一种桉树遗传转化与再生方法
【专利摘要】本发明公开了一种桉树的遗传转化与再生方法。首先制备携带外源基因的侵染农杆菌；然后准备桉树萌芽桩作为外植体；接着桉树萌芽桩与携带外源基因的农杆菌共培养进行遗传转化与再生；最后将生成的萌芽条经选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。本发明以桉树幼苗的萌芽桩为外植体，与携带外源基因的农杆菌共培养转化，生长出来的萌芽条在生根培养基中进行筛选培养，生根后移栽得到拟转化植株。采用本发明的方法对桉树进行转基因，50天左右即可获得阳性转化植株。具有具有周期短、操作简单、成本低、适用性广泛等特点，为桉树分子育种和批量转基因生产提供了一种快速的转基因方法，加快了桉树新品培育的进程。
【专利说明】一种桉树遗传转化与再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物的遗传转化与再生方法，特别涉及一种桉树的遗传转化与再生方 法。
【背景技术】
[0002] 桉树起源于澳大利亚及附近岛ill与，是桃金娘科（Myrtaceae)桉树属（Eucalyptus) 的总称，现有800多个种，137个亚种，是一种集观赏、用材、纸浆原料、药用于一体的优良树 种。由于桉树具有种类多、生长快、耐瘠薄、干形好、用途广等特点，在热带和亚热带地区有 广泛的栽培，目前桉树人工林面积已超过世界人工林面积的五分之一。随着社会经济的发 展，木材的供需矛盾与日俱增，纸浆需求量也逐渐加大，木材供应出现巨大缺口。因此，发展 替代天然林实木材的优质速生丰产桉树人工林显得十分紧迫。但因病虫害、冻害、人工成本 高、树种间性状差异大等问题，严重影响了桉树人工林的进一步发展，解决这些问题根本而 且有效的途径是选育良种。由于林木生长周期长，遗传杂和性高，许多性状属于多基因控制 的数量性状，常规的育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。基因工程技术具有高 效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，加速优质、高抗桉树新品种的选育进程。
[0003] 除种质转化法等少数转化方法外，其它所有植物转基因方法都需要建立一个有效 的再生体系。不同的转化方法根据操作对象不同需要建立相对应的再生体系，如根癌农 杆菌介导法要求通过愈伤组织或原生质体或体细胞胚形成再生植株；而基因枪法则对操 作对象要求较低，根、莖、叶、培养细胞愈伤组织、种子等都可以作为外植体；而化学法、电 穿孔法以及脂质体包裹法需要的是原生质体。在桉树中，主要是通过愈伤组织再生、体胚 再生、原生质体再生等再生体系进行转基因研究。1991年Teulieres C等首次在网尼桉 (E.gunnii)原生质体上转化报告基因。陈振荣等利用巨尾桉的叶片为材料进行转基因研 究，发现MS培养基添加 lmg/L kinetin及10mg/L IBA可以诱导愈伤组织的形成，MS培养基 添加 IBA或NAA时可以诱导根的形成，并初步利用含有40mg/L Kan的培养基，筛选到了含有 NPT (neomycin phosphotransferase)和 GUS(i3-glucuronidase)基因的植株，转化率高达 31.3%。张景宁报道，柞蚕抗菌肽对桉树青枯假单胞菌有杀灭作用。邵志芳等以尾叶桉叶 盘为材料，在根瘤农杆菌的介导下将柞蚕抗菌肽D基因转入了尾叶桉，并进一步通过诱导 和筛选，获得了阳性植株，对青枯病具有较强的抵抗性。曾富华等利用尾叶桉无菌苗下胚轴 为外植体进行遗传转化和再生，获得了含有外源基因的桉树转基因植株。Kazuaki等在农杆 菌的介导进行遗传转化，将紫苏的柠檬烯合成酶基因转入到桉树幼苗的下胚轴中，经过一 系列的组织培养和筛选后，获得了含有目的基因的植株，其柠檬烯含量比野生型桉树高出 16?35倍。Bloksberg等人从福射松（Pinus radiata)中分离出了木质素合成途径中的 0ΜΤ和CCR基因，通过农杆菌的介导转入到桉树的植株中。2007年赖家业等人在建立的尾 巨桉（E. urophyllaXE. grandis)无性系高频再生体系的基础上，利用⑶S染色组织分析法 探讨了各因素对尾巨桉茎段遗传转化的影响，转化率最高也只有26%。到目前为止，科研人 员先后进行了朽 1 檬桉（E. citriodora)、蓝桉（E. globulus)、赤桉（E. camaldulensis)、巨桉 (E.grandis)、小套按（E. microtheca)、黄皮按（E.ochrophloia)及边缘按（E.marginata) 等的遗传转化的初步研究。现已获得转基因桉树的有蓝桉、赤桉和巨桉。Harcourt用农杆 菌介导将抗除草剂和抗虫基因转入桉树，获得了多重抗性的转化植株。
