0.1g/L的秋水仙素，其余条件均与实施例3相同。图5为实施例3和对比实施例1中采用不同预处理剂时获得的分裂中期相细胞比例对比图，当采用秋水仙素为预处理剂时，可获得10％～20％的达到要求的分裂中期相细胞，而在本发明中，采用胺磺灵作为预处理剂，可获得15％～30％的达到要求的分裂中期相细胞，与秋水仙素作为预处理剂相比，成功率显著提高。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。