[0004] 桉树萌芽条是桉树米伐后的木桩萌发出的枝条。桉树主干被砍伐后，主干中的形 成层细胞和射线细胞继续保持分裂，在根部充足营养成分和激素的供给下逐渐形成芽原 基，进而发育成不定芽，并最终长出萌芽条。桉树萌芽条由于具有分生能力强，生长迅速， 并且能够稳定遗传母树的优良特性等优点，常常作为桉树组织培养的首先原材料被广泛使 用。综上所述，国内外以多种桉树的不同部位为材料进行了遗传转化，并获得了相关的转基 因植株，但是现有的桉树遗传转化技术具有周期长、工作量大、适用范围窄、转化效率低等 缺点，尚未见用桉树萌芽桩为外植体进行遗传转化并获得成功的例子。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种桉树遗传转化与再生的方法，利用桉树萌芽桩的生长特性作为 外植体进行遗传转化和再生，达到加快桉树分子育种进程和批量生产转基因植株的目的。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案如下：
[0007] -种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于包括如下步骤：1)制备携带外源基 因的侵染农杆菌；2)准备桉树萌芽桩作为外植体；3)桉树萌芽桩与携带外源基因的农杆 菌共培养进行遗传转化与再生；4)生成的萌芽条经选择性生根培养及移栽，得到拟转化植 株。
[0008] 具体地，所述携带外源基因的侵染农杆菌的制备按照如下方法：转化前2天将含 有重组质粒的农杆菌接入5ml YEB液体培养基中28°C培养24h ;转化前一天将菌液扩大至 100ml培养基中培养12h ;当农杆菌液0D600达到1. 2?1. 6时，4500rpm离心15min收集 菌液，弃上清；将农杆菌沉淀悬浮于渗透培养基中，使0D600在0. 8左右。
[0009] 具体地，所述渗透培养基为将 MS0. 25g、sucrose5. 2g、MES0. 06g、6-BA2 μ g、 silwet-760120y 1，加蒸馏水至100ml混合而成，调整pH值到5.6。
[0010] 具体地，所述桉树萌芽桩按照如下方法准备：选取4个月生的桉树幼苗，在其距离 土壤高度3cm?10cm处喷施70%乙醇，灭菌lmin ;用无菌水冲洗2次，并用无菌滤纸吸干 水分；用无菌剪刀在幼苗距基部4?6cm处去除幼苗植株主干部分；用无菌针在萌芽桩周 围扎4?6个0. 5cm深的小孔。
[0011] 具体地，所述桉树萌芽桩与携带外源基因的农杆菌共培养进行遗传转化与再生具 体按照如下方法进行：将桉树萌芽桩倒置于含有农杆菌的渗透培养基中，并于20kPa的真 空条件下侵染5min，然后用保鲜膜将侵染后的植株包好，外面用锡箔纸包好避光，并移栽入 花盆中，放置于暗处培养24h后除去锡箔纸和保鲜膜，正常培养2周左右后萌芽条长出。
[0012] 具体地，所述选择性生根培养是在萌芽条长出后转入选择性生根培养基中培养， 以诱导其生根，直至根长出；所述移栽是指将生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至轻 型基质，在室外自然环境中炼苗10?15天，得到完整的桉树植株。
[0013] 具体地，所述诱导生根是待萌芽条生长约8?12cm并有6?10个节时，用无菌刀 从基部剪下萌芽条后，用无菌水将萌芽条浸泡5min，5%次氯酸钠处理15min，中间不停振 荡，最后用无菌水洗漆5次。
[0014] 具体地，所述选择性生根培养基为将1/2MS2. 3g、IBAO. 5mg/L、Kan50mg/L、蔗糖 30g/L、琼脂7g/L，加蒸馏水至1000ml混合而成，调整pH值为5.6?5 8;所述轻型基质是由 松树皮、甘蔗渣、黄心土以及珍珠岩按照5:2:2:4的比例混合而成。
[0015] 本发明的有益效果在于：以桉树幼苗的萌芽桩为外植体，与携带外源基因的农杆 菌共培养转化，生长出来的萌芽条在生根培养基中进行筛选培养，生根后移栽得到拟转化 植株。采用本方法对桉树进行转基因，50天左右即可获得阳性转化植株。本发明所提供的 桉树遗传转化方法具有具有周期短、操作简单、成本低、适用性广泛等特点，为桉树分子育 种和批量转基因生产提供了一种快速的转基因方法，加快了桉树新品培育的进程，对定向 培育桉树新品种，以及推动我国林业的可持续发展具有重要的意义。
【具体实施方式】
[0016] 下面再结合具体实施例对本发明作进一步的说明。在具体实施例中采用EC FAD 基因构建重组质粒进行农杆菌介导来验证本发明所提供的桉树遗传转化与再生方法的有 效性，EC FAD基因是来自赤桉中的脂肪酸脱饱和酶（Fatty Acid Desaturase，FAD)基因， 是饱和脂肪酸（C16:0，C18:0)向多不饱和脂肪酸（C18:2，C18:3)转化的重要调控基因。在 实施例中使用上述基因构建重组质粒但并不表示本发明所述桉树遗传转化与再生方法的 应用仅仅限于应用在上述EC FAD基因，应该理解为本发明的方法可以用于各种对桉树的转 基因作业。在实施例中我们是采用赤桉作为对象的，应该理解为本发明适用于所有可以使 用该方法进行遗传转化与再生的桉树品种。
[0017] A、侵染农杆菌的制备，具体步骤如下：
[0018] 步骤1、转化前2天将含有pBI121-EC FAD重组质粒的农杆菌接入5ml YEB液体培 养基（Kan50mg/L)中 28°C 培养 24h。
[0019] 步骤2、转化前一天将菌液扩大至100ml培养基（1:100)中培养12h。
[0020] 步骤3、当农杆菌液0D600达到1. 2?1. 6时，4500rpm离心15min收集菌液，弃上 清。
[0021] 步骤4、将农杆菌沉淀悬浮于渗透培养基（将MSO. 25g，sucrose5. 20g，MESO. 06g， 6-BA2yg，silwet-760120y 1，加蒸馏水至 100ml，调整 pH 值到 5. 6)中，使 0D600 在 0. 8 左 右，待用。
[0022] B、本发明以4个月生的桉树幼苗为材料，获得了萌芽桩，具体步骤如下：
[0023] 步骤1、对幼苗距离土壤高度5cm?10cm处喷施70%乙醇，灭菌lmin。
[0024] 步骤2、用无菌水冲洗2次，并用无菌滤纸吸干水分。
[0025] 步骤3、用酒精灯对剪刀灼烧2min后，冷却至室温，在幼苗5cm左右处去除幼苗植 株主干部分。
[0026] 步骤4、用酒精灯对钢针灼烧2min后，冷却至室温，在萌芽桩周围扎4?6个0. 5cm 深的小孔。
[0027] C、重组农杆菌对萌芽桩的转化，具体步骤如下：
[0028] 步骤1、将经上一步处理的萌芽桩倒置于A步骤获得的含有农杆菌的渗透培养基 中，并于20kPa的真空条件下侵染5min。
[0029] 步骤2、用保鲜膜将侵染后的萌芽桩包好，外面用锡箔纸包好避光，并移栽入花盆 中（蛭石+轻型基质）。
[0030] 步骤3、放置于暗处培养24h后除去锡箔纸和保鲜膜，正常培养2周左右后，便会有 萌芽条长出，一般会长出3?5个萌芽条。
[0031] D、萌芽条的诱导生根，具体步骤如下：
[0032] 步骤1、待萌芽条生长约8?12cm并有6 - 10个节时适宜诱导生根。
[0033] 步骤2、用酒精灯对剪刀灼烧2min后，冷却至室温，从基部剪掉萌芽条。
[0034] 步骤3、用无菌水将萌芽条浸泡5min，5%次氯酸钠处理15min，中间不停振荡，最 后用无菌水洗涤5次。
[0035] 步骤4、将灭菌后的萌芽条转入选择性生根培养（1/2MS2. 3g、IBAO. 5mg/L、 Kan50mg/L、鹿糖30g/L、琼脂7g/L，加蒸馈水至1000ml混合而成，调整pH值为5.6-5.8 )。
[0036] E、生根萌芽条的移栽，具体步骤如下：
[0037] 步骤1、将松树皮、甘蔗渣、黄心土以及珍珠岩按照5:2:2:4的比例配制轻型基质。
[0038] 步骤2、将生根良好的萌芽条移入轻型基质，在室外自然环境中炼苗10?15天，得 到完整的转基因植株。
[0039] 通过上述步骤，在温室对20株萌芽桩进行了转基因，均有3?5枝萌芽条长出，经 过筛选生根和移栽后，共获得6个萌芽桩来源的14个植株。
[0040] F、转基因植株的PCR鉴定结果：对上述实施例得到的转基因植株经过PCR鉴定，发 现有5个萌芽桩来源的11个植株中含有CaMV35S基因。实验步骤如下：
[0041] 步骤1、分别剪切野生型和14个转基因桉树幼苗植株的叶片。
[0042] 步骤2、用液氮将各个样品的叶片磨成粉末。
[0043] 步骤3、按照DNA提取试剂盒的操作方法，提取纯化各个样品的DNA，并置于_20°C 冰箱保存。
[0044] 步骤4、根据CaMV35基因，序列如SEQ ID N01所示，设计并合成引物Ca-Fl (上游） 和Ca-Rl (下游），序列分别如SEQ ID N02和SEQ ID N03所示。
[0045] 步骤5、分别以各个样品的DNA以及pBI121-EC FAD质粒为模板，SEQ ID N02和 SEQ ID N03为引物对，用rTaq聚合酶进行PCR扩增后，将产物进行电泳检测。
[0046] G、转基因植株脂肪酸成分的分析：取上述实施例得到的转基因植株和野生型赤 桉植株进行GC-MS解析，转基因植株的脂肪酸含量发生了变化，棕榈酸（16:0)和硬脂酸 (18:0)等饱和脂肪酸的含量有所降低，亚油酸（18:2)和亚麻酸（18:3)等不饱和脂肪酸明 显增加。
[0047] 步骤1、分别剪切野生型和1号转基因桉树幼苗植株的叶片。
[0048] 步骤2、用液氮将各个样品的叶片磨成粉末。
[0049] 步骤3、将粉末转移至10ml离心管中，加入含有25% (v/v)H2S04的甲醇混合液 lml，混勻后，80°C水浴中加热90min。
[0050] 步骤4、加入15ml的0. 9% NaCl溶液和1ml的正己烷，涡旋混匀，5000rpm离心 5min〇
[0051] 步骤5、吸取上层有机相lul，用安捷伦GC-MS7890型气相色谱-质谱联用仪对野 生型和采用本发明方法培育的转基因型桉树幼苗叶片内的棕榈酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻
【权利要求】
1. 一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于包括如下步骤：1)制备携带外源基因 的侵染农杆菌；2)准备桉树萌芽桩作为外植体；3)桉树萌芽桩与携带外源基因的农杆菌共 培养进行遗传转化与再生；4)生成的萌芽条经选择性生根培养及移栽，得到拟转化植株。
2. 根据权利要求1所述的一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于所述携带外 源基因的侵染农杆菌的制备按照如下方法：转化前2天将含有重组质粒的农杆菌接入5ml YEB液体培养基中28°C培养24h ;转化前一天将菌液扩大至100ml培养基中培养12h ;当农 杆菌液OD600达到1. 2?1. 6时，4500rpm离心15min收集菌液，弃上清；将农杆菌沉淀悬 浮于渗透培养基中，使OD600在0. 8左右。
3. 根据权利要求2所述的一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于所述渗透培养 基为将 MSO. 25g、sucrose5. 2g、MES0. 06g、6-BA2y g、silwet-760120y 1，加蒸馏水至 100ml 混合而成，调整pH值到5. 6。
4. 根据权利要求1所述的一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于所述桉树萌 芽桩按照如下方法准备：选取4个月生的桉树幼苗，在其距离土壤高度3cm?10cm处喷施 70%乙醇，灭菌lmin ;用无菌水冲洗2次，并用无菌滤纸吸干水分；用无菌剪刀在幼苗距基 部4?6cm处去除幼苗植株主干部分；用无菌针在萌芽桩周围扎4?6个0. 5cm深的小孔。
5. 根据权利要求1所述一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于所述桉树萌芽桩 与携带外源基因的农杆菌共培养进行遗传转化与再生具体按照如下方法进行：将桉树萌芽 桩倒置于含有农杆菌的渗透培养基中，并于20kPa的真空条件下侵染5min，然后用保鲜膜 将侵染后的植株包好，外面用锡箔纸包好避光，并移栽入花盆中，放置于暗处培养24h后除 去锡箔纸和保鲜膜，正常培养2周左右后萌芽条长出。
6. 根据权利要求1所述一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于，所述选择性生 根培养是在萌芽条长出后转入选择性生根培养基中培养，以诱导其生根，直至根长出；所 述移栽是指将生根良好的生根苗从恒温光照培养箱移至轻型基质，在室外自然环境中炼苗 丨0?丨5天，得到完整的桉树植株。
7. 根据权利要求6所述一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于，所述诱导生根 是待萌芽条生长约8?12cm并有6?10个节时，用无菌刀从基部剪下萌芽条后，用无菌水将 萌芽条浸泡δη?η,δ%次氯酸钠处理15min，中间不停振荡，最后用无菌水洗漆5次。
8. 根据权利要求6所述一种桉树遗传转化与再生的方法，其特征在于，所述选择性 生根培养基为将1/2MS2. 3g、IBAO. 5mg/L、Kan50mg/L、蔗糖30g/L、琼脂7g/L，加蒸馏水至 1000ml混合而成，调整pH值为5.6?5.8;所述轻型基质是由松树皮、甘蔗渣、黄心土以及珍 珠岩按照5:2:2:4的比例混合而成。
【文档编号】C12N15/84GK104120145SQ201410310571
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】陈鸿鹏, 谢耀坚 申请人:国家林业局桉树研究开发中